PhaESC hatlarının türeyen dr. Giulio Di Minin'e ve akış sitometrisi operasyonu için Dr. Remo Freimann'a teşekkür ederiz. Ayrıca Bayan Michèle Schaffner ve Bay Thomas M. Hennek'i embriyo transferi konusunda teknik destek için kabul ediyoruz. Bu çalışma İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (grant 31003A_152814/1) tarafından desteklendi.

<ol>
	<li>Ellegren, H., Galtier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+genetic+diversity.">Determinants of genetic diversity.</a> Nature Reviews: Genetics. 17 (7), 422-433 (2016).</li><li>Huijbers, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+genetically+modified+mice:+A+decision+guide.">Generating genetically modified mice: A decision guide.</a> Methods in Molecular Biology. 1642, 1-19 (2017).</li><li>Aizawa, E., Dumeau, C. E., Freimann, R., Di Minin, G., Wutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidy+of+semi-cloned+embryos+generated+from+parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells.">Polyploidy of semi-cloned embryos generated from parthenogenetic haploid embryonic stem cells.</a> PloS One. 15 (9), 0233072 (2020).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgenetic+haploid+embryonic+stem+cells+produce+live+transgenic+mice.">Androgenetic haploid embryonic stem cells produce live transgenic mice.</a> Nature. 490 (7420), 407-411 (2012).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+of+fertile+bimaternal+offspring+following+intracytoplasmic+injection+of+parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells.">Birth of fertile bimaternal offspring following intracytoplasmic injection of parthenogenetic haploid embryonic stem cells.</a> Cell Research. 26 (1), 135-138 (2016).</li><li>Wan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells+produce+fertile+mice.">Parthenogenetic haploid embryonic stem cells produce fertile mice.</a> Cell Research. 23 (11), 1330-1333 (2013).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+genetically+modified+mice+by+oocyte+injection+of+androgenetic+haploid+embryonic+stem+cells.">Generation of genetically modified mice by oocyte injection of androgenetic haploid embryonic stem cells.</a> Cell. 149 (3), 605-617 (2012).</li><li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells+efficiently+support+mouse+generation+by+oocyte+injection.">Parthenogenetic haploid embryonic stem cells efficiently support mouse generation by oocyte injection.</a> Cell Research. 26 (1), 131-134 (2016).</li><li>Elling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+and+reverse+genetics+through+derivation+of+haploid+mouse+embryonic+stem+cells.">Forward and reverse genetics through derivation of haploid mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (6), 563-574 (2011).</li><li>Leeb, M., Wutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+haploid+embryonic+stem+cells+from+mouse+embryos.">Derivation of haploid embryonic stem cells from mouse embryos.</a> Nature. 479 (7371), 131-134 (2011).</li><li>Surani, M. A., Barton, S. C., Norris, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+reconstituted+mouse+eggs+suggests+imprinting+of+the+genome+during+gametogenesis.">Development of reconstituted mouse eggs suggests imprinting of the genome during gametogenesis.</a> Nature. 308 (5959), 548-550 (1984).</li><li>Li, Z. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+bimaternal+and+bipaternal+mice+from+hypomethylated+haploid+ESCs+with+imprinting+region+deletions.">Generation of bimaternal and bipaternal mice from hypomethylated haploid ESCs with imprinting region deletions.</a> Cell Stem Cell. 23 (5), 665-676 (2018).</li><li>Elling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+maintenance+of+mouse+haploid+embryonic+stem+cells.">Derivation and maintenance of mouse haploid embryonic stem cells.</a> Nature Protocols. 14 (7), 1991-2014 (2019).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Shuai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mammalian+offspring+by+haploid+embryonic+stem+cells+microinjection.">Generation of mammalian offspring by haploid embryonic stem cells microinjection.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 31, 1-15 (2014).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).</li><li>O'Neill, G. T., Rolfe, L. R., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+potential+and+chromosome+constitution+of+strontium-induced+mouse+parthenogenones.">Developmental potential and chromosome constitution of strontium-induced mouse parthenogenones.</a> Molecular Reproduction and Development. 30 (3), 214-219 (1991).</li><li>Campbell, K. H., McWhir, J., Ritchie, W. A., Wilmut, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sheep+cloned+by+nuclear+transfer+from+a+cultured+cell+line.">Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line.</a> Nature. 380 (6569), 64-66 (1996).</li><li>Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-term+development+of+mice+from+enucleated+oocytes+injected+with+cumulus+cell+nuclei.">Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei.</a> Nature. 394 (6691), 369-374 (1998).</li><li>Wilmut, I., Schnieke, A. E., McWhir, J., Kind, A. J., Campbell, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viable+offspring+derived+from+fetal+and+adult+mammalian+cells.">Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells.</a> Nature. 385 (6619), 810-813 (1997).</li><li>Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+frogs+derived+from+the+nuclei+of+single+somatic+cells.">Adult frogs derived from the nuclei of single somatic cells.</a> Developmental Biology. 4, 256-273 (1962).</li><li>Campbell, K. H., Alberio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+the+genome:+role+of+the+cell+cycle.">Reprogramming the genome: role of the cell cycle.</a> Reproduction Supplement. 61, 477-494 (2003).</li><li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-mediated+genetic+screening+in+mice+with+haploid+embryonic+stem+cells+carrying+a+guide+RNA+library.">CRISPR-Cas9-mediated genetic screening in mice with haploid embryonic stem cells carrying a guide RNA library.</a> Cell Stem Cell. 17 (2), 221-232 (2015).</li><li>Bai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genetic+screening+in+mice+through+haploid+embryonic+stem+cells+identifies+critical+genes+in+bone+development.">Targeted genetic screening in mice through haploid embryonic stem cells identifies critical genes in bone development.</a> PLoS Biology. 17 (7), 3000350 (2019).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-mediated+base-editing+screening+in+mice+identifies+DND1+amino+acids+that+are+critical+for+primordial+germ+cell+development.">CRISPR-Cas9-mediated base-editing screening in mice identifies DND1 amino acids that are critical for primordial germ cell development.</a> Nature Cell Biology. 20 (11), 1315-1325 (2018).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Memelilerin somatik hücre nükleer transferi (SCNT) ile klonlaması 1990'larda19,20,21'deöncü olmuştur. Bu gelişmeler amfibilerde 30 yıl önce yapılan klonlama çalışmalarının ardından22. Önemli gecikme, memelilerde embriyoloji ve genomik baskı zorliğini yansıtır. Memeli SCNT'nin gelişimi, bu protokolde ayrıntılı olarak açıklanan sperm yerine haESC uygulamasının temelidir.
Hücre döngüsü senkronizasyonu SCNT23'ünbaşarısı için önemli bir faktördür. Bu protokolde haESC enjeksiyonu için de durum böyledir. Bir alıcıya donör genomu sokulması, embriyo gelişimini bozacak kromozomal kırılmayı veya aneuploidileri önlemek için hücre döngüsü aşamalarının eşleşmesini gerektirir. Yarı klonlama, iki genom ve bir sitoplastın uyumlu olması gereken ek karmaşıklığa sahiptir. Daha önceki bir rapor, M fazlı tutuklanmış androgenetik hESC'lerin enjeksiyonunun, yarı klonlanmış embriyoların G1 fazlı hESC'lerin oositlere enjeksiyonundan daha iyi gelişimsel oranlar sağladığını göstermiştir7. Bu rapor, yarı klonlama için uygun bir eşitleme noktası olarak M fazı önermektedir. Buna göre, fakihler metatatozda demekolsin ile mitotik olarak tutuklandı ve doğal olarak meiosis II metafazında tutuklanan MII oositlerinin ooplazmına enjekte edildi. Daha da önemlisi, M fazlı arrest, donör ve alıcı hücre döngüleri arasında mükemmel senkronizasyon sağlayan yüksek verimli fare ESC'lerinde elde edilebilir.
Mitoz sırasında, nükleer zar parçalanır ve çoğaltılan kromozomların bağlandığı bir mil oluşur. M fazlı DKO-fadezlerin enjeksiyonundan sonra, kardeş kromatlar sahte bir kutup gövdesine ve zigot7'ye (Şekil 3E) ayrılmıştır. Sonuç olarak, bir DKO-phaESC'den tek bir kromozom kümesi yarı klonlanmış embriyoya katkıda bulunur. DKO-phaESC kromozomlarının kardeş kromatlarının enjeksiyondan sonra doğru bir şekilde ayrıştırılabilmesi önemlidir. Sağlam bir DKO-phaESC'nin plazma zarı, sahte bir kutup gövdesine ayrımı önler. DKO-fazesklerin plazma zarının yırtılmadığı ve embriyoların enjeksiyondan sonra ooplazmada bozulmamış DKO-fakESC'ler sergilediği nadir vakaları gözlemledik (Şekil 3D). Bu nedenle DKO-fazesklerin plazma zarının pipetleme ile çıkarılmasına özen gösterilmelidir. Enjeksiyon sırasında, kromozom ayrım kusurlarına yol açabilecek ve aneuploidiye de neden olabilecek oosit meiotik milinin bozulmasını önlemek eşit derecede önemlidir.
Memelilerde, genomik baskı sperm replasmanı olarak fadezlerin uygulanmasını sınırlar. Partenogenetik hemECC'ler genomik izlerin anne yapılandırmasına sahipken, sperm bir baba yapılandırmasına sahiptir. Bu nedenle, tam süreli yavruların üretimi, sperm replasmanı olarak wildtype faesklerin enjekte edildikten sonra gerçekleşmedi. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, IG- ve H19-DMR'lerin silinmesi faklarda tasarlanmıştır. Maternal Igf2-H19 ve Gtl2-Dlk1 loci'deki baskılı ifadenin değiştirilmesi, aktarılan 2 hücreli embriyolara dayanarak% 5,1'in üzerinde bir frekansa sahip yarı klonlanmış farelerin üretilmesine izin vermek için genomik baskıların yapılandırmasını değiştirmek için yeterlidir. Bu gözlemler, iki baskılı genin hedeflenmesi, fadeslerin genomunun farelerdeki spermlerin yerini alan işlevsel bir baba yapılandırmasına geçtiğini göstermektedir. Bununla birlikte, bu strateji için fadeslerin kalıcı bir genetik modifikasyonu gereklidir. Alternatif bir strateji olarak androgenetik haESC düşünülebilir. Androgenetik hESC'ler sperm genomundan türetilir ve baba izlerine sahiptir. Wildtype androgenetik hESC'lerin, transfer edilen embriyoların% 1.3 ila% 1.9'u arasında bir sıklıkta tam süreli yavrular üretmek için sperm replasmanı olarak katkıda bulunduğuna dair raporlar vardır4,7,24. Tam süreli yavrular ayrıca,transfer edilen 2 hücreli embriyoların% 20.2'si oranında IG ve H19-DMR'lerin silinmesi ile androgenetik hESC'lerin enjekte ederek elde edilmiştir24. Modifiye androgenetik hESC'ler kullanılarak yarı klonlamanın artan verimliliği, künyelerin kültürde kararsız hale gelebilmesinden muhtemeldir. Baskı kusurları kritik DMR'lerin genetik silmeleri ile düzeltilir.
Genetik modifikasyonların doğrudan oosit veya sperm genomlarına sokulmasındaki zorluk göz önüne alındığında, hESC'ler ebeveyn genomlarını ayrı ayrı manipüle etmek için değerli bir araçtır. Sperm yerine HESC'leri kullanmak, fare mikrop hattında genom düzenleme için olağanüstü bir avantaj sağlar. Yeni bir çalışma CRISPR/ Cas9 tabanlı genom düzenlemeyi embriyonik gelişim için kritik olan baskı bölgelerinin karakterizasyonu için HESK'lerin uygulanması ile birleştirdi12. Bu çalışma, Rasgrf1-DMR'nin bimaternal farelerin gelişiminde H19ve IG-DMR'lerle birlikte rolünü ve biipaternal farelerin gelişiminde 7 farklı DMR'nin işlevini analiz etti. Sperm için HESC'lerin ikame edilmesi yöntemi, ilkel mikrop hücresi gelişiminde DND1 proteini içindeki anahtar amino asitleri tanımlamak ve kemik gelişimindeki genleri tanımlamak için genetik tarama yaklaşımlarının temelini oluşturmuştur24,25,26. Embriyonik gelişimdeki temel faktörleri belirlemek için genomik baskı ve genetik tarama üzerine yapılan çalışmalar, HESC'lerin gametik genom olarak uygulanması için önemli yaklaşımlardır.

Memelilerde, gametler genetik bilgileri bir sonraki nesle ileten tek hücrelerdir. Bir oosit ve spermatozonun füzyonu, yetişkin bir hayvana dönüşen bir diploid zigot oluşturur. Gametik genomlardaki mutasyonlar böylece yavrular tarafından kalıtsaldır ve türlerde genetik varyasyonu yönlendirmektedir1. Mikroptaki mutasyonların tanıtılması, gen fonksiyonunun karakterizasyonu ve hastalık modellemesi de dahil olmak üzere çeşitli biyolojik çalışmalar için genetiği değiştirilmiş hayvanlar üretmek için uygulanmıştır. Hem oositler hem de spermatozoa, çoğalma sona eren ölümcül farklılaşmış ve son derece uzmanlaşmış hücrelerdir. Bu nedenle, gametlerin doğrudan modifikasyonu teknik olarak zordur ve özel yaklaşımlar geliştirilmiştir. Genetik değişiklikler, genetiği değiştirilmiş ESC'lerin gelişmekte olan embriyoya entegre oldukları ve germline kolonileştikleri blastosistlere enjekte edilmesiyle fare germline sokulabilir. Ek olarak, CRISPR/ Cas9 sistemi de dahil olmak üzere genom düzenleme yaklaşımlarını kullanan zigotların genetik modifikasyonu yaygın olarak benimsenmiştir2.
Son zamanlarda, bir gametik genom 3 , 4,5,6,7,8yerine haESC'leri uygulayan olağanüstü bir yaklaşımbildirilmiştir. HESC'ler, partenogenetik veya androgenetik haploid blastosistlerin iç hücre kütlesinden elde edilen kök hücre hatlarıdır ve tek bir kromozom kümesine sahiptir4,7,9,10. Hem partenogenetik hem de androgenetik hemECC'lerin oositlere intrasitoplazmik enjeksiyondan sonra yarı klonlanmış farelerin genomuna katkıda bulunabileceği gösterilmiştir. Diğer yaklaşımların aksine, hemAC'lerin genomları, kendi kendini yenileme kapasiteleri nedeniyle kültürde doğrudan değiştirilebilir. Spermin yerine hemESK'ler konarak mikrop hattına genetik modifikasyonların getirilmesi biyolojik çalışmalar için önemli bir yöntemdir. Sırasıyla partenogenetik veya androgenetik hemECS'lerden türetilen anne veya baba genomlarını ayrı ayrı kültüre etme ve manipüle etme imkanı sağlar. Daha sonra HESC'ler, özellikle genomik baskı, alel özgü ifade ve ebeveyne özgü süreçler için avantajlı olan gametik genom replasmanı olarak kullanılabilir.
Farelerde normal embriyo gelişimi için hem anne hem de baba genomik bilgi gereklidir11. Bu nedenle, sperm genom5,8yerine vahşi tip partenogenetik hemECS (faESC) enjekte edildiğinde tam süreli yavrular elde edilemedi. Gelişimsel bloğun üstesinden gelmek için, partenogenetik hemECC'lerin maternal genomunun genomik baskısının bir baba yapılandırmasına düzeltilmesi gerekir. Bu, farklı metillenmiş bölgelerin (DMR' ler) manipülasyonu ile elde edilebilir. Bugüne kadar, H19-DMR, Gtl2-Dlk1 IG-DMR ve Rasgrf1-DMR'nin hedeflenen silmeleri, 3 ,5,8,12falclerinde doğumla ifade edilen genleri bastırmak için çalışılmıştır. Bu çalışmalar, hem H19-DMR hem de IG-DMR'nin silinmelerinin, bir anneyi sperm kromozomlarının yerini tutabilecek bir baba künyesi yapılandırmasına dönüştürmek için yeterli olduğunu göstermiştir. İki DMR delesyonlarını oositlere taşıyan fazEZ'lerin intrasitoplazmik enjeksiyonu, transfer edilen 2 hücreli embriyoların% 5.1 ila% 15.5'i arasında bir frekansa sahip yarı klonlanmış yavrular verdi.
Bu protokol, çift nakavtlı fadeskler (DKO-phaESC) olarak adlandırdığımız hem H19-DMR hem de IG-DMR silmeleri olan fakların uygulanmasına dayanmaktadır. DKO-phaESC hatları kurmak için faesklerde genomik baskı modifikasyonu, sperm genomunun yerine Oositlere DKO-faesk enjeksiyonu, yarı klonlanmış embriyoların blastosistlere kültürü ve yarı klonlanmış fareler elde etmek için ayrıntılı talimatlar sunuyoruz. Bu protokol, baba genomunun kesin ve doğrudan manipülasyonu ve yarı klonlanmış embriyo ve farelerin üretilmesini gerektiren araştırmacılar için bir referanstır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mLTube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 125.150</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150628</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M6250</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA fraction</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-037</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR 99021</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1386</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Demecolcine solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D1925</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM / F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DR4 mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>3208</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>E5134</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>biowest</td>
			<td>S1810-500</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium</td>
			<td>amsbio</td>
			<td>11897</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G1890</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irradiated MEF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A34966</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF (Leukemia inhibitory factor)</td>
			<td>(Homemade)</td>
			<td>-</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofection reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NDiff 227</td>
			<td>Takara</td>
			<td>Y40002</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD 0325901</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1408</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piggyBac plasmid carrying a CAG-EGFP transgene</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#40973</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piggyBac transposase plasmid</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>PB210PA-1</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pX330 plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#42230</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pX458 plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#48138</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F549S</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0192</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100317</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>109634</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Axon</td>
			<td>A3830</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71729</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer</td>
			<td>Epeendorf</td>
			<td>5384000012</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Tube with cell strainer cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo Astrios EQ</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B25982</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.1640</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-gauge 1/2 inch needle</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z192362-100EA</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6D2F1 mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>100006</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCG</td>
			<td>MSD animal health</td>
			<td>49451</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010015</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG</td>
			<td>Avivasysbio</td>
			<td>OPPA1037 5000 IU</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-cm dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179830</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Center-well dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3260</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital rocker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88880020</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0878</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H4272</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOM</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MR-020P-5F</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M16 medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7292</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7167</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M8410</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P1049-1PAK</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strontium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>13909</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml syringe</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.5607</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass cappilary</td>
			<td>Science product</td>
			<td>GB100T-8P</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTram 4r Oil</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5196000030</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorinert FC-770</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F3556</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding pipette</td>
			<td>BioMedical Instruments</td>
			<td>-</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti-U</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-900</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection pipette</td>
			<td>BioMedical Instruments</td>
			<td>-</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlaoder tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5252 956.003</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulaor arms</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>NT-88-V3</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PiezoXpert</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5194000016</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVP (Polyvinylpyrrolidine)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>PVP360</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of mouse parthenogenetic haploid embryonic stem cells as a substitute of sperm

Cinsel üremeye sahip organizmalarda, mikrop hücreleri yeni bireylere dönüşen totipotent hücrelerin kaynağıdır. Farelerde, bir oositin bir spermatozoon tarafından döllenmesi totipotent bir zigot oluşturur. Son zamanlarda, birkaç yayın haploid embriyonik kök hücrelerin (hemECS) gametik genomların yerini tutabileceğini ve farelere dönüşen embriyolara katkıda bulunabileceğini bildirmektedir. Burada, oositlere intrasitoplazmik enjeksiyon ile embriyo oluşturmak için sperm yerine partenogenetik hemECC'lerin uygulanması için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, haESC'lerin sperm replasmanı olarak hazırlanması, haESC kromozomlarının oositlere enjeksiyonu ve yarı klonlanmış embriyo kültürü için adımlardan oluşur. Embriyolar embriyo transferinden sonra verimli yarı klonlanmış fareler verebilir. Sperm replasmanı olarak HESC'lerin kullanılması mikrop hattında genom düzenlemesini, embriyonik gelişim çalışmalarını ve genomik baskıların araştırılmasını kolaylaştırır.

Bu protokolün amacı, yarı klonlanmış embriyo ve fare elde etmek için sperm yerine HESK'leri uygulamaktır. Bu amaçla, CAG-EGFP transgene taşıyan bir DKO-phaESC hattı üretildi ve MII oositlerine intrasitoplazmik enjeksiyon için kullanıldı. Baba künye konfigürasyonu ile uygun bir fazESC hattı elde etmek için Cas9 çekirdeklerini kullanarak genetik mühendisliği gerçekleştirdik. Bir haploid ESC hattı, diploidizasyon için haploid ESC'lerin doğal eğilimi nedeniyle ortaya çıkan haploid ve diploid hücreleri içerir10. Haploid kromozom seti, sperm genomunun başarılı bir şekilde değiştirilmesi için bir ön koşuldur. Akış sitometrisine göre DNA içerik analizi, haploid ve diploid hücrelerin G0/G1-, S-ve G2/M fazlarındaki dağılımını göstermektedir (Şekil 2A).
DKO-phaESC hatlarını kurmak için, wildtype phaESC hatları stabil transgenik EGFP ekspresyonu için piggyBac transposon yapıları ve H19ve IG-DMR'lerin silinmesi için CRISPR / Cas9 plazmidleri ile trans enfekte edildi. Diploid ESC'leri dışlamak ve sadece EGFP'yi ifade eden haploid ESC'leri izole etmek için belirli bir sıralama kapısı tanımlanmıştır (Şekil 2A). Tek haploid EGFP pozitif hücreler daha sonra alt klonlar elde etmek için 96 kuyu plakalı bireysel kuyulara kaplandı. MEF besleyiciler, transfected fakların kaplama verimliliğini ve hayatta kalmasını artırmak için kullanıldı. Kültürlerin genişlemesinden sonra, pcr tarafından her iki DMR'nin silinmelerini taşıyan alt klonları tanımlamak için ilk genotipleme turu gerçekleştirildi. MEF besleyiciler kültürlerden çıkarıldıktan sonra, H19ve IG-DMR'lerde wildtype alellerinin yokluğunu doğrulamak için ikinci bir genotipleme yapıldı (Şekil 2B). Toplam 135 alt klondan, silinen alelleri taşıyan ve hem H19-DMR hem de IG-DMR'nin wildtype alellerinden arındırılmış 5 haploid DKO-phESC hattı elde ettik.
Mikroskop altında yeşil floresan görselleştirmesi yapılarak yarı klonlanmış embriyolara katkılarını incelemek üzere DKO-fazlere cag-EGFP transjeni sokuldu (Şekil 3A). İntrasitoplazmik enjeksiyon için, DKO-fakeskler M fazında tutuklanmaları için demekolsin ile tedavi edildi. Böylece, DKO-fazEZ'lerin hücre döngüsü MII oositlerininkiyle senkronize edildi. Akış sitometrisi analizi, demekolin ile tedaviden sonra G2/M fazı tutuklu haploid (2n) ve diploid hücrelere (4n) karşılık gelen 2 popülasyon göstermiştir (Şekil 3B). 1n haploid zirvesinin yokluğu, hücre döngüsü durmasının büyük ölçüde tamamlandığını gösterdi. M fazlı haploid ESC'ler daha sonra sıralandı ve oositlere enjekte edildi. Bunun için, mikroenjeksiyon pipetine tek bir DKO-phaESC yüklendi ve bir MII oosit sitoplazmına enjekte edildi (Şekil 3C). DKO-phaESC'nin plazma zarı mikroenjeksiyon pipetinin ucuna pipetle sokularak yırtıldı.
Enjeksiyondan sonra, DKO-phaESC'lerin sitoplazma oositin büyük sitoplazmında dağıldığı için, inşa edilen yarı klonlanmış embriyolarda EGFP ekspresyolü nadiren tespit edildi (Şekil 3D). Nadir durumlarda, ooplazm içinde yoğun EGFP ekspresyonunun yuvarlak bir noktası gözlenebilir. Bu gözlem muhtemelen bozulmamış DKO-fazların yanlışlıkla enjektelenmesinden kaynaklanmıştır. DKO-phaESC hücre zarın yırtılmaması muhtemelen daha fazla embriyo gelişimi ile uyumlu değildir ve kaçınılmalıdır. Enjeksiyondan bir saat sonra, embriyolar stronsiyum klorür18ile tedavi ile aktive edildi. Aktivasyonun başlatılmasından altı saat sonra, mikroskop altında en fazla 3 kutup cisimleri gözlenmiştir (Şekil 3E). Bu kutup cisimleri, oositlerin birinci ve ikinci kutup gövdelerine ve DKO-phaESC7'densahte bir kutup gövdesine karşılık gelir. Ek olarak, sperm ile normal döllenmeden sonra zigotların pronükleer aşamasına benzeyen diferansiyel girişim kontrast mikroskobu altında iki pronüklei gözlendi.
Gelişimsel yeterliliği göstermek için yarı klonlanmış embriyolar blastosist aşamasına kültürlendi (Şekil 5A). Ayrıca, yarı klonlanmış 2 hücreli evre embriyoların alıcı bir dişinin yumurtalıklarına aktarılmasından sonra tam süreli bir fare elde edildi (Şekil 5B). Beklendiği gibi, yarı klonlanmış bir embriyodan elde edilen fare, ne oositler ne de oosit türevi faklar Y kromozomu taşımazken dişiydi. Yarı klonlanmış fare aşırı derecede normaldi ve vahşi bir İsviçre Webster erkeğiyle çiftleştiğinde sağlıklı yavrular üretti. Şimdiye kadar, yarı klonlanmış fare 600 günden fazla bir süredir belirgin bir sağlık sorunu olmadan hayattaydı.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig01v3.jpg"> Şekil 1: DKO-fakesklerin sperm replasmanı olarak uygulanmasına genel bakış. (A) Protokolün prosedürlerinin bir zaman dilimi. (B) Şema, DKO-phaESC hatları oluşturma adımlarını gösterir (adım 1-6). (C) Şema, bir DKO-phaESC'nin mii oosit içine intrasitoplazmik enjeksiyonu ile yarı klonlanmış embriyoları oluşturma adımlarını gösterir (adım 7-14). Kısaltmalar: DKO = çift nakavt; phaESC = parthogenetik haploid embriyonik kök hücre; FACS = floresanla etkinleştirilen hücre sıralama; MEF = fare embriyonik fibroblast. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig02v2.jpg"> Şekil 2: H19ve IG-DMR'ların CRISPR/Cas9 aracılı silmeleri ile DKO-phaESC hatlarının kurulması. (A) Stabil EGFP ekspresyonu için piggyBac plazmidleri ve 4 CRISPR/Cas9 plazmidleri ile transfeksiyondan sonra fadeklerin akış sitometri analizi. Transfected olmayan fades'ler kontrol olarak gösterilir. DNA profili (üstte) haploid ve diploid hücrelerin hücre döngüsü dağılımını gösterir. EGFP'yi ifade eden G1/S fazlı haploid hücreler yeşil kapı (alt, sağ) ile gösterilir. (B) MEF'lerde yetişen phaESC alt klonlarının genotiplenimi (ilk genotipleme) ve MOF'ların çıkarılmasından sonra (ikinci genotipleme). Alt klonlanmış fazESC çizgileri 1, 2, 3 ve 4, sırasıyla wildtype hücrelerini, H19-DMR silmeli hücreleri, IG-DMR silme ve birleşik H19- ve IG-DMR silmeleri ile temsil eder. 5–8 DKO-phaESC hatları hem H19-DMR hem de IG-DMR silmelerine sahiptir ve wildtype alellerinden arındırılmıştır. Kısaltmalar: DKO = çift nakavt; phaESC = parthogenetik haploid embriyonik kök hücre; DMR = diferansiyel metillenmiş bölge; MEF = fare embriyonik fibroblast; EGFP = gelişmiş yeşil floresan protein; WT = wildtype. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig03v3.jpg"> Şekil 3: Miyotik olarak tutuklanan DKO-phaESC'lerin MII oositlerine enjeksiyonu. (A) H19 ve IG-DMR'lerin CAG-EGFP transgene ve silmelerini taşıyan bir DKO-phaESCkültürünün morfolojisi; ölçek çubuğu = 50 μm. (B) DKO-fazezlerin 8 saat boyunca demecolcine ile tutuklandıktan sonra temsili akış sitometri analizi, demekolsin tedavisi olmayan DKO-fazler kontrol olarak gösterilmiştir. (C) Mikroenjeksiyon pipetinde DKO-fadezlerin morfolojisi. Plazma zarını pipetleme ile yırtmadan önce (solda) ve sonra (sağda) tek bir bozulmamış DKO-phaESC gösterilir; ölçek çubuğu = 20 μm. (D) MII oositlerine DKO-phaESC enjekte edildikten sonra 1 saat içinde embriyolar inşa edildi. EGFP floresan ve parlak alanın birleştirilmiş görüntüsü gösterilmiştir. Siyah ok uçları, kaçınılması gereken sağlam DKO-phaESC enjeksiyonundan sonra yoğun EGFP ekspresyonunun yuvarlak noktalarını gösterir; ölçek çubuğu = 50 μm. (E) Stronsiyum klorür ile aktivasyonun başlatılmasından 6 saat sonra yarı klonlanmış embriyoların diferansiyel girişim kontrast görüntüsü gösterilmiştir. Beyaz ok uçları, enjekte edilen DKO-phaESC'den bir sahte kutup gövdesi de dahil olmak üzere 3 kutup gövdesine sahip embriyoları gösterir; ölçek çubuğu = 50 μm. Kısaltmalar: DKO = çift nakavt; phaESC = parthogenetik haploid embriyonik kök hücre; EGFP = gelişmiş yeşil floresan protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig04.jpg"> Şekil 4: DKO-phaESC'lerin oositlere intrasitoplazmik enjeksiyonu için kurulumun şeması. (A) Enjeksiyon odasında bir enjeksiyon pipeti, bir tutma pipeti ve bir oosit düzenlenmesi gösterilmiştir. α, mikroenjeksiyon pipetinin büküm açısı. (B) İntrasitoplazmik enjeksiyon için mikromanipülasyon kabındaki damlaların düzeni. Kısaltmalar: DKO = çift nakavt; phaESC = parthogenetik haploid embriyonik kök hücre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig05.jpg"> Şekil 5: Yarı klonlanmış embriyoların gelişimi. (A) Yarı klonlanmış embriyoların in vitro preimplantasyon gelişimi. EGFP ekspresyasyonu ilk olarak intrasitoplazmik enjeksiyondan sonra 2. günde dört hücreli embriyolarda gözlenir. 4. günde, blastosistlerde yoğun EGFP ekspresyolü görülebilir; ölçek çubuğu = 100 μm. (B) Alıcı bir kadına 2 hücreli embriyo transferinden sonra elde edilen yarı klonlanmış bir fare. 74 dpp'de, yarı klonlanmış fare (ok ucu), vahşi bir İsviçre Webster erkeğiyle çiftleştikten sonra ilk yavrularını (yıldız işareti) doğal doğumla teslim etti. Yarı klonlanmış embriyolar ve bu şekilde gösterilen yarı klonlanmış fare, Aizawa ve ark.3'te bildirilenlerle aynıdır. Kısaltmalar: EGFP = gelişmiş yeşil floresan protein; .dpp, doğum sonrası günler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4">Jelatin çözeltisi</td>
		</tr><tr><td>Bileşen</td>
			<td>Stok konsantrasyonu</td>
			<td>Hacim / ağırlık</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>Su</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Jelatin</td>
			<td>-</td>
			<td>1 g</td>
			<td>0.2%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Haploid embriyonik kök hücre (HaESC) ortamı</td>
		</tr><tr><td>Bileşen</td>
			<td>Stok konsantrasyonu</td>
			<td>Hacim / ağırlık</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>NDiff 227</td>
			<td>-</td>
			<td>10 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>CHIR 99021</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>3 μL</td>
			<td>3 μM</td>
		</tr><tr><td>PD 0325901</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>1 μM</td>
		</tr><tr><td>Lıf</td>
			<td>1 x 106 IU/mL</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>1.000 IU/mL</td>
		</tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td>
			<td>100x</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">HaESC bakım tamponu</td>
		</tr><tr><td>Bileşen</td>
			<td>Stok konsantrasyonu</td>
			<td>Hacim / ağırlık</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>HaESC ortamı</td>
			<td>-</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>HEPES çözümü</td>
			<td>1 M</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Yıkama arabelleği</td>
		</tr><tr><td>Bileşen</td>
			<td>Stok konsantrasyonu</td>
			<td>Hacim / ağırlık</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>DMEM / F-12</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>BSA kesir</td>
			<td>7.5%</td>
			<td>7,1 mL</td>
			<td>0.5%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">MEF ortamı</td>
		</tr><tr><td>Bileşen</td>
			<td>Stok konsantrasyonu</td>
			<td>Hacim / ağırlık</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>DMEM</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Fbs</td>
			<td>-</td>
			<td>56 mL</td>
			<td>10%</td>
		</tr><tr><td>β-Mercaptoethanol</td>
			<td>14.3 mol/L</td>
			<td>3,9 μL</td>
			<td>100 μM</td>
		</tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td>
			<td>100x</td>
			<td>5,6 mL</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Lizis arabelleği</td>
		</tr><tr><td>Bileşen</td>
			<td>Stok konsantrasyonu</td>
			<td>Hacim / ağırlık</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>Su</td>
			<td>-</td>
			<td>8,25 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Tris-HCl (pH 8.5)</td>
			<td>1 M</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>100mm</td>
		</tr><tr><td>Edta</td>
			<td>0,5 M</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr><tr><td>SDS çözümü</td>
			<td>10%</td>
			<td>200 μL</td>
			<td>0.2%</td>
		</tr><tr><td>Nacl</td>
			<td>5 M</td>
			<td>400 μL</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr><tr><td>Proteinaz K</td>
			<td>20 mg/mL</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>100 μg/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Etkinleştirme ortamı</td>
		</tr><tr><td>Bileşen</td>
			<td>Stok konsantrasyonu</td>
			<td>Hacim / ağırlık</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>KSOM</td>
			<td>-</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Stronsiyum klorür</td>
			<td>1 M</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr><tr><td>EGTA</td>
			<td>0,5 M, pH 8,0</td>
			<td>4 μL</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">PVP çözümü</td>
		</tr><tr><td>Bileşen</td>
			<td>Stok konsantrasyonu</td>
			<td>Hacim / ağırlık</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>M2 orta</td>
			<td>-</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Pvp</td>
			<td>-</td>
			<td>0,6 g</td>
			<td>12%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">PMSG çözümü</td>
		</tr><tr><td>Bileşen</td>
			<td>Stok konsantrasyonu</td>
			<td>Hacim / ağırlık</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>Pbs</td>
			<td>-</td>
			<td>450 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>PMSG</td>
			<td>500 IU/mL</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>50 IU/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">hCG çözümü</td>
		</tr><tr><td>Bileşen</td>
			<td>Stok konsantrasyonu</td>
			<td>Hacim / ağırlık</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>Pbs</td>
			<td>-</td>
			<td>450 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Hcg</td>
			<td>500 IU/mL</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>50 IU/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Hyaluronidaz ortamı</td>
		</tr><tr><td>Bileşen</td>
			<td>Stok konsantrasyonu</td>
			<td>Hacim / ağırlık</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>M2 orta</td>
			<td>-</td>
			<td>380 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Hyaluronidaz</td>
			<td>10 mg/mL</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>0,5 mg/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Kısaltmalar: LIF = lösemi inhibitör faktörü; MEF = fare embriyonik fibroblast;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">FBS = fetal sığır serumu; DMEM = Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortası; BSA = sığır serum albümin;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">EDTA = etileniamintetraasetik asit; SDS = sodyum dodecylsulfate; EGTA = etilen-bis(oksitilennitrilo)tetraasetik asit;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">PBS = fosfat tamponlu salin; PVP = poliviniliptirolidon; hCG = insan koryonik gonadotropin;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">PMSG = hamile kısrak serum gonadotropin.</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Orta, tampon ve çözelti tarifi.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Adı</td>
			<td colspan="2">Sıra (5' ila 3')</td>
			<td>Uygulama</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P1</td>
			<td colspan="2">GTG GTT AGT TCT ATA TGG GG</td>
			<td>Genotipleme</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P2</td>
			<td colspan="2">AGA TGG GGT CAT TCT TTT CC</td>
			<td>Genotipleme</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P3</td>
			<td colspan="2">TCT TAC AGT CTG GTC TTG GT</td>
			<td>Genotipleme</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P1</td>
			<td colspan="2">TGT GCA GCA GCA AAG CTA AG</td>
			<td>Genotipleme</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P2</td>
			<td colspan="2">CCA CAA AAA CCT CCC TTT CA</td>
			<td>Genotipleme</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P3</td>
			<td colspan="2">ATA CGA TAC GGC AAC CAA CG</td>
			<td>Genotipleme</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA1-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCA TGA ACT CAG AAG AGA CTG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA1-R</td>
			<td colspan="2">AAA CCA GTC TCT TCT GAG TTC ATG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA2-F</td>
			<td colspan="2">CAC CAG GTG AGA ACC ACT GCT GAG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA2-R</td>
			<td colspan="2">AAA CCT CAG CAG TGG TTC TCA CCT</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA1-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCG TAC AGA GCT CCA TGG CAC</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA1-R</td>
			<td colspan="2">AAA CGT GCC ATG GAG CTC TGT ACG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA2-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCT GCT ETIKETI AGG TAC TAC GCT</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA2-R</td>
			<td colspan="2">AAA CAG CGT AGT ACC TCT AAG CAG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: Oligonükleotidlerin listesi.

Watch this Scientific Journal Video about Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm at JoVE.com

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

Bu makale, yarı klonlanmış embriyoların yapımında sperm yerine partenogenetik haploid embriyonik kök hücrelerin kullanımını göstermeyi amaçlamaktadır.

Sperm Yerine Fare Partenogenetik Haploid Embriyonik Kök Hücrelerin Uygulanması

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

application-mouse-parthenogenetic-haploid-embryonic-stem-cells-as

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

4.5K Görüntüleme.  ETH Zurich. Bu makale, yarı klonlanmış embriyoların yapımında sperm yerine partenogenetik haploid embriyonik kök hücrelerin kullanımını göstermeyi amaçlamaktadır.

Video: Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

Embriyonik Kök Hücreleri Kardiyak Progenitör Hücrelerinin türetilmesi

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Gelişim Biyolojisi

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Serum serbest Tek tabakalı Kültüründe Fare Embriyonik Kök Hücre Sinir Farklılaşma

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often located distally from the regulated gene in intergenic regions or even within the body of another gene. The position independent nature of enhancer activity makes it difficult to match enhancers with the genes they regulate. Deletion of an enhancer region provides direct evidence for enhancer activity and is the gold standard to reveal an enhancer's role in endogenous gene transcription. Conventional homologous recombination based deletion methods have been surpassed by recent advances in genome editing technology which enable rapid and precisely located changes to the genomes of numerous model organisms. CRISPR/Cas9 mediated genome editing can be used to manipulate the genome in many cell types and organisms rapidly and cost effectively, due to the ease with which Cas9 can be targeted to the genome by a guide RNA from a bespoke expression plasmid. Homozygous deletion of essential gene regulatory elements might lead to lethality or alter cellular phenotype whereas monoallelic deletion of transcriptional enhancers allows for the study of cis-regulation of gene expression without this confounding issue. Presented here is a protocol for CRISPR/Cas9 mediated deletion in F1 mouse embryonic stem (ES) cells (Mus musculus129 x Mus castaneus). Monoallelic deletion, screening and expression analysis is facilitated by single nucleotide polymorphisms (SNP) between the two alleles which occur on average every 125 bp in these cells.

Experimental validation of enhancer activity is best approached by loss-of-function analysis. Presented here is an efficient protocol that uses CRISPR/Cas9 mediated deletion to study allele-specific regulation of gene transcription in F1 ES cells which contain a hybrid genome (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Yaratma CRISPR / Cas9 aracılığı monoallelik Delesyonlar Fare Embriyonik Kök Hücreleri Artırıcı Fonksiyonu Eğitim için

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

Fare Embriyonik Hemogenic endotel hücrelerinin izolasyonu

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

Bir Transpozon Sistemi Kullanılarak Fare Amniyotik Sıvı Hücreleri pluripotent kök hücrelerin üretimi

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

Yatay Dağ Dağı: Derinin kalın, üç boyutlu doku kesitleri için yeni bir İşleme ve Görüntüleme Protokolü

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma insan embriyonik veya İndüklenmiş Pluripotent kök hücrelerinden retina Pigment epitel hücrelerinin

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

Somite türevleri indüklenen insan nesil Vitro Pluripotent kök hücreler

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous transplants to treat hematological and malignant disorders. Hemogenic endothelium (HE) is an amenable platform to produce functional HSPCs by transcription factors or to induce lymphocytes in a robust manner. However, current methods to derive HE are either costly or variable in yield. In this protocol, we established a cost-effective and precise method to derive HE within 4 days in a feeder- and xeno-free defined condition. The resultant HE underwent an endothelial-to-hematopoietic transition and produced CD34+CD45+ clonogenic hematopoietic progenitors. The potential capacity of our platform for generating functional HSPCs will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Here, we present a protocol to precisely form hemogenic endothelium from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free condition. This method will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Bir besleyici içinde ınsan pluripotent kök hücrelerinden hemogenik endotelyum farklılaşma-ve Xeno-ücretsiz tanımlı koşul

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...