우리는 phaESC 라인의 파생 에 대한 줄리오 디 미닌 박사와 유동 세포 측정 작업에 대한 박사 레모 프레이만 감사합니다. 우리는 또한 미켈 레 샤프너 씨와 토마스 M. 헤네크 씨가 배아 전이와 기술 지원을 인정합니다. 이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (보조금 31003A_152814/1)에 의해 지원되었다.

<ol>
	<li>Ellegren, H., Galtier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+genetic+diversity.">Determinants of genetic diversity.</a> Nature Reviews: Genetics. 17 (7), 422-433 (2016).</li><li>Huijbers, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+genetically+modified+mice:+A+decision+guide.">Generating genetically modified mice: A decision guide.</a> Methods in Molecular Biology. 1642, 1-19 (2017).</li><li>Aizawa, E., Dumeau, C. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+bimaternal+and+bipaternal+mice+from+hypomethylated+haploid+ESCs+with+imprinting+region+deletions.">Generation of bimaternal and bipaternal mice from hypomethylated haploid ESCs with imprinting region deletions.</a> Cell Stem Cell. 23 (5), 665-676 (2018).</li><li>Elling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+maintenance+of+mouse+haploid+embryonic+stem+cells.">Derivation and maintenance of mouse haploid embryonic stem cells.</a> Nature Protocols. 14 (7), 1991-2014 (2019).</li><li>Ran, F. 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H., Alberio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+the+genome:+role+of+the+cell+cycle.">Reprogramming the genome: role of the cell cycle.</a> Reproduction Supplement. 61, 477-494 (2003).</li><li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-mediated+genetic+screening+in+mice+with+haploid+embryonic+stem+cells+carrying+a+guide+RNA+library.">CRISPR-Cas9-mediated genetic screening in mice with haploid embryonic stem cells carrying a guide RNA library.</a> Cell Stem Cell. 17 (2), 221-232 (2015).</li><li>Bai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genetic+screening+in+mice+through+haploid+embryonic+stem+cells+identifies+critical+genes+in+bone+development.">Targeted genetic screening in mice through haploid embryonic stem cells identifies critical genes in bone development.</a> PLoS Biology. 17 (7), 3000350 (2019).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-mediated+base-editing+screening+in+mice+identifies+DND1+amino+acids+that+are+critical+for+primordial+germ+cell+development.">CRISPR-Cas9-mediated base-editing screening in mice identifies DND1 amino acids that are critical for primordial germ cell development.</a> Nature Cell Biology. 20 (11), 1315-1325 (2018).</li></ol>

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체세포 핵 전달(SCNT)에 의한 포유류 복제는1990년대,20,21년에개척되었다. 이러한 발전은 30년 전에 양서류22에서실시한 복제 연구를 따랐다. 상당한 지연은 포유류에서 배아학 및 게놈 각인의 어려움을 반영합니다. 포유류 SCNT의 발달은 이 프로토콜에 상세히 기술된 정액을 대체하기 위한 haESC의 적용을 위한 기초입니다.
세포 주기 동기화는 SCNT23의성공을 위한 중요한 요소입니다. 이것은 또한이 프로토콜에서 haESC의 주입에 대 한 경우. 기증자 게놈을 수령인으로 도입하려면 배아 발달을 중단하는 염색체 파손 또는 골수 계수를 피하기 위해 세포 주기 단계가 일치하도록 요구합니다. 반 클로닝은 두 개의 게놈과 세포 세포가 호환되어야 한다는 추가복잡성을 가지고 있습니다. 이전 보고서는 M-phase 체포 및 rorogenetic haESC의 주입이 난모세포7에G1 상 haESCs의 주입 보다는 반 복제된 태아의 더 나은 발달 비율을 산출했다는 것을 보여주었습니다. 이 보고서는 M-phase를 반 복제에 적합한 동기화 지점으로 제안합니다. 이에 따라, phaESC는 미토티컬디드 디메콜신과 메타단계에서 체포되어 MII 난우세포의 난소에 주입되었으며, 이는 메이오증의 메타페이오 II에서 자연적으로 체포되었다. 중요한 것은, M-위상 체포는 기증자와 수령인 세포 주기 사이 우수한 동기화를 제공하는 고효율마우스 ESC에서 달성될 수 있습니다.
미토시스 동안 핵막이 분해되고 복제된 염색체가 부착되는 스핀들 형태가 형성됩니다. M-phase DKO-phaESC를 주입한 후, 자매 크로마티드는 의사 극체와 zygote7(그림 3E)으로분리된다. 따라서 DKO-phaESC의 단일 염색체 세트는 반 복제 된 배아에 기여합니다. DKO-phaESC 염색체의 자매 크로마티드는 주사 후에 정확하게 분리될 수 있다는 것이 중요합니다. 손상되지 않은 DKO-phaESC의 플라즈마 멤브레인은 의사 극성 체체로의 분리를 방지합니다. 우리는 실제로 DKO-phaESC의 혈장 막이 파열되지 않은 드문 경우를 관찰했고, 배아는 주입 후 ooplasm에서 그대로 DKO-phaESC를 나타냈다(도 3D). 따라서, 파이프팅에 의해 DKO-phaESC의 플라즈마 멤브레인을 제거하기 위해주의를 기울여야한다. 주입 하는 동안, 염색체의 메이 오 틱 스핀들의 중단을 방지 하 고 염색체 분리 결함으로 이어질 수 있는 동등 하 게 중요 한 결과 뿐만 아니라 aneuploidy를 유도.
포유류에서, 게놈 각인은 정액 보충으로 phaESCs의 적용을 제한합니다. Parthenogenetic haESCs는 유전체 각인의 모계 구성을 소유, 정자는 아버지 구성을 소유 하는 반면. 따라서, 전체 기간 새끼의 생성은 정자 대체로 야생 형 phaESC의 주입 후 발생하지 않았습니다. 이러한 제한을 극복하기 위해 IG및 H19-DMC의삭제는 phaESC에서 설계됩니다. 모계 Igf2-H19 및 Gtl2-Dlk1 loci에서 각인된 발현의 변형은 전송된 2세포 배아에 기초하여 5.1% 이상의 주파수를 가진 반 복제된 마우스의 생성을 허용하기 위한 게놈 각인물의 구성을 바꾸기에 충분하다. 이러한 관찰은 2개의 각인된 유전자를 표적으로 하는 것이 마우스에 있는 정액을 대체할 수 있는 기능적인 아버지 구성으로 phaESCs의 게놈을 전환한다는 것을 건의합니다. 그럼에도 불구 하 고, phaESCs의 영구적인 유전 수정이 전략에 대 한 필요. 대체 전략으로, 및 유전 적 haESC를 고려할 수 있습니다. Androgenetic haESCs는 정자 게놈에서 파생되고 친자 각인을 가지고 있습니다. 야생형 및 유전적 haESC가 정자 대체품으로 기여하여 전이 배아4,7,24의1.3%와 1.9%의 주파수에서 전체 기간새끼를생성하는 데기여했다는보고가 있었습니다. 전체 기간 새끼는 또한 IG의삭제와 함께 및 rorogenetic haESC를 주입하여 얻어졌습니다 - 및 H19-DMRs의주파수에서 20.2% 전송된 2 세포 배아24. 각인이 배양에서 불안정해질 수 있기 때문에 변형된 안드로유전학 적 haESC를 사용하여 반 복제의 효율성이 증가할 가능성이 높습니다. 각인 결함은 중요한 DMR의 유전 적 삭제에 의해 수정됩니다.
난소 또는 정자 게놈에 직접 유전자 변형을 도입하는 어려움을 고려, haESCs는 별도로 부모 게놈을 조작하기위한 가치있는 도구입니다. 정자의 대체로 haESCs를 사용하는 것은 마우스 생식선에서 게놈 편집을위한 놀라운 이점을 제공합니다. 최근 연구는 CRISPR/Cas9 기반 게놈 편집을 배아 발달에 중요한 각각기 영역의 특성화를 위한 haESC의 적용과결합했다(12). 이 연구는 Bi임산부 마우스의 발달에서 H19-및IG-DMR과 병용으로 Rasgrf1-DMR의역할을 분석하고, 양성쥐의 발달에 있어 7가지 DMRs의 기능을 분석하였다. 정자에 대한 haESC를 대체하는 방법은 원시 세균 세포 발달에서 DND1 단백질 내의 주요 아미노산을 식별하고 뼈발달24,25,26에서유전자를 식별하기 위한 유전자 스크리닝 접근법의 기초를 형성하였다. 배아 발달의 주요 요인을 확인하기 위한 게놈 각인 및 유전 검열에 대한 연구는 게임 게놈으로 haESCs의 적용을 위한 상당한 접근입니다.

포유류에서, gametes는 차세대로 유전 정보를 전송하는 유일한 세포입니다. 오키트와 정자의 융합은 성인 동물로 발전하는 디플로이드 zygote를 형성합니다. 게임성 게놈의 돌연변이는 자식에 의해 상속되고 종1의유전적 변이를 유도한다. 생식선에 돌연변이의 도입은 유전자 기능 및 질병 모델링의 특성화를 포함하여 다양한 생물학적 연구를 위해 유전자 변형 동물을 생산하기 위해 적용되었습니다. 난모세포와 정자 는 모두 말기 분화 하 고 증식을 중단 한 고도로 전문화 된 세포. 따라서 게임테를 직접 수정하는 것은 기술적으로 어렵고 전문적인 접근 방식이 개발되었습니다. 유전자 변형은 유전자 변형 된 ESC를 발아 세포로 주입하여 마우스 세균에 도입 될 수 있으며, 여기서 개발 배아에 통합되어 생식선을 식민지화할 수 있습니다. 또한 CRISPR/Cas9 시스템을 포함한 게놈 편집 접근법을 이용한 zygotes의 유전자 변형이 널리 채택되고있다 2.
최근에는 게임게놈3,4,5,6,7,8을대체할 수 있는 haESC를 적용하는 뛰어난접근법이보고되었다. HaESCs는 파르테노유전학 또는 및 rorogenetic haploid blastocysts의 내부 세포 질량에서 파생된 줄기 세포주이며 염색체4,7,9,10의단일 세트를 소유한다. 파르테노유전학과 안드로유전학 적 haESCs 모두 난모세포로 내트라토플라스믹 주입 후 반 복제 된 마우스의 게놈에 기여할 수 있음을 입증되었습니다. 다른 접근법과는 달리, haESCs의 게놈은 자기 갱신 능력 때문에 배양에서 직접 수정될 수 있습니다. 정자를 haESCs로 대체하여 생식선에 유전자 변형을 도입하는 것은 생물학적 연구를위한 중요한 방법입니다. 그것은 개별적으로 문화를 제공하고 각각 parthenogenetic 또는 androgenetic haESCs에서 파생되는 모계 또는 친자 게놈을 조작할 가능성을 제공합니다. HaESCs는 그 때 유전체 각인, 진상성 표현 및 부모 특정 프로세스의 연구 결과에 특히 유리한 게임 게놈 대체로 이용될 수 있습니다.
마우스에서는 정상적인 배아발달(11)에모계 및 친자 게놈 정보가 모두 요구된다. 따라서, 전체 기간 새끼는 야생형 파르테노유전학 적 haESC(phaESC)가 정자 게놈5,8을대체하기 위해 주입되었을 때 얻을 수 없었다. 발달 블록을 극복하기 위해, 파르테노유전학 적 haESCs의 모계 게놈의 게놈 각인은 아버지 구성으로 교정될 필요가 있다. 이는 차별화된 메틸화된 영역(DM)을 조작하여 달성할 수 있다. 현재까지 H19-DMR, Gtl2-Dlk1 IG-DMR및 Rasgrf1-DMR의표적 삭제는 phaESC3,5,8,12에서모성 발현 유전자를 억압하기 위해 연구되었다. 이러한 연구는 H19-DMR과 IG-DMR모두의 삭제가 정자 염색체를 대체할 수 있는 친자 각인 구성으로 모계를 변환하기에 충분하다는 것을 보여주었습니다. 두 DMR 삭제를 난피세포로 운반하는 phaESC의 내트라피토프라진 주사는 전송된 2세포 배아의 5.1%와 15.5% 사이의 주파수를 가진 반 복제 새끼를 산출하였다.
이 프로토콜은 H19-DMR과 IG-DMR모두의 삭제와 phaESC의 응용 프로그램을 기반으로하며, 이는 이중 녹아웃 phaESC (DKO-phaESC)를 용어. 우리는 DKO-phaESC 라인을 확립하기 위해 phaESC에서 게놈 각인의 수정에 대한 자세한 지침을 제공합니다, 정자 게놈의 대용으로 난동구에 DKO-phaESC의 주입, 배반 복제 배아의 배양에 대한, 및 반 복제 된 마우스를 얻기위한. 이 프로토콜은 친자 게놈의 정확하고 직접적인 조작을 필요로 하는 연구원을 위한 참고및 반 복제된 태아 및 마우스의 생성입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mLTube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 125.150</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150628</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M6250</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA fraction</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-037</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR 99021</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1386</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Demecolcine solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D1925</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM / F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DR4 mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>3208</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>E5134</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>biowest</td>
			<td>S1810-500</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium</td>
			<td>amsbio</td>
			<td>11897</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G1890</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irradiated MEF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A34966</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF (Leukemia inhibitory factor)</td>
			<td>(Homemade)</td>
			<td>-</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofection reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NDiff 227</td>
			<td>Takara</td>
			<td>Y40002</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD 0325901</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1408</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piggyBac plasmid carrying a CAG-EGFP transgene</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#40973</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piggyBac transposase plasmid</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>PB210PA-1</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pX330 plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#42230</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pX458 plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#48138</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F549S</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0192</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100317</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>109634</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Axon</td>
			<td>A3830</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71729</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer</td>
			<td>Epeendorf</td>
			<td>5384000012</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Tube with cell strainer cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo Astrios EQ</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B25982</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.1640</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-gauge 1/2 inch needle</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z192362-100EA</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6D2F1 mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>100006</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCG</td>
			<td>MSD animal health</td>
			<td>49451</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010015</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG</td>
			<td>Avivasysbio</td>
			<td>OPPA1037 5000 IU</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-cm dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179830</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Center-well dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3260</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital rocker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88880020</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0878</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H4272</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOM</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MR-020P-5F</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M16 medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7292</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7167</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M8410</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P1049-1PAK</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strontium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>13909</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml syringe</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.5607</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass cappilary</td>
			<td>Science product</td>
			<td>GB100T-8P</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTram 4r Oil</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5196000030</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorinert FC-770</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F3556</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding pipette</td>
			<td>BioMedical Instruments</td>
			<td>-</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti-U</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-900</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection pipette</td>
			<td>BioMedical Instruments</td>
			<td>-</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlaoder tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5252 956.003</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulaor arms</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>NT-88-V3</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PiezoXpert</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5194000016</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVP (Polyvinylpyrrolidine)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>PVP360</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of mouse parthenogenetic haploid embryonic stem cells as a substitute of sperm

성적 번식을 가진 유기체에서, 생식 세포는 새로운 개별으로 발전하는 강성 성 세포의 근원입니다. 마우스에서는 정자에 의한 난미세포의 수정은 완도성 zygote를 만듭니다. 최근, 몇몇 간행물은 haploid 배아 줄기 세포 (haESCs)가 게임 게놈을 대체하고 마우스로 발전하는 태아에 기여할 수 있다는 것을 보고했습니다. 여기서, 우리는 난모세포로 내트라토플라스믹 주입에 의해 배아를 구성하는 정액의 대용품으로 parthenogenetic haESCs를 적용하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 정자 대체로 haESCs를 준비하고, 하ESC 염색체를 난모세포로 주입하고, 반 복제 된 배아의 문화를위한 단계로 구성됩니다. 배아는 배아 전달 후에 비옥한 반 복제 마우스를 산출할 수 있습니다. 정자 교체로 haESC를 사용하면 생식선에서 게놈 편집, 배아 발달 연구 및 게놈 각인에 대한 조사가 용이합니다.

이 프로토콜의 목적은 반 복제 배아와 마우스를 얻기 위해 정자의 대체로 haESCs를 적용하는 것입니다. 이를 위해, CAG-EGFP 트랜스진을 운반하는 DKO-phaESC 라인이 생성되어 MII 난모세포로 의 내트라토플라스믹 주입에 사용되었다. 친자 각인 구성으로 적합한 phaESC 라인을 얻기 위해 Cas9 뉴클레아제를 사용하여 유전 공학을 수행했습니다. haploid ESC 라인은 디플로이드 에대한 고유의 경향으로 인해 발생하는 haploid 및 디플로이드 세포를 함유하고있다 10. haploid 염색체 세트는 정액 게놈의 성공적인 교체를 위한 전제 조건입니다. 혈류 세포측정에 의한 DNA 함량 분석은 G0/G1-, S-및 G2/M-phases(그림2A)에서haploid 및 디플로이드 세포의 분포를 나타낸다.
DKO-phaESC 라인을 확립하기 위해 야생형 phaESC 라인은 안정적인 형질 전환 EGFP 발현을 위해 돼지박 트랜스포슨 구조와 H19및 IG-DMR의 삭제를 얻기 위한 CRISPR/Cas9 플라스미드로 전염되었습니다. DIPLOID ESC를 제외하고 EGFP를 표현하는 haploid ESC만 격리하기 위해 특정 정렬 게이트가 정의되었습니다(그림2A). 단일 haploid EGFP 양성 세포는 그 때 서브 클론을 얻기 위하여 96 웰 플레이트의 개별 우물로 도금되었다. MEF 피더는 트랜스페드 phaESC의 도금 효율 및 생존을 증가시키기 위해 사용되었다. 배양의 확장 후, PCR에 의해 초기 지노티핑 라운드가 수행되어 두 DMR의 삭제를 수행하는 하위 클론을 식별했습니다. MEF 피더가 배양에서 제거된 후, H19에서야생형 송계의 부재를 확인하기 위해 두 번째 유전자를 수행하였다- 및 IG-DMR(도2B). 총 135개의 서브 클론에서, 우리는 삭제된 송계를 운반하고 H19-DMR과IG-DMR 둘 다의 야생형 송계유전자가 없는 5haploid DKO-phESC 라인을 획득했습니다.
CAG-EGFP 트랜스진은현미경(그림 3A)에따라 녹색 형광의 시각화에 의한 반 복제 배아에 대한 기여를 연구하기 위해 DKO-phaESC에 도입되었다. 인트라토플라스혈 주사를 위해 DKO-phaESCs는 M-단계에서 그들을 체포하기 위해 데메콜신으로 치료되었습니다. 따라서, DKO-phaESC의 세포 주기는 MII 난모세포의 세포와 동기화되었다. 유동 세포측정 분석은 디메콜신(도3B)으로치료한 후 G2/M 상 체포 된 haploid (2n) 및 디플로이드 세포 (4n)에 해당하는 2명의 인구를 나타냈다. 1n haploid 피크의 부재는 세포 주기 체포가 크게 완료되었다는 것을 표시했습니다. M-위상 haploid ESC는 그 때 분류되고 난모세포로 주입되었습니다. 이를 위해, 단일 DKO-phaESC는 마이크로주입 파이펫에 적재되어 MII oocyte(그림3C)의세포질에 주입되었다. DKO-phaESC의 플라즈마 멤브레인은 미세 주입 파이펫의 끝으로 피펫을 주입하여 파열되었다.
주사 후, EGFP 발현은 DKO-phaESCs의 세포질이 난낭의 큰 세포질에 분산되었기 때문에 생성된 반 복제 배아에서 거의 검출되지않았다(도 3D). 드문 경우, 강렬한 EGFP 발현의 둥근 반점이 옴플라스내에서 관찰될 수 있다. 이 관찰은 손상되지 않은 DKO-phaESC의 부주의한 주입에 의해 발생했을 가능성이 있습니다. DKO-phaESC 세포막을 파열하지 않는 것은 추가 배아 발달과 호환되지 않을 가능성이 있으며 피해야한다. 주사 후 1시간 후, 배아는 염화염산염18로 치료에 의해 활성화되었다. 활성화개시 후 6시간 후,현미경(도 3E)하에서최대 3개의 극성 체체가 관찰되었다. 이러한 극지 체는 DKO-phaESC7으로부터난마세포 및 의사 극체의 제1 및 제2 극성 체에 해당한다. 또한, 2개의 프로핵은 정자와 정상 수정 후 zygotes의 프로핵 단계를 닮은 차동 간섭 대조 현미경의 밑에 관찰되었다.
발달 능력을 입증하기 위해 반 복제 된 배아는 배아 단계(그림 5A)로배양되었습니다. 더욱이, 전기 마우스는 반복제된 2세포 단계 배아를 받는 여성의 oviducts(도5B)로이송한 후 수득하였다. 예상대로, 반 복제 된 배아에서 파생 된 마우스는 난모세포나 난모세포 유래 phaESC가 Y 염색체를 운반하지 않는 여성이었다. 반 복제 된 마우스는 매우 정상이었고 야생 형 스위스 웹스터 남성과 짝을 이면 건강한 자손을 생산했습니다. 지금까지, 반 복제 된 마우스는 명백한 건강 문제없이 600 일 이상 살아있다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig01v3.jpg"> 그림 1: 정자 대체로 DKO-phaESC의 적용에 대한 개요. (A)프로토콜의 절차의 시간 프레임. (B)이 계획은 DKO-phaESC 선(1~6단계)을 설정하는 단계를 보여줍니다. (C)이 계획은 MiI oocyte(단계 7-14)로 DKO-phaESC의 내트라피토프라증 주입에 의해 반 복제 배아를 구성하는 단계를 보여줍니다. 약어: DKO = 더블 녹아웃; phaESC = 부분 유전 적 haploid 배아 줄기 세포; FACS = 형광 활성화 셀 분류; MEF = 마우스 배아 섬유아세포. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig02v2.jpg"> 그림 2: CrispR/Cas9 매개 삭제 - 및 IG-DMRs에 의해 DKO-phaESC 라인의 설립. (A)안정적인 EGFP 발현을 위한 피기박 플라스미드와 4개의 CRISPR/Cas9 플라스미드를 통해 피기박 플라스미드로 트랜스포메이션한 후 phaESC의 유동 세포측정 분석. 비트랜스감염 된 phaESC는 대조군으로 표시됩니다. DNA 프로파일(상단)은 haploid 및 diploid 세포의 세포 주기 분포를 나타낸다. EGFP를 발현하는 G1/S상 haploid 세포는 녹색 게이트(아래쪽, 오른쪽)에 의해 표시됩니다. (B)MEFs(제1 기형)에서 재배된 phaESC 서브 클론의 지노티핑과 MEFs(제2 기형)의 제거 후. 서브 복제 된 phaESC 라인 1, 2, 3 및 4는 야생 형 세포, H19-DMR 삭제, IG-DMR 삭제 및 결합 된 H19- 및 IG-DMR삭제를 각각 나타냅니다. DKO-phaESC 라인 5-8H19-DMR및 IG-DMR삭제를 모두 소유 하 고 야생 형 알 것에서 무료입니다. 약어: DKO = 더블 녹아웃; phaESC = 부분 유전 적 haploid 배아 줄기 세포; DMR = 차별화된 메틸화 영역; MEF = 마우스 배아 섬유아세포; EGFP = 향상된 녹색 형광 단백질; WT = 야생형. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig03v3.jpg"> 그림 3: Mitotically 체포 된 DKO-phaESC를 MII 난미세포로 주입합니다. (a) H19-및 IG-DMR의 CAG-EGFP 유전자 및 삭제를 전달하는 DKO-phaESC 배양의 형태; 스케일 바 = 50 μm.(B)디메콜신 처리 없이 데메콜신으로 체포된 후 DKO-phaESC의 대표적인 유동 세포 분석이 대조군으로 나타났다. (C)미세 주입 파이펫에서 DKO-phaESC의 형태. 파이펫팅에 의해 플라즈마 멤브레인을 파열하기 전(왼쪽) 및 후(오른쪽) 단일 손상형 DKO-phaESC가 도시되어 있다. 스케일 바 = 20 μm.(D)MII 난모세포에 DKO-phaESC를 주입 한 후 1 h에서 배아를 구성. EGFP 형광 및 밝은 필드의 병합 된 이미지가 표시됩니다. 검은 색 화살촉은 피할 수 있어야 하는 손상되지 않은 DKO-phaESC를 주입한 후 강렬한 EGFP 발현의 둥근 반점을 나타냅니다. 스케일 바 = 50 μm.(E)스트론튬 염화물로 활성화가 개시된 후 6h 반 복제 배아의 차동 간섭 대비 이미지가 나타났다. 백색 화살촉은 주입된 DKO-phaESC에서 1개의 의사 극성 바디를 포함하여 3개의 극성 바디를 가진 배아를 표시합니다; 스케일 바 = 50 μm. 약어: DKO = 더블 녹아웃; phaESC = 부분 유전 적 haploid 배아 줄기 세포; EGFP = 향상된 녹색 형광 단백질. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig04.jpg"> 그림 4: DKO-phaESCs를 난마세포로 주입하기 위한 설치 방식. (A)사출 피펫, 홀딩 파이펫 및 사출 챔버내 의 난미가 나타난다. α, 미세 주입 파이펫의 각도를 구부립니다. (B)내트라토플라스솜 주사를 위한 미세 조작 접시에 방울의 레이아웃. 약어: DKO = 더블 녹아웃; phaESC = 부분 유전 적 haploid 배아 줄기 세포. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig05.jpg"> 그림 5: 반 복제 된 배아의 개발. (A)시험관내 반 복제 배아의 사전 이식 개발. EGFP 발현은 처음에 4세포 배아에서 관찰된다 2 일째 에 트라이토플라스믹 주사 후. 4일째에, 강렬한 EGFP 발현은 배반구체에서 관찰될 수 있다; 스케일 바 = 100 μm.(b)2세포 배아 전달 후 얻어진 반 복제 마우스가 받는 사람에게 전달된다. 74 dpp에서, 반 복제 마우스 (화살표 머리)는 야생 형 스위스 웹스터 남성과 짝짓기 후 자연 출생에 의해 그녀의 첫 번째 새끼 (별표)를 전달했다. 이 그림에 나타난 반 복제 배아 및 반 복제 된 마우스는 Aizawa 외3에서보고된 것과 동일합니다. 약어: EGFP = 향상된 녹색 형광 단백질; .dpp, 일 산후. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4">젤라틴 솔루션</td>
		</tr><tr><td>구성 요소</td>
			<td>재고 농도</td>
			<td>볼륨/무게</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr><tr><td>물</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>젤라틴</td>
			<td>-</td>
			<td>1 g</td>
			<td>0.2%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Haploid 배아 줄기 세포 (HaESC) 배지</td>
		</tr><tr><td>구성 요소</td>
			<td>재고 농도</td>
			<td>볼륨/무게</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr><tr><td>NDiff 227</td>
			<td>-</td>
			<td>10mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>CHIR 99021</td>
			<td>10mM</td>
			<td>3 μL</td>
			<td>3 μM</td>
		</tr><tr><td>PD 0325901</td>
			<td>10mM</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>1 μM</td>
		</tr><tr><td>LIF</td>
			<td>1 x 106 IU/mL</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>1,000 IU/mL</td>
		</tr><tr><td>페니실린-연쇄절제술</td>
			<td>100x</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">HaESC 유지 보수 버퍼</td>
		</tr><tr><td>구성 요소</td>
			<td>재고 농도</td>
			<td>볼륨/무게</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr><tr><td>HaESC 매체</td>
			<td>-</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>HEPES 솔루션</td>
			<td>1 M</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>20mM</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">세척 버퍼</td>
		</tr><tr><td>구성 요소</td>
			<td>재고 농도</td>
			<td>볼륨/무게</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr><tr><td>DMEM / F-12</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>BSA 분획</td>
			<td>7.5%</td>
			<td>7.1 mL</td>
			<td>0.5%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">MEF 배지</td>
		</tr><tr><td>구성 요소</td>
			<td>재고 농도</td>
			<td>볼륨/무게</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr><tr><td>DMEM</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>FBS</td>
			<td>-</td>
			<td>56 mL</td>
			<td>10%</td>
		</tr><tr><td>β-메르카포에탄올</td>
			<td>14.3 몰/L</td>
			<td>3.9 μL</td>
			<td>100 μM</td>
		</tr><tr><td>페니실린-연쇄절제술</td>
			<td>100x</td>
			<td>5.6 mL</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">리시스 버퍼</td>
		</tr><tr><td>구성 요소</td>
			<td>재고 농도</td>
			<td>볼륨/무게</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr><tr><td>물</td>
			<td>-</td>
			<td>8.25 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>트리스-HCl (pH 8.5)</td>
			<td>1 M</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>100mM</td>
		</tr><tr><td>EDTA</td>
			<td>0.5M</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr><tr><td>SDS 솔루션</td>
			<td>10%</td>
			<td>200 μL</td>
			<td>0.2%</td>
		</tr><tr><td>나Cl</td>
			<td>5M</td>
			<td>400 μL</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr><tr><td>프로틴아제 K</td>
			<td>20 mg/mL</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>100 μg/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">활성화 매체</td>
		</tr><tr><td>구성 요소</td>
			<td>재고 농도</td>
			<td>볼륨/무게</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr><tr><td>KSOM</td>
			<td>-</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>염화 스트론튬</td>
			<td>1 M</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr><tr><td>EGTA</td>
			<td>0.5M, pH 8.0</td>
			<td>4 μL</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">PVP 솔루션</td>
		</tr><tr><td>구성 요소</td>
			<td>재고 농도</td>
			<td>볼륨/무게</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr><tr><td>M2 매체</td>
			<td>-</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>PVP</td>
			<td>-</td>
			<td>0.6 g</td>
			<td>12%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">PMSG 솔루션</td>
		</tr><tr><td>구성 요소</td>
			<td>재고 농도</td>
			<td>볼륨/무게</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr><tr><td>PBS</td>
			<td>-</td>
			<td>450 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>PMSG</td>
			<td>500 IU/mL</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>50 IU/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">hCG 솔루션</td>
		</tr><tr><td>구성 요소</td>
			<td>재고 농도</td>
			<td>볼륨/무게</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr><tr><td>PBS</td>
			<td>-</td>
			<td>450 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>hCG</td>
			<td>500 IU/mL</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>50 IU/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">히알루로니다제 배지</td>
		</tr><tr><td>구성 요소</td>
			<td>재고 농도</td>
			<td>볼륨/무게</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr><tr><td>M2 매체</td>
			<td>-</td>
			<td>380 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>히알루로니다제</td>
			<td>10 mg/mL</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>0.5 mg/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">약어: LIF = 백혈병 억제 인자; MEF = 마우스 배아 섬유아세포;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">FBS = 태아 소 혈청; DMEM = 덜벡코의 수정된 독수리 매체; BSA = 소 세럼 알부민;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">EDTA = 에틸렌디아민테트라아세산; SDS = 도데킬술페이트 나트륨; EGTA = 에틸렌 비스 (옥시에틸렌니틸로)테트라아세트산;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">PBS = 인산염 완충식식염; PVP = 폴리 비닐피롤리돈; hCG = 인간 융기 생식선 호르몬;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">PMSG = 임신 한 마레 혈청 생식샘 호르몬.</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 중간, 버퍼 및 솔루션 레시피입니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>이름</td>
			<td colspan="2">시퀀스(5' ~ 3')</td>
			<td>신청</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P1</td>
			<td colspan="2">GTG GTT AGT TCT ATA TGG GG</td>
			<td>지노티핑</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P2</td>
			<td colspan="2">AGA TGG GGT CAT TCT TTT CC</td>
			<td>지노티핑</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P3</td>
			<td colspan="2">TCT TAC AGT CTG GTC TTG GT</td>
			<td>지노티핑</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P1</td>
			<td colspan="2">TGT GCA GCA GCA AAG CTA AG</td>
			<td>지노티핑</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P2</td>
			<td colspan="2">CCA CAA AAA CCT CCC TTT CA</td>
			<td>지노티핑</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P3</td>
			<td colspan="2">ATA CGA TAC GGC AAC CAA CG</td>
			<td>지노티핑</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA1-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCA TGA ACT CAG AAG AGA CTG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA1-R</td>
			<td colspan="2">AAA CCA GTC TCT TCT 개그 TTC ATG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA2-F</td>
			<td colspan="2">CAC CAG GTG 아가 ACC ACT GCT 개그</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA2-R</td>
			<td colspan="2">AAA CCT CAG CAG TGG TTC TCA CCT</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA1-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCG TAC AGA GCT CCA TGG CAC</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA1-R</td>
			<td colspan="2">AAA CGT GCC ATG 개그 CTC TGT ACG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA2-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCT GCT 태그 AGG TAC TAC GCT</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA2-R</td>
			<td colspan="2">AAA CAG CGT AGT ACC TCT AAG CAG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 올리고뉴클레오티드 목록.

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Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

이 문서는 반 복제 배아의 건설을 위한 정액을 대신하기 위하여 parthenogenetic haploid 배아 줄기 세포의 사용을 입증하는 것을 작정입니다.

정자의 대체로 마우스 파르테노유전학 Haploid 배아 줄기 세포의 응용 프로그램

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

application-mouse-parthenogenetic-haploid-embryonic-stem-cells-as

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

4.5K 조회수.  ETH Zurich. 이 문서는 반 복제 배아의 건설을 위한 정액을 대신하기 위하여 parthenogenetic haploid 배아 줄기 세포의 사용을 입증하는 것을 작정입니다.

비디오: Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

배아 줄기 세포에서 심장 전구 세포의 유도

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

연구

발생학

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

혈청이없는 단층 문화 마우스 배아 줄기 세포의 신경 분화

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often located distally from the regulated gene in intergenic regions or even within the body of another gene. The position independent nature of enhancer activity makes it difficult to match enhancers with the genes they regulate. Deletion of an enhancer region provides direct evidence for enhancer activity and is the gold standard to reveal an enhancer's role in endogenous gene transcription. Conventional homologous recombination based deletion methods have been surpassed by recent advances in genome editing technology which enable rapid and precisely located changes to the genomes of numerous model organisms. CRISPR/Cas9 mediated genome editing can be used to manipulate the genome in many cell types and organisms rapidly and cost effectively, due to the ease with which Cas9 can be targeted to the genome by a guide RNA from a bespoke expression plasmid. Homozygous deletion of essential gene regulatory elements might lead to lethality or alter cellular phenotype whereas monoallelic deletion of transcriptional enhancers allows for the study of cis-regulation of gene expression without this confounding issue. Presented here is a protocol for CRISPR/Cas9 mediated deletion in F1 mouse embryonic stem (ES) cells (Mus musculus129 x Mus castaneus). Monoallelic deletion, screening and expression analysis is facilitated by single nucleotide polymorphisms (SNP) between the two alleles which occur on average every 125 bp in these cells.

Experimental validation of enhancer activity is best approached by loss-of-function analysis. Presented here is an efficient protocol that uses CRISPR/Cas9 mediated deletion to study allele-specific regulation of gene transcription in F1 ES cells which contain a hybrid genome (Mus musculus129 x Mus castaneus).

생성 CRISPR은 / Cas9 중재 Monoallelic 삭제할 경우는 마우스 배아 줄기 세포의 증강 기능을 연구하는

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

쥐 배아 Hemogenic 내피 세포의 분리

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

트랜스포존 시스템을 사용하여 마우스 양수 세포로부터 다 능성 줄기 세포의 제조

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

수평 한 전체적인 거치 : 피부의 두껍고, 3 차원 조직 단면도를위한 비발 한 가공 그리고 화상 진찰 의정서

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous transplants to treat hematological and malignant disorders. Hemogenic endothelium (HE) is an amenable platform to produce functional HSPCs by transcription factors or to induce lymphocytes in a robust manner. However, current methods to derive HE are either costly or variable in yield. In this protocol, we established a cost-effective and precise method to derive HE within 4 days in a feeder- and xeno-free defined condition. The resultant HE underwent an endothelial-to-hematopoietic transition and produced CD34+CD45+ clonogenic hematopoietic progenitors. The potential capacity of our platform for generating functional HSPCs will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Here, we present a protocol to precisely form hemogenic endothelium from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free condition. This method will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

피더 및 제노 프리 정의 상태에서 인간 다능성 줄기 세포에서 혈생 내피 분화

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...