Wir danken Dr. Giulio Di Minin für die Ableitung von phaESC-Linien und Dr. Remo Freimann für den Durchflusszytometriebetrieb. Wir würdigen auch Frau Michéle Schaffner und Herrn Thomas M. Hennek für die technische Unterstützung bei der Embryoübertragung. Diese Arbeit wurde vom Schweizerischen Nationalfonds unterstützt (Stipendium 31003A_152814/1).

<ol>
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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Das Klonen von Säugetieren durch somatische Zellkernübertragung (SCNT) wurde in den 1990er Jahren19,20,21entwickelt. Diese Entwicklungen folgten Klonstudien, die 30 Jahre zuvor bei Amphibien durchgeführt wurden22. Die erhebliche Verzögerung spiegelt die Schwierigkeit der Embryologie und der genomischen Prägung bei Säugetieren wider. Die Entwicklung von Säugetier SCNT ist die Grundlage für die Anwendung von haESC für die Substitution von Spermien, die in diesem Protokoll detailliert ist.
Die Zellzyklussynchronisierung ist ein wichtiger Erfolgsfaktor von SCNT23. Dies gilt auch für die Injektion von haESC in diesem Protokoll. Die Einführung eines Spendergenoms in einen Empfänger erfordert, dass die Zellzyklusphasen angepasst werden, um Chromosomenbrüche oder Aneuploidien zu vermeiden, die die Embryoentwicklung abbrechen würden. Semi-Klonen hat die zusätzliche Komplexität, dass zwei Genome und ein Zytoplast kompatibel sein müssen. Ein früherer Bericht hat gezeigt, dass die Injektion von M-Phasen-verhafteten androgenetischen HaESCs bessere Entwicklungsraten von halbgeklonten Embryonen ergab als die Injektion von G1-Phasen-HaESCs in Eizellen7. Dieser Bericht schlägt M-Phase als geeigneten Synchronisationspunkt für das Halbklonen vor. Dementsprechend wurden PhaESCs in Metaphase mit Demekolumcin mit zitotisch verhaftet und in das Ooplasma von MII-Oozyten injiziert, die natürlicherweise in Metaphase II der Meiose verhaftet wurden. Wichtig ist, dass die M-Phasen-Absicherung in Maus-ESCs mit hoher Effizienz erreicht werden kann, was eine hervorragende Synchronisation zwischen Spender- und Empfängerzellzyklen ermöglicht.
Während der Mitose bricht die Kernmembran zusammen und eine Spindel bildet sich, an der sich die replizierten Chromosomen anheften. Nach Der Injektion von M-Phase DKO-phaESCs werden Schwesterchromatide in einen pseudopolaren Körper und die Zygote7 (Abbildung 3E) getrennt. Folglich trägt ein einziger Chromosomensatz aus einem DKO-phaESC zum halbgeklonten Embryo bei. Es ist wichtig, dass die Schwesterchromatiden der DKO-phaESC-Chromosomen nach der Injektion korrekt segregiert werden können. Die Plasmamembran eines intakten DKO-phaESC verhindert die Segregation in einen pseudopolaren Körper. Wir beobachteten in der Tat seltene Fälle, in denen die Plasmamembran von DKO-PhaESCs nicht gebrochen wurde und Embryonen intakte DKO-PhaESCs im Ooplasma nach der Injektion zeigten (Abbildung 3D). Daher ist darauf zu achten, dass die Plasmamembran von DKO-phaESCs durch Pipettieren entfernt wird. Während der Injektion ist es ebenso wichtig, die Störung der meiotischen Spindel der Oozyte zu vermeiden, die zu Chromosomensegregationsdefekten führen und auch Aneuploidie auslösen könnte.
Bei Säugetieren schränkt die genomische Prägung die Anwendung von PhaESCs als Spermienersatz ein. Parthenogenetische HaESCs besitzen eine mütterliche Konfiguration genomischer Abdrücke, während Spermien eine väterliche Konfiguration besitzen. Daher ist die Erzeugung von Vollzeitwelpen nach der Injektion von Wildtyp-PhaESCs als Spermienersatz nicht aufgetreten. Um diese Einschränkung zu überwinden, werden Löschungen der IG-und H19-DMRsin phaESCs entwickelt. Die Modifikation der eingeprägten Expression an den mütterlichen LocI Igf2-H19 und Gtl2-Dlk1 ist ausreichend, um die Konfiguration genomischer Abdrücke zu ändern, um die Erzeugung von halbgeklonten Mäusen mit einer Häufigkeit von über 5,1% auf der Grundlage übertragener 2-Zellen-Embryonen zu ermöglichen. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass die Ausrichtung auf zwei aufgedruckte Gene das Genom von PhaESCs in eine funktionelle väterliche Konfiguration verwandelt, die Spermien in Mäusen ersetzen kann. Dennoch ist für diese Strategie eine permanente genetische Veränderung der PhaESCs erforderlich. Als alternative Strategie kann androgenetischehaESC in Betracht gezogen werden. Androgenetische HaESCs stammen aus dem Spermagenom und besitzen väterliche Abdrücke. Es gab Berichte, dass Wildtyp androgenetische HaESCs als Spermienersatz dazu beitrugen, Vollzeitwelpen in einer Häufigkeit zwischen 1,3% und 1,9% der übertragenen Embryonen4,7,24zu erzeugen. Vollzeit-Welpen wurden auch durch Injektion androgenetische haESCs mit Deletionen der IG- und H19-DMRs in einer Häufigkeit von 20,2% der übertragenen 2-Zell-Embryonen24erhalten. Die erhöhte Effizienz des Semiklonens mit modifizierten androgenetischen HaESCs ist wahrscheinlich, weil Abdrücke in der Kultur instabil werden können. Aufdruckfehler werden durch die genetischen Löschungen kritischer DMRs korrigiert.
Angesichts der Schwierigkeit, genetische Veränderungen direkt in die Eizellen- oder Spermiengenome einzuführen, sind haESCs ein wertvolles Werkzeug, um die elterlichen Genome getrennt zu manipulieren. Die Verwendung von haESCs als Spermaersatz bietet einen bemerkenswerten Vorteil für die Genombearbeitung in der Mauskeimbahn. Eine aktuelle Studie hat CRISPR/Cas9-basierte Genombearbeitung mit der Anwendung von haESCs zur Charakterisierung von Prägungsregionen kombiniert, die für die embryonale Entwicklung entscheidend sind12. Diese Studie analysierte die Rolle der Rasgrf1-DMR in Kombination mit den H19-und IG-DMRsbei der Entwicklung von bimaternalen Mäusen und die Funktion von 7 verschiedenen DMRs bei der Entwicklung von bipaternalen Mäusen. Die Methode zur Substitution von HaESCs für Spermien bildete die Grundlage für genetische Screening-Ansätze zur Identifizierung wichtiger Aminosäuren innerhalb des DND1-Proteins in der Entwicklung von Urkeimzellen und zur Identifizierung von Genen in der Knochenentwicklung24,25,26. Studien über genomische Prägungen und genetisches Screening zur Identifizierung von Schlüsselfaktoren in der embryonalen Entwicklung sind beträchtliche Ansätze für die Anwendung von haESCs als gametische Genome.

Bei Säugetieren sind Gameten die einzigen Zellen, die genetische Informationen an die nächste Generation übertragen. Die Fusion einer Eizelle und eines Spermatozoons bildet eine diploide Zygote, die sich zu einem erwachsenen Tier entwickelt. Mutationen in gametischen Genomen werden dabei von den Nachkommen vererbt und treiben die genetische Variation in Art1voran. Die Einführung von Mutationen in der Keimbahn wurde angewendet, um genetisch veränderte Tiere für verschiedene biologische Studien zu produzieren, einschließlich der Charakterisierung der Genfunktion und der Krankheitsmodellierung. Sowohl Eizellen als auch Spermatozoen sind endlos differenzierte und hochspezialisierte Zellen, die ihre Proliferation eingestellt haben. Daher ist die direkte Modifikation von Gameten technisch schwierig, und es wurden spezielle Ansätze entwickelt. Genetische Veränderungen können durch Injektion genetisch veränderter ESCs in Blastozysten in die Mauskeimbahn eingeführt werden, wo sie sich in den sich entwickelnden Embryo integrieren und die Keimbahn besiedeln. Darüber hinaus hat sich die genetische Veränderung von Zygoten mit Genom-Editing-Ansätzen, einschließlich des CRISPR/Cas9-Systems, weit verbreitet2.
Kürzlich wurde ein hervorragender Ansatz berichtet, der haESCs als Ersatz für ein gametisches Genom3,4,5,6,7,8anwendet. HaESCs sind Stammzelllinien, die aus der inneren Zellmasse parthenogenetischer oder androgenetischer haploider Blastozysten abgeleitet sind und einen einzigen Satz chromosomen4,7,9,10besitzen. Es wurde nachgewiesen, dass sowohl parthenogenetische als auch androgenetische HäSchen zum Genom von halbgeklonten Mäusen nach intrazytoplasmatischer Injektion in Eizellen beitragen können. Im Gegensatz zu anderen Ansätzen können die Genome von haESCs aufgrund ihrer Selbsterneuerungskapazität direkt in der Kultur verändert werden. Die Einführung genetischer Veränderungen in die Keimbahn durch den Ersatz von Spermien durch haESCs ist eine wichtige Methode für biologische Studien. Es sieht die Möglichkeit vor, das mütterliche oder väterliche Genom, das aus parthenogenetischen bzw. androgenetischen HaESCs abgeleitet ist, getrennt zu kulturieren und zu manipulieren. HaESCs können dann als gametischer Genomersatz verwendet werden, was besonders für Studien zu genomischen Prägungen, allelespezifischer Expression und elterlichen spezifischen Prozessen von Vorteil ist.
Bei Mäusen sind sowohl mütterliche als auch väterliche genomische Informationen für die normale Embryoentwicklung erforderlich11. Daher konnten keine Vollzeitwelpen gewonnen werden, wenn wildtypparthenogenetische HaESCs (PhaESCs) injiziert wurden, um das Spermagenom5,8zu ersetzen. Um den Entwicklungsblock zu überwinden, muss die genomische Prägung des mütterlichen Genoms von parthenogenetischen HaESCs zu einer väterlichen Konfiguration korrigiert werden. Dies kann durch Manipulation der differenziell methylierten Regionen (DR) erreicht werden. Bis heute wurden gezielte Löschungen der H19-DMR, Gtl2-Dlk1 IG-DMR und Rasgrf1-DMR untersucht, um mütterlich exprimierte Gene in phaESCs3,5,8,12zu unterdrücken. Diese Studien zeigten, dass Deletionen sowohl der H19-DMR als auch der IG-DMRausreichen, um eine mütterliche in eine väterliche Abdruckkonfiguration umzuwandeln, die Spermienchromosomen ersetzen kann. Die intrazytoplasmatische Injektion von PhaESCs, die die beiden DMR-Deletionen in Eizellen tragen, ergab halbklonierte Welpen mit einer Häufigkeit zwischen 5,1% und 15,5% der übertragenen 2-Zellen-Embryonen.
Dieses Protokoll basiert auf der Anwendung von phaESCs mit Löschungen von H19-DMR und IG-DMR, die wir Double-Knockout-PhaESCs (DKO-phaESCs) bezeichnen. Wir geben detaillierte Anweisungen für die Modifikation der genomischen Prägung in phaESCs zur Etablierung von DKO-phaESC-Linien, zur Injektion von DKO-PhaESCs in Eizellen als Ersatz für ein Spermagenom, für die Kultur von halbgeklonten Embryonen in Blastozysten und für die Gewinnung von halbgeklonten Mäusen. Dieses Protokoll ist eine Referenz für Forscher, die eine präzise und direkte Manipulation des väterlichen Genoms und die Erzeugung von halbgeklonten Embryonen und Mäusen erfordern.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mLTube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 125.150</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150628</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M6250</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA fraction</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-037</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR 99021</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1386</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Demecolcine solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D1925</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM / F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DR4 mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>3208</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>E5134</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>biowest</td>
			<td>S1810-500</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium</td>
			<td>amsbio</td>
			<td>11897</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G1890</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irradiated MEF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A34966</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF (Leukemia inhibitory factor)</td>
			<td>(Homemade)</td>
			<td>-</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofection reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NDiff 227</td>
			<td>Takara</td>
			<td>Y40002</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD 0325901</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1408</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piggyBac plasmid carrying a CAG-EGFP transgene</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#40973</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piggyBac transposase plasmid</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>PB210PA-1</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pX330 plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#42230</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pX458 plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#48138</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F549S</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0192</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100317</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>109634</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Axon</td>
			<td>A3830</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71729</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer</td>
			<td>Epeendorf</td>
			<td>5384000012</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Tube with cell strainer cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo Astrios EQ</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B25982</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.1640</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-gauge 1/2 inch needle</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z192362-100EA</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6D2F1 mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>100006</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCG</td>
			<td>MSD animal health</td>
			<td>49451</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010015</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG</td>
			<td>Avivasysbio</td>
			<td>OPPA1037 5000 IU</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-cm dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179830</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Center-well dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3260</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital rocker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88880020</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0878</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H4272</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOM</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MR-020P-5F</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M16 medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7292</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7167</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M8410</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P1049-1PAK</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strontium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>13909</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml syringe</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.5607</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass cappilary</td>
			<td>Science product</td>
			<td>GB100T-8P</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTram 4r Oil</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5196000030</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorinert FC-770</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F3556</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding pipette</td>
			<td>BioMedical Instruments</td>
			<td>-</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti-U</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-900</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection pipette</td>
			<td>BioMedical Instruments</td>
			<td>-</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlaoder tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5252 956.003</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulaor arms</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>NT-88-V3</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PiezoXpert</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5194000016</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVP (Polyvinylpyrrolidine)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>PVP360</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of mouse parthenogenetic haploid embryonic stem cells as a substitute of sperm

In Organismen mit sexueller Fortpflanzung sind Keimzellen die Quelle totipotenter Zellen, die sich zu neuen Individuen entwickeln. Bei Mäusen erzeugt die Befruchtung einer Eizelle durch ein Spermatozoon eine totipotente Zygote. Kürzlich haben mehrere Veröffentlichungen berichtet, dass haploide embryonale Stammzellen (haESCs) ein Ersatz für gametische Genome sein und zu Embryonen beitragen können, die sich zu Mäusen entwickeln. Hier stellen wir ein Protokoll zur Anwendung parthenogenetischer HaESCs als Ersatz für Spermien vor, um Embryonen durch intrazytoplasmatische Injektion in Eizellen zu konstruieren. Dieses Protokoll besteht aus Schritten zur Vorbereitung von haESCs als Spermienersatz, zur Injektion von haESC-Chromosomen in Eizellen und zur Kultur halbgeklonter Embryonen. Die Embryonen können nach dem Embryotransfer fruchtbare halbgeklonte Mäuse hervorbringen. Die Verwendung von haESCs als Spermienersatz erleichtert die Genombearbeitung in der Keimbahn, Studien zur embryonalen Entwicklung und die Untersuchung genomischer Prägung.

Ziel dieses Protokolls ist es, haESCs als Ersatz für Spermien anzuwenden, um halbgeklonte Embryonen und Mäuse zu erhalten. Zu diesem Zweck wurde eine DKO-phaESC-Leitung mit dem CAG-EGFP-Transgen erzeugt und zur intrazytoplasmatischen Injektion in MII-Oozyten verwendet. Um eine geeignete phaESC-Linie mit einer väterlichen Abdruckkonfiguration zu erhalten, haben wir Gentechnik mit Cas9-Nukleasen durchgeführt. Eine haploide ESC-Linie enthält haploide und diploide Zellen, die aufgrund einer inhärenten Tendenz von haploiden ESCs zur Diploidisierung10entstehen. Ein haploides Chromosom-Set ist eine Voraussetzung für einen erfolgreichen Ersatz des Spermagenoms. Die DNA-Gehaltsanalyse mittels Durchflusszytometrie zeigt die Verteilung von haploiden und diploiden Zellen in G0/G1-, S- und G2/M-Phasen (Abbildung 2A).
Zur Festlegung der DKO-phaESC-Linien wurden Wildtyp-PhaESC-Linien mit piggyBac-Transposonkonstrukten für stabile transgene EGFP-Expression und mit CRISPR/Cas9-Plasmiden zur Erlangung von Deletionen der H19-und IG-DMRs transfiziert. Um diploide ESCs auszuschließen und nur haploide ESCs zu isolieren, die EGFP exdrücken, wurde ein spezifisches Sortiergate definiert (Abbildung 2A). Einzelne haploide EGFP-positive Zellen wurden dann in einzelne Brunnen von 96-Well-Platten einbeschichtet, um Subklone zu erhalten. MEF-Feeder wurden verwendet, um die Beschichtungseffizienz und das Überleben der transfäften PhaESCs zu erhöhen. Nach der Erweiterung der Kulturen wurde eine erste Runde der Genotypisierung von PCR durchgeführt, um Unterklone zu identifizieren, die Löschungen beider DMRs tragen. Nachdem MEF-Feeder aus den Kulturen entfernt worden waren, wurde eine zweite Genotypisierung durchgeführt, um das Fehlen von Wildtyp-Allelen an den H19-und IG-DMRs zu bestätigen (Abbildung 2B). Von insgesamt 135 Subklonen erhielten wir 5 haploide DKO-phESC-Linien, die die gelöschten Allele trugen und frei von Wildtyp-Allelen sowohl der H19-DMRals auch der IG-DMR waren.
Ein CAG-EGFP-Transgen wurde in DKO-phaESCs eingeführt, um ihren Beitrag zu halbgeklonten Embryonen durch Visualisierung grüner Fluoreszenz unter dem Mikroskop zu untersuchen (Abbildung 3A). Für die intrazytoplasmatische Injektion wurden DKO-PhaESCs mit Demekolumcin behandelt, um sie in der M-Phase zu verhaften. So wurde der Zellzyklus von DKO-phaESCs mit dem von MII-Oozyten synchronisiert. Die Durchflusszytometrie-Analyse zeigte 2 Populationen, die g2/M-Phase entsprechen, haploid (2n) und diploide Zellen (4n) nach der Behandlung mit Demekolumin (Abbildung 3B). Das Fehlen des 1n haploiden Peaks deutete darauf hin, dass der Zellzyklusstillstand weitgehend abgeschlossen war. M-Phase haploid ESCs wurden dann sortiert und in Eizellen injiziert. Dazu wurde ein einziger DKO-PhaESC in die Mikroinjektionspipette geladen und in das Zytoplasma einer MII-Oozyte injiziert (Abbildung 3C). Die Plasmamembran des DKO-phaESC wurde durch Pipettieren in die Spitze der Mikroinjektionspipette gebrochen.
Nach der Injektion wurde die EGFP-Expression selten in den konstruierten halbgeklonten Embryonen nachgewiesen, da sich das Zytoplasma von DKO-PhaESCs im großen Zytoplasma der Oozyte dispergiert hatte (Abbildung 3D). In seltenen Fällen konnte ein runder Punkt intensiver EGFP-Expression innerhalb des Ooplasmas beobachtet werden. Diese Beobachtung wurde wahrscheinlich durch die unbeabsichtigte Injektion intakter DKO-PhaESCs verursacht. Ein Versagen, die DKO-phaESC-Zellmembran zu brechen, ist wahrscheinlich nicht mit der weiteren Embryoentwicklung vereinbar und sollte vermieden werden. Eine Stunde nach der Injektion wurden Embryonen durch Behandlung mit Strontiumchlorid18aktiviert. Sechs Stunden nach Beginn der Aktivierung wurden bis zu 3 Polarkörper unter dem Mikroskop beobachtet (Abbildung 3E). Diese Polarkörper entsprechen dem ersten und zweiten Polarkörper der Oozyte und einem pseudopolaren Körper aus dem DKO-phaESC7. Darüber hinaus wurden zwei Vorkerne unter einem Differentialinterferenzkontrastmikroskop beobachtet, das dem pronuklearen Stadium von Zygoten nach normaler Befruchtung mit Spermien ähnelte.
Um entwicklungsfähig zu demonstrieren, wurden halbgeklonte Embryonen in das Blastozystenstadium kultiviert (Abbildung 5A). Darüber hinaus wurde eine Vollzeitmaus erhalten, nachdem halbklonierte 2-Zell-Stadium-Embryonen in die Eileiter eines Empfängerweibchens übertragen wurden (Abbildung 5B). Wie erwartet, war die Maus, die von einem halbgeklonten Embryo abgeleitet wurde, ein Weibchen, da weder Eizellen noch eizellenabgeleitete PhaESCs ein Y-Chromosom tragen. Die halb geklonte Maus war völlig normal und produzierte gesunde Nachkommen, wenn sie mit einem Wildtyp Schweizer Webster Männchen gepaart wurde. Bislang ist die halbgeklonte Maus seit über 600 Tagen ohne erkennbare gesundheitliche Probleme am Leben.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig01v3.jpg"> Abbildung 1: Überblick über die Anwendung von DKO-phaESCs als Spermienersatz. (A) Ein Zeitrahmen für die Verfahren des Protokolls. (B) Das Schema zeigt die Schritte zum Einrichten von DKO-phaESC-Linien (Schritte 1–6). (C) Das Schema zeigt die Schritte zum Konstruieren halbklonierter Embryonen durch intrazytoplasmatische Injektion eines DKO-PhaESC in eine MII-Oozyte (Schritte 7–14). Abkürzungen: DKO = Double-Knockout; phaESC = parthogenetische haploide embryonale Stammzelle; FACS = fluoreszenzaktivierte Zellsortierung; MEF = Maus embryonaler Fibroblast. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig02v2.jpg"> Abbildung 2: Einrichtung von DKO-phaESC-Zeilen durch CRISPR/Cas9-vermittelte Löschungen von H19- und IG-DMRs. (A) Flow-Zytometrie-Analyse von PhaESCs nach Transfektion mit PiggyBac-Plasmiden für stabile EGFP-Expression und mit 4 CRISPR/Cas9-Plasmiden. Nicht transfizierte PhaESCs werden als Kontrolle angezeigt. Das DNA-Profil (oben) zeigt die Zellzyklusverteilung von haploiden und diploiden Zellen. G1/S-Phase haploide Zellen, die EGFP exdrücken, werden durch das grüne Tor (unten, rechts) angezeigt. (B) Genotypisierung von PhaESC-Unterklonen, die auf MEFs (erste Genotypisierung) und nach Entfernung von MEFs (zweite Genotypisierung) angebaut wurden. Unterklonierte PhaESC-Zeilen 1, 2, 3 und 4 stellen Wildtypzellen dar, Zellen mit h19-DMR-Deletion, mit einer IG-DMR-Löschungund mit kombinierten H19-bzw. IG-DMR-Deletionen. Die DKO-phaESC-Zeilen 5–8 besitzen sowohl H19-DMR-als auch IG-DMR-Deletionen und sind frei von Wildtyp-Allelen. Abkürzungen: DKO = Double-Knockout; phaESC = parthogenetische haploide embryonale Stammzelle; DMR = differenziell methylierter Bereich; MEF = Maus embryonaler Fibroblast; EGFP = verbessertes grünes fluoreszierendes Protein; WT = Wildtyp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig03v3.jpg"> Abbildung 3: Injektion von mitotisch verhafteten DKO-PhaESCs in MII-Oozyten. (A) Morphologie einer DKO-phaESC-Kultur, die ein CAG-EGFP-Transgen und Streichungen der H19- und IG-DMRträgt; Skala bar = 50 m . (B) Repräsentative Durchflusszytometrieanalyse von DKO-phaESCs nach Festnahme mit Demecolin für 8 h. DKO-phaESCs ohne Demekoluminbehandlung werden als Kontrolle dargestellt. (C) Morphologie von DKO-phaESCs in der Mikroinjektionspipette. Es wird ein einziges intaktes DKO-phaESC vor (links) und nach (rechts) Das Brechen der Plasmamembran durch Pipettieren gezeigt; Skala bar = 20 m . (D) Konstruierte Embryonen bei 1 h nach Injektion von DKO-PhaESCs in MII-Oozyten. Ein zusammengeführtes Bild von EGFP-Fluoreszenz und hellem Feld wird gezeigt. Schwarze Pfeilspitzen zeigen runde Flecken intensiver EGFP-Expression nach Injektion intakter DKO-PhaESCs an, die vermieden werden sollten; Skala bar = 50 m. (E) Ein Differentialinterferenzkontrastbild von halbgeklonten Embryonen 6 h nach Beginn der Aktivierung mit Strontiumchlorid wird gezeigt. Weiße Pfeilspitzen zeigen Embryonen mit 3 polaren Körpern an, darunter einen pseudopolaren Körper aus dem injizierten DKO-phaESC; Skalenbalken = 50 m. Abkürzungen: DKO = Double-Knockout; phaESC = parthogenetische haploide embryonale Stammzelle; EGFP = verbessertes grünes fluoreszierendes Protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig04.jpg"> Abbildung 4: Schema des Aufbaus für die intrazytoplasmatische Injektion von DKO-PhaESCs in Eizellen. (A) Die Anordnung einer Injektionspipette, einer Haltepipette und einer Oozyte in der Injektionskammer wird angezeigt. α, Biegewinkel der Mikroinjektionspipette. (B) Layout der Tropfen in der Mikromanipulationsschale für intrazytoplasmatische Injektion. Abkürzungen: DKO = Double-Knockout; phaESC = parthogenetische haploide embryonale Stammzelle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig05.jpg"> Abbildung 5: Entwicklung von halbgeklonten Embryonen. (A) Präimplantationsentwicklung von halbgeklonten Embryonen in vitro. Die EGFP-Expression wird zunächst an Tag 2 nach intrazytoplasmatischer Injektion bei vierzelligen Embryonen beobachtet. An Tag 4 kann eine intensive EGFP-Expression in Blastozysten beobachtet werden; Skala bar = 100 m . (B) Eine halbgeklonte Maus, die nach dem 2-Zell-Embryotransfer zu einem Empfängerweibchen erhalten wurde. Mit 74 dpp lieferte die halbgeklonte Maus (Pfeilspitze) ihre ersten Welpen (Sternchen) durch natürliche Geburt nach der Paarung mit einem Wildtyp Schweizer Webster Männchen. Halbgeklonte Embryonen und die in dieser Abbildung gezeigte halbgeklonte Maus sind identisch mit denen, die in Aizawa et al.3berichtet werden. Abkürzungen: EGFP = verbessertes grünes fluoreszierendes Protein; .dpp, Tage nach der Partum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4">Gelatinelösung</td>
		</tr><tr><td>Komponente</td>
			<td>Lagerkonzentration</td>
			<td>Volumen / Gewicht</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr><tr><td>Wasser</td>
			<td>-</td>
			<td>500 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Gelatine</td>
			<td>-</td>
			<td>1 g</td>
			<td>0.2%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Haploid embryonale Stammzelle (HaESC) medium</td>
		</tr><tr><td>Komponente</td>
			<td>Lagerkonzentration</td>
			<td>Volumen / Gewicht</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr><tr><td>NDiff 227</td>
			<td>-</td>
			<td>10 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>CHIR 99021</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>3 l</td>
			<td>18.00 UHR</td>
		</tr><tr><td>PD 0325901</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>1 L</td>
			<td>1 M</td>
		</tr><tr><td>Lif</td>
			<td>1 x 106 I.E./ml</td>
			<td>10 l</td>
			<td>1.000 I.E./ml</td>
		</tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>100x</td>
			<td>100 l</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">HaESC-Wartungspuffer</td>
		</tr><tr><td>Komponente</td>
			<td>Lagerkonzentration</td>
			<td>Volumen / Gewicht</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr><tr><td>HaESC Mittel</td>
			<td>-</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>HEPES-Lösung</td>
			<td>1 M</td>
			<td>20 l</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Waschpuffer</td>
		</tr><tr><td>Komponente</td>
			<td>Lagerkonzentration</td>
			<td>Volumen / Gewicht</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr><tr><td>DMEM / F-12</td>
			<td>-</td>
			<td>100 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>BSA-Fraktion</td>
			<td>7.5%</td>
			<td>7,1 ml</td>
			<td>0.5%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">MEF mittel</td>
		</tr><tr><td>Komponente</td>
			<td>Lagerkonzentration</td>
			<td>Volumen / Gewicht</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr><tr><td>DMEM</td>
			<td>-</td>
			<td>500 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Fbs</td>
			<td>-</td>
			<td>56 ml</td>
			<td>10%</td>
		</tr><tr><td>β-Mercaptoethanol</td>
			<td>14,3 mol/L</td>
			<td>3,9 l</td>
			<td>100 m</td>
		</tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>100x</td>
			<td>5,6 ml</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Lysis-Puffer</td>
		</tr><tr><td>Komponente</td>
			<td>Lagerkonzentration</td>
			<td>Volumen / Gewicht</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr><tr><td>Wasser</td>
			<td>-</td>
			<td>8,25 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Tris-HCl (pH 8.5)</td>
			<td>1 M</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr><tr><td>Edta</td>
			<td>0,5 M</td>
			<td>100 l</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr><tr><td>SDS-Lösung</td>
			<td>10%</td>
			<td>200 l</td>
			<td>0.2%</td>
		</tr><tr><td>Nacl</td>
			<td>5 M</td>
			<td>400 l</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr><tr><td>Proteinase K</td>
			<td>20 mg/ml</td>
			<td>50 l</td>
			<td>100 g/ml</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Aktivierungsmedium</td>
		</tr><tr><td>Komponente</td>
			<td>Lagerkonzentration</td>
			<td>Volumen / Gewicht</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr><tr><td>KSOM</td>
			<td>-</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Strontiumchlorid</td>
			<td>1 M</td>
			<td>5 l</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr><tr><td>EGTA</td>
			<td>0,5 M, pH 8,0</td>
			<td>4 l</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">PVP-Lösung</td>
		</tr><tr><td>Komponente</td>
			<td>Lagerkonzentration</td>
			<td>Volumen / Gewicht</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr><tr><td>M2 mittel</td>
			<td>-</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Pvp</td>
			<td>-</td>
			<td>0,6 g</td>
			<td>12%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">PMSG-Lösung</td>
		</tr><tr><td>Komponente</td>
			<td>Lagerkonzentration</td>
			<td>Volumen / Gewicht</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr><tr><td>Pbs</td>
			<td>-</td>
			<td>450 l</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>PMSG</td>
			<td>500 I.E./ml</td>
			<td>50 l</td>
			<td>50 I.E./ml</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">hCG-Lösung</td>
		</tr><tr><td>Komponente</td>
			<td>Lagerkonzentration</td>
			<td>Volumen / Gewicht</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr><tr><td>Pbs</td>
			<td>-</td>
			<td>450 l</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Hcg</td>
			<td>500 I.E./ml</td>
			<td>50 l</td>
			<td>50 I.E./ml</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Hyaluronidase medium</td>
		</tr><tr><td>Komponente</td>
			<td>Lagerkonzentration</td>
			<td>Volumen / Gewicht</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr><tr><td>M2 mittel</td>
			<td>-</td>
			<td>380 l</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Hyaluronidase</td>
			<td>10 mg/ml</td>
			<td>20 l</td>
			<td>0,5 mg/ml</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Abkürzungen: LIF = Leukämie-Hemmfaktor; MEF = Maus embryonaler Fibroblast;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">FBS = fetales Rinderserum; DMEM = Dulbeccos modifizierter Adler Medium; BSA = Rinderserumalbumin;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure; SDS = Natriumdodecylsulfat; EGTA = Ethylen-Bis(Oxyethylenenitrilo)Tetraessigsäure;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">PBS = phosphatgepufferte Saline; PVP = Polyvinylpyrrolidon; hCG = humanes Choriongonadotropin;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">PMSG = schwangere Stute Serum Gonadotropin.</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Rezept von Medium, Puffer und Lösung.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Namen</td>
			<td colspan="2">Sequenz (5' bis 3')</td>
			<td>Anwendung</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P1</td>
			<td colspan="2">GTG GTT AGT TCT ATA TGG GG</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P2</td>
			<td colspan="2">AGA TGG GGT CAT TCT TTT CC</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P3</td>
			<td colspan="2">TCT TAC AGT CTG GTC TTG GT</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P1</td>
			<td colspan="2">TGT GCA GCA GCA AAG CTA AG</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P2</td>
			<td colspan="2">CCA CAA AAA CCT CCC TTT CA</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P3</td>
			<td colspan="2">ATA CGA TAC GGC AAC CAA CG</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA1-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCA TGA ACT CAG AAG AGA CTG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA1-R</td>
			<td colspan="2">AAA CCA GTC TCT TCT GAG TTC ATG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA2-F</td>
			<td colspan="2">CAC CAG GTG AGA ACC ACT GCT GAG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA2-R</td>
			<td colspan="2">AAA CCT CAG CAG TGG TTC TCA CCT</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA1-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCG TAC AGA GCT CCA TGG CAC</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA1-R</td>
			<td colspan="2">AAA CGT GCC ATG GAG CTC TGT ACG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA2-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCT GCT TAG AGG TAC TAC GCT</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA2-R</td>
			<td colspan="2">AAA CAG CGT AGT ACC TCT AAG CAG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Liste der Oligonukleotide.

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Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

Dieser Artikel zielt darauf ab, die Verwendung von parthenogenetischen haploiden embryonalen Stammzellen als Ersatz für Spermien für den Aufbau von halbgeklonten Embryonen zu demonstrieren.

Anwendung von Maus parthenogenetischen Haploid embryonalen Stammzellen als Ersatz für Sperma

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

application-mouse-parthenogenetic-haploid-embryonic-stem-cells-as

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

4.5K Aufrufe.  ETH Zurich. Dieser Artikel zielt darauf ab, die Verwendung von parthenogenetischen haploiden embryonalen Stammzellen als Ersatz für Spermien für den Aufbau von halbgeklonten Embryonen zu demonstrieren.

Serie: Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

Ableitung von Herzvorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Serum-freiem Monolayer-Kultur

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often located distally from the regulated gene in intergenic regions or even within the body of another gene. The position independent nature of enhancer activity makes it difficult to match enhancers with the genes they regulate. Deletion of an enhancer region provides direct evidence for enhancer activity and is the gold standard to reveal an enhancer's role in endogenous gene transcription. Conventional homologous recombination based deletion methods have been surpassed by recent advances in genome editing technology which enable rapid and precisely located changes to the genomes of numerous model organisms. CRISPR/Cas9 mediated genome editing can be used to manipulate the genome in many cell types and organisms rapidly and cost effectively, due to the ease with which Cas9 can be targeted to the genome by a guide RNA from a bespoke expression plasmid. Homozygous deletion of essential gene regulatory elements might lead to lethality or alter cellular phenotype whereas monoallelic deletion of transcriptional enhancers allows for the study of cis-regulation of gene expression without this confounding issue. Presented here is a protocol for CRISPR/Cas9 mediated deletion in F1 mouse embryonic stem (ES) cells (Mus musculus129 x Mus castaneus). Monoallelic deletion, screening and expression analysis is facilitated by single nucleotide polymorphisms (SNP) between the two alleles which occur on average every 125 bp in these cells.

Experimental validation of enhancer activity is best approached by loss-of-function analysis. Presented here is an efficient protocol that uses CRISPR/Cas9 mediated deletion to study allele-specific regulation of gene transcription in F1 ES cells which contain a hybrid genome (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Generieren von CRISPR / Cas9 Mediated monoallelic Löschungen Enhancer-Funktion in embryonalen Stammzellen der Maus zu studieren

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated by transcription factors which bind genomic regulatory regions including enhancers and promoters of cardiac constitutive genes. DNA is wrapped around histones that are subjected to chemical modifications. Modifications of histones further lead to repressed, activated or poised gene transcription, thus bringing another level of fine tuning regulation of gene transcription. Embryonic Stem cells (ES cells) recapitulate within embryoid bodies (i.e., cell aggregates) or in 2D culture the early steps of cardiac development. They provide in principle enough material for chromatin immunoprecipitation (ChIP), a technology broadly used to identify gene regulatory regions. Furthermore, human ES cells represent a human cell model of cardiogenesis. At later stages of development, mouse embryonic tissues allow for investigating specific epigenetic landscapes required for determination of cell identity. Herein, we describe protocols of ChIP, sequential ChIP followed by PCR or ChIP-sequencing using ES cells, embryoid bodies and cardiac specific embryonic regions. These protocols allow to investigating the epigenetic regulation of cardiac gene transcription.

A fine tuning regulation of gene transcription underlies embryonic cell fate decision. Herein, we describe chromatin immunoprecipitation assays used to investigate epigenetic regulation of both cardiac differentiation of stem cells and cardiac development of mouse embryos.

Epigenetische Regulation der Herz Differenzierung von embryonalen Stammzellen und Gewebe

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

Isolierung von murinen embryonalen Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

Die Herstellung von pluripotenten Stammzellen aus Maus Fruchtwasserzellen ein Transposon-System verwenden

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

Horizontale Ganze Mount: Ein neuartiges Verarbeitungs- und Imaging-Protokoll für dickes, dreidimensionales Gewebequerschnitt der Haut

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Computergestützte Analyse der Keimbahn Caenorhabditis Elegans , die Verteilung der Kerne, Proteine und das Zytoskelett zu studieren

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

In vitro-Generation der Somiten Derivate aus menschlichen induzierten Zellen pluripotenten Stammzellen

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous transplants to treat hematological and malignant disorders. Hemogenic endothelium (HE) is an amenable platform to produce functional HSPCs by transcription factors or to induce lymphocytes in a robust manner. However, current methods to derive HE are either costly or variable in yield. In this protocol, we established a cost-effective and precise method to derive HE within 4 days in a feeder- and xeno-free defined condition. The resultant HE underwent an endothelial-to-hematopoietic transition and produced CD34+CD45+ clonogenic hematopoietic progenitors. The potential capacity of our platform for generating functional HSPCs will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Here, we present a protocol to precisely form hemogenic endothelium from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free condition. This method will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Hämogene Endotheldifferenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen in einem feeder- und xenofreien definierten Zustand

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...