Ringraziamo il Dott. Giulio Di Minin per la derivazione delle linee phaESC e il Dott. Remo Freimann per il funzionamento della citometria a flusso. Riconosciamo anche la signora Michèle Schaffner e il signor Thomas M. Hennek per il supporto tecnico con il trasferimento di embrioni. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione nazionale svizzera per la scienza (grant 31003A_152814/1).

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La clonazione dei mammiferi mediante trasferimento nucleare di cellule somatiche (SCNT) è stata introdotta negli anni'90 19,20,21. Questi sviluppi hanno fatto seguito a studi di clonazione condotti 30 anni prima inanfibi 22. Il notevole ritardo riflette la difficoltà dell'embriologia e dell'imprinting genomico nei mammiferi. Lo sviluppo di SCNT di mammiferi è la base per l'applicazione dell'haESC per sostituire lo sperma, che è dettagliato in questo protocollo.
La sincronizzazione del ciclo cellulare è un fattore importante per il successo di SCNT23. Questo vale anche per l'iniezione di haESC in questo protocollo. L'introduzione di un genoma donatore in un ricevente richiede che le fasi del ciclo cellulare siano abbinate per evitare rotture cromosomiche o aneuploidie che abrogano lo sviluppo dell'embrione. La semiclonazione ha l'ulteriore complessità che due genomi e un citoplasto devono essere compatibili. Una precedente relazione ha dimostrato che l'iniezione di ESESC androgenetici arrestati in fase di m ha prodotto tassi di sviluppo migliori di embrioni semi-clonati rispetto all'iniezione di ESESC in fase G1 negli ovociti7. Questo rapporto suggerisce la fase M come punto di sincronizzazione adatto per la semiclonazione. Di conseguenza, i faESC sono stati arrestati mitoticamente in metafase con demecolicina e iniettati nell'ooplasma degli ovociti MII, che sono stati naturalmente arrestati nella metafase II di meiosi. È importante sottolineare che l'arresto in fase M può essere raggiunto negli ESC dei topi con alta efficienza, fornendo un'eccellente sincronizzazione tra i cicli cellulari del donatore e del ricevente.
Durante la mitosi, la membrana nucleare si rompe e si forma un mandrino a cui si attaccano i cromosomi replicati. Dopo l'iniezione di DKO-fasi M, i cromatidi sorelle vengono segregati in un corpo pseudo polare e nello zigote7 (Figura 3E). Di conseguenza, un singolo insieme di cromosomi di un DKO-phaESC contribuisce all'embrione semi-clonato. È fondamentale che le cromatidi sorelle dei cromosomi DKO-phaESC possano essere correttamente segregate dopo l'iniezione. La membrana plasmatica di un DKO-phaESC intatto previene la segregazione in un corpo pseudo polare. Abbiamo infatti osservato rari casi in cui la membrana plasmatica dei DKO-faSE non è stata interrotta e gli embrioni hanno mostrato DKO-faESC intatti nell'ooplasma dopo l'iniezione (Figura 3D). Pertanto, è necessario fare attenzione a rimuovere la membrana plasmatica dei DKO-faSCI mediante pipettazione. Durante l'iniezione, è altrettanto importante evitare l'interruzione del mandrino meiotico dell'ovocita, che potrebbe portare a difetti di segregazione cromosomici e indurre anche l'aneuploidia.
Nei mammiferi, l'imprinting genomico limita l'applicazione dei fasesci come sostituzione dello sperma. Gli haESC partenogenetici possiedono una configurazione materna delle impronte genomiche, mentre gli spermatozoi possiedono una configurazione paterna. Pertanto, la generazione di cuccioli a tempo pieno non si è verificata dopo l'iniezione di faESC di tipo selvatico come sostituzione dello sperma. Per superare questa limitazione, le eliminazioni dei DLF IG- e H19- sono progettate in fasi. La modifica dell'espressione impressa nei loci materni Igf2-H19 e Gtl2-Dlk1 è sufficiente per cambiare la configurazione delle impronte genomiche per consentire la generazione di topi semi-clonati con una frequenza superiore al 5,1%, basata su embrioni trasferiti a 2 cellule. Queste osservazioni suggeriscono che il targeting di due geni impressi commuta il genoma dei faESC in una configurazione paterna funzionale in grado di sostituire lo sperma nei topi. Tuttavia, per questa strategia è necessaria una modificazione genetica permanente dei FASC. Come strategia alternativa, si può prendere in considerazione l'haESC androgenetico. Gli haESC androgenetici derivano dal genoma dello sperma e possiedono impronte patene. Ci sono stati rapporti che gli haESC androgenetici di tipo selvatico hanno contribuito come sostituto dello sperma a generare cuccioli a lungo termine a una frequenza compresa tra l'1,3% e l'1,9%degli embrioni trasferiti 4,7,24. I cuccioli a tempo pieno sono stati ottenuti anche iniettando haESC androgenetici con deprezzazioni dei DR IG- e H19- ad una frequenza del 20,2% degli embrioni a 2 celluletrasferiti 24. L'aumento dell'efficienza della semiclonazione mediante haESC androgenetici modificati è probabilmente dovuto al fatto che le impronte possono diventare instabili nella cultura. I difetti di imprinting sono corretti dalle deiezioni genetiche dei D DMR critici.
Considerando la difficoltà di introdurre modifiche genetiche direttamente nei genomi degli ovocati o degli spermatozoi, gli ESES sono uno strumento prezioso per manipolare separatamente i genomi parentali. L'uso degli haESC come sostituto dello sperma offre un notevole vantaggio per l'editing del genoma nella linea germinale del topo. Un recente studio ha combinato l'editing del genoma basato su CRISPR / Cas9 con l'applicazione di haESC per la caratterizzazione delle regioni di imprinting che sono fondamentali per lo sviluppo embrionale12. Questo studio ha analizzato il ruolo del Rasgrf1-DMR in combinazione con i DMC H19e IGnello sviluppo di topi bimaternali e la funzione di 7 diversi DMC nello sviluppo di topi bipaternali. Il metodo per sostituire gli ESESC con lo sperma ha costituito la base per approcci di screening genetico per identificare gli amminoacidi chiave all'interno della proteina DND1 nello sviluppo primordiale delle cellule germinali e per identificare i geni nellosviluppo osseo 24,25,26. Studi sull'imprinting genomico e sullo screening genetico per identificare i fattori chiave nello sviluppo embrionale sono approcci considerevoli per l'applicazione degli eSESC come genomi gametici.

Nei mammiferi, i gameti sono le uniche cellule che trasmettono informazioni genetiche alla prossima generazione. La fusione di un ovocita e di uno spermatozoo forma uno zigote diploide che si sviluppa in un animale adulto. Le mutazioni nei genomi gametici sono quindi ereditate dalla prole e guidano la variazione genetica nellaspecie 1. L'introduzione di mutazioni nella linea germinale è stata applicata per produrre animali geneticamente modificati per diversi studi biologici, tra cui la caratterizzazione della funzione genica e la modellazione delle malattie. Sia gli ovociti che gli spermatozoi sono cellule terminali differenziate e altamente specializzate che hanno cessato la proliferazione. Pertanto, la modifica diretta dei gameti è tecnicamente difficile e sono stati sviluppati approcci specializzati. Le modifiche genetiche possono essere introdotte nella linea germinale del topo mediante iniezione di ESC geneticamente modificati nelle blastocsti, dove si integrano nell'embrione in via di sviluppo e colonizzano la linea germinale. Inoltre, la modificazione genetica degli zigoti utilizzando approcci di editing del genoma, incluso il sistema CRISPR/Cas9, è diventata ampiamenteadottata 2.
Recentemente è stato segnalato un approccio eccezionale, che applica gli haESC come sostituto di un genoma gametico3,4,5,6,7,8. Gli HaESC sono linee cellulari derivate dalla massa cellulare interna delle blastoc aploidi partenogenetiche o androgenetiche e possiedono un singolo insieme di cromosomi4,7,9,10. È stato dimostrato che sia gli haESC partenogenetici che androgenetici possono contribuire al genoma dei topi semi-clonati dopo l'iniezione intracitoplasmatica negli ovociti. A differenza di altri approcci, i genomi degli haESC possono essere modificati direttamente in coltura grazie alla loro capacità di autori ricambio. L'introduzione di modifiche genetiche nella linea germinale sostituendo lo sperma con gli eSCS è un metodo importante per gli studi biologici. Prevede la possibilità di coltura separata e manipolare il genoma materno o paterno, che derivano rispettivamente da haESC partenogenetici o androgenetici. Gli HaESC possono quindi essere usati come sostituzione del genoma gametico, il che è particolarmente vantaggioso per gli studi sull'imprinting genomico, sull'espressione specifica dell'allele e sui processi specifici dei genitori.
Nei topi, sono necessarie informazioni genomiche materne e paterna per il normale sviluppodell'embrione 11. Pertanto, i cuccioli a tempo pieno non hanno potuto essere ottenuti quando gli haESC partenogenetici di tipo selvatico (faESC) sono stati iniettati per sostituire il genoma dello sperma5,8. Per superare il blocco dello sviluppo, l'imprinting genomico del genoma materno degli haESC partenogenetici deve essere corretto in una configurazione paterna. Ciò può essere ottenuto manipolazione delle regioni metilate differenzialmente (DR). Ad oggi, sono state studiate decezioni mirate di H19-DMR, Gtl2-Dlk1 IG-DMR e Rasgrf1-DMR per reprimere i geni espressi maternamente nelle fasi3,5,8,12. Questi studi hanno dimostrato che le decezioni sia dell'H19-DMR che dell'IG-DMR sono sufficienti per convertire una materna in una configurazione di impronta paterna che può sostituire i cromosomi spermatici. L'iniezione intracitoplasmatica di faESC che trasportano le due deprezzazioni DMR in ovociti ha prodotto cuccioli semi-clonati con una frequenza compresa tra il 5,1% e il 15,5% degli embrioni a 2 cellule trasferiti.
Questo protocollo si basa sull'applicazione di faESC con soppressioni sia di H19-DMR che di IG-DMR, che noi terminiamo faESC a doppio knockout (DKO-faSEC). Forniamo istruzioni dettagliate per la modifica dell'imprinting genomico nei faESC per stabilire linee DKO-phaESC, per l'iniezione di DKO-faESC negli ovociti come sostituto di un genoma spermatico, per la coltura di embrioni semi-clonati a blastocsti e per ottenere topi semi-clonati. Questo protocollo è un riferimento per i ricercatori che richiedono una manipolazione precisa e diretta del genoma paterno e la generazione di embrioni e topi semi-clonati.

<table><tbody><tr><td>1.5 mLTube</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>15 ml Tube</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>12-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>150628</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>&amp;beta;-Mercaptoethanol</td><td>Merck</td><td>M6250</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>BSA fraction</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>CHIR 99021</td><td>Axon</td><td>1386</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Demecolcine solution</td><td>Merck</td><td>D1925</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41965-039</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>DMEM / F-12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>DR4 mouse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>3208</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>E5134</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>FBS</td><td>biowest</td><td>S1810-500</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Freezing medium</td><td>amsbio</td><td>11897</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Merck</td><td>G1890</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Hepes solution</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Irradiated MEF</td><td>Gibco</td><td>A34966</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>LIF (Leukemia inhibitory factor)</td><td>(Homemade)</td><td>-</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Lipofection reagent</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>NDiff 227</td><td>Takara</td><td>Y40002</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>PD 0325901</td><td>Axon</td><td>1408</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>piggyBac plasmid carrying a CAG-EGFP transgene</td><td>Addgene</td><td>#40973</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>piggyBac transposase plasmid</td><td>System Biosciences</td><td>PB210PA-1</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>pX330 plasmid</td><td>Addgene</td><td>#42230</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>pX458 plasmid</td><td>Addgene</td><td>#48138</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>DNA polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>F549S</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0192</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Merck</td><td>100317</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck</td><td>109634</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Axon</td><td>A3830</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Merck</td><td>71729</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Merck</td><td>106404</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Epeendorf</td><td>5384000012</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merck</td><td>T1503</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>5 mL Tube</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>5 mL Tube with cell strainer cap</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>MoFlo Astrios EQ</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>Codan</td><td>62.1640</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>30-gauge 1/2 inch needle</td><td>Merck</td><td>Z192362-100EA</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>B6D2F1 mouse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>100006</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>hCG</td><td>MSD animal health</td><td>49451</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010015</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Avivasysbio</td><td>OPPA1037 5000 IU</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>10-cm dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>150350</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>4-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>179830</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>50 mL tube</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>6 cm dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>150288</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Center-well dish</td><td>Corning</td><td>3260</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Digital rocker</td><td>Thermo Scientific</td><td>88880020</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>AppliChem</td><td>A0878</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Merck</td><td>H4272</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>KSOM</td><td>Merck</td><td>MR-020P-5F</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>M16 medium</td><td>Merck</td><td>M7292</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>M2 medium</td><td>Merck</td><td>M7167</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Merck</td><td>M8410</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>Merck</td><td>P1049-1PAK</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Strontium chloride</td><td>Merck</td><td>13909</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>5ml syringe</td><td>Codan</td><td>62.5607</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Borosilicate glass cappilary</td><td>Science product</td><td>GB100T-8P</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>CellTram 4r Oil</td><td>Eppendorf</td><td>5196000030</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Fluorinert FC-770</td><td>Merck</td><td>F3556</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Holding pipette</td><td>BioMedical Instruments</td><td>-</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-U</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Microinjection pipette</td><td>BioMedical Instruments</td><td>-</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Microlaoder tips</td><td>Eppendorf</td><td>5252 956.003</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Micromanipulaor arms</td><td>Narishige</td><td>NT-88-V3</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>PiezoXpert</td><td>Eppendorf</td><td>5194000016</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>PVP (Polyvinylpyrrolidine)</td><td>Merck</td><td>PVP360</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Syringe filter</td><td>SARSTEDT</td><td>83.1826.001</td><td>Microinjection</td></tr></tbody></table>

application of mouse parthenogenetic haploid embryonic stem cells as a substitute of sperm

Negli organismi con riproduzione sessuale, le cellule germinali sono la fonte di cellule totipotenti che si sviluppano in nuovi individui. Nei topi, la fecondazione di un ovocita da parte di uno spermatozoo crea uno zigote totipotente. Recentemente, diverse pubblicazioni hanno riferito che le cellule staminali embrionali aploidi (ESES) possono sostituire i genomi gametici e contribuire agli embrioni, che si sviluppano in topi. Qui, presentiamo un protocollo per applicare gli esHC partenogenetici come sostituto dello sperma per costruire embrioni mediante iniezione intracitoplasmatica negli ovociti. Questo protocollo consiste in fasi per preparare gli ESCS come sostituzione dello sperma, per l'iniezione di cromosomi haESC negli ovociti e per la coltura di embrioni semi-clonati. Gli embrioni possono produrre fertili topi semi-clonati dopo il trasferimento dell'embrione. L'uso degli haESC come sostituzione dello sperma facilita l'editing del genoma nella linea germinale, studi sullo sviluppo embrionale e indagini sull'imprinting genomico.

Lo scopo di questo protocollo è quello di applicare i SEBC come sostituti dello sperma per ottenere embrioni e topi semi-clonati. A tal fine, è stata generata e utilizzata una linea DKO-phaESC che trasportava il transgene CAG-EGFP per l'iniezione intracitoplasmatica negli ovociti MII. Per ottenere una linea phaESC adatta con una configurazione di impronta paterna, abbiamo eseguito ingegneria genetica utilizzando nucleasi Cas9. Una linea ESC aploide contiene cellule aploidi e diploidi che sorgono a causa di una tendenza intrinseca degli ESC aploidi per la diploidizzazione10. Un set cromosomico aploide è un prerequisito per una sostituzione riuscita del genoma dello sperma. L'analisi del contenuto di DNA mediante citometria del flusso mostra la distribuzione di cellule aploidi e diploidi nelle fasi G0/G1, S-e G2/M (Figura 2A).
Per stabilire le linee DKO-phaESC, le linee phaESC di tipo selvatico sono state trasfette con costrutti di transposon piggyBac per l'espressione transgenica stabile di EGFP e con plasmidi CRISPR / Cas9 per ottenere eliminazioni degli H19- e IG-DMR. Per escludere gli ESC diploidi e isolare solo gli ESC aploidi che esprimono EGFP, è stato definito un ordinamento specifico (Figura 2A). Le singole cellule aploidi EGFP-positive sono state quindi placcate in singoli pozzi di piastre da 96 pozzi per ottenere sub-cloni. Gli alimentatori MEF sono stati utilizzati per aumentare l'efficienza di placcatura e la sopravvivenza dei FESC trasfetati. Dopo l'espansione delle culture, un primo ciclo di genotipizzazione è stato effettuato da PCR per identificare i sotto-cloni che trasportano eliminazioni di entrambi i D DMR. Dopo che gli alimentatori MEF sono stati rimossi dalle colture, è stato eseguito un secondo genotipizzazione per confermare l'assenza di alleli di tipo selvatico all'H19- e agli IG-DMR (Figura 2B). Su un totale di 135 sotto-cloni, abbiamo ottenuto 5 linee Aploidi DKO-phESC che trasportavano gli alleli cancellati ed erano privi di alleli wildtype sia dell'H19-DMR che dell'IG-DMR.
Un transgene CAG-EGFP è stato introdotto nei DKO-feSC per studiare il loro contributo agli embrioni semi-clonati mediante visualizzazione della fluorescenza verde al microscopio (Figura 3A). Per l'iniezione intracitoplasmatica, i DKO-fasi sono stati trattati con demecolicina per arrestarli in fase M. Pertanto, il ciclo cellulare dei DKO-faESC è stato sincronizzato con quello degli ovociti MII. L'analisi della citometria del flusso ha mostrato 2 popolazioni corrispondenti all'aploide arrestato in fase G2/M (2n) e alle cellule diploidi (4n) dopo il trattamento con demecolcina(figura 3B). L'assenza del picco aploide di 1n indicava che l'arresto del ciclo cellulare era in gran parte completo. Gli ESC aploidi di fase M sono stati quindi ordinati e iniettati in ovociti. Per questo, un singolo DKO-phaESC è stato caricato nella pipetta di microiniezione e iniettato nel citoplasma di un ovocita MII (Figura 3C). La membrana plasmatica del DKO-phaESC è stata interrotta tubazione nella punta della pipetta di microiniezione.
Dopo l'iniezione, l'espressione EGFP è stata raramente rilevata negli embrioni semi-clonati costruiti poiché il citoplasma dei DKO-feSC si era disperso nel grande citoplasma dell'ovocito (Figura 3D). In rari casi, una macchia rotonda di intensa espressione EGFP potrebbe essere osservata all'interno dell'ooplasma. Questa osservazione è stata probabilmente causata dall'iniezione involontaria di DKO-faSC intatti. La mancata rottura della membrana cellulare DKO-phaESC probabilmente non è compatibile con l'ulteriore sviluppo dell'embrione e dovrebbe essere evitata. Un'ora dopo l'iniezione, gli embrioni sono stati attivati mediante trattamento con cloruro distronzio 18. Sei ore dopo l'inizio dell'attivazione, al microscopio sono stati osservati fino a 3 corpi polari(figura 3E). Questi corpi polari corrispondono al primo e al secondo corpo polare dell'ovocita e a uno pseudo corpo polare del DKO-phaESC7. Inoltre, due pronuclei sono stati osservati sotto un microscopio a contrasto di interferenza differenziale, che assomigliava allo stadio pronucleare degli zigoti dopo la normale fecondazione con lo sperma.
Per dimostrare la competenza allo sviluppo, gli embrioni semi-clonati sono stati coltivati allo stadio della blastocista(figura 5A). Inoltre, un topo a tempo pieno è stato ottenuto dopo aver trasferito embrioni semi-clonati a 2 cellule negli ovidotti di una femmina ricevente (Figura 5B). Come previsto, il topo derivato da un embrione semi-clonato era una femmina in quanto né gli ovociti né i faESC derivati dagli ovociti trasportano un cromosoma Y. Il topo semi-clonato era evidentemente normale e produceva prole sana se accoppiato con un maschio webster svizzero di tipo selvatico. Fino ad ora, il topo semi-clonato è vivo da oltre 600 giorni senza apparenti problemi di salute.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig01v3.jpg"> Figura 1: Panoramica dell'applicazione dei DKO-fasi come sostituzione degli spermatozoi. (A) Un lasso di tempo delle procedure del protocollo. (B) Lo schema mostra i passaggi per stabilire le linee DKO-phaESC (passaggi da 1 a 6). (C) Lo schema mostra le misure per costruire embrioni semi-clonati mediante iniezione intracitoplasmatica di un DKO-phaESC in un ovocita MII (fasi 7-14). Abbreviazioni: DKO = doppio knockout; phaESC = cellula staminale embrionale aploide partogenetica; FACS = smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza; MEF = fibroblasto embrionale del topo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig02v2.jpg"> Figura 2: Definizione di linee DKO-phaESC mediante eliminazioni mediate da CRISPR/Cas9 di DLF H19e IG. (A) Analisi citometrica del flusso dei feSC dopo la trasfezione con plasmidi piggyBac per l'espressione stabile di EGFP e con 4 plasmidi CRISPR/Cas9. Le fasi non trasfette vengono visualizzate come controllo. Il profilo del DNA (in alto) mostra la distribuzione del ciclo cellulare delle cellule aploidi e diploidi. Le cellule aploidi della fase G1/S che esprimono EGFP sono indicate dal cancello verde (in basso, a destra). (B) Genotipizzazione dei sotto cloni phaESC coltivati su MEF (primo genotipizzazione) e dopo la rimozione dei MEF (secondo genotipizzazione). Le righe phaESC sotto-clonate 1, 2, 3 e 4 rappresentano cellule di tipo jolly, celle con eliminazione H19-DMR, con eliminazione IG-DMR e con eliminazioni combinate H19- e IG-DMR, rispettivamente. Le linee DKO-phaESC 5-8 possiedono sia eliminazioni H19-DMR che IG-DMR e sono libere da alleli wildtype. Abbreviazioni: DKO = doppio knockout; phaESC = cellula staminale embrionale aploide partogenetica; DMR = regione metilata differenziale; MEF = fibroblasto embrionale del topo; EGFP = proteina fluorescente verde migliorata; WT = tipo jolly. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig03v3.jpg"> Figura 3: Iniezione di DKO-faESC arrestati mitoticamente negli ovociti MII. (A) Morfologia di una coltura DKO-phaESC che trasporta un transgene CAG-EGFP e cancellazioni dei DLF H19 e IG;; barra di scala = 50 μm. (B) L'analisi rappresentativa della citometria del flusso dei DKO-faSES dopo l'arresto con demecolicina per 8 h. DKO-fasi senza trattamento con demecolcina è indicata come controllo. (C) Morfologia dei DKO-faESC nella pipetta di microiniezione. Viene mostrato un singolo DKO-phaESC intatto prima (a sinistra) e dopo (a destra) rupturing della membrana plasma mediante pipettazione; barra di scala = 20 μm. (D) Embrioni costruiti a 1 h dopo l'iniezione di DKO-fasci negli ovociti MII. Viene mostrata un'immagine unita di fluorescenza EGFP e campo luminoso. Le punte di freccia nere indicano punti rotondi di intensa espressione EGFP dopo l'iniezione di DKO-feCS intatti, che dovrebbero essere evitati; barra di scala = 50 μm. (E) Viene mostrata un'immagine di contrasto di interferenza differenziale di embrioni semi-clonati 6 ore dopo l'inizio dell'attivazione con cloruro di stronzio. Le punte di freccia bianche indicano embrioni con 3 corpi polari tra cui uno pseudo corpo polare dal DKO-phaESC iniettato; barra di scala = 50 μm. Abbreviazioni: DKO = doppio knockout; phaESC = cellula staminale embrionale aploide partogenetica; EGFP = proteina fluorescente verde migliorata. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig04.jpg"> Figura 4: Schema dell'installazione per l'iniezione intracitoplasmatica di DKO-fasi in ovociti. (A) Viene mostrata la disposizione di una pipetta di iniezione, di una pipetta di tenuta e di un ovocita nella camera di iniezione. α, angolo di piegatura della pipetta di microiniezione. (B) Disposizione delle gocce nella parabola di micromanipolazione per iniezione intracitoplasmatica. Abbreviazioni: DKO = doppio knockout; phaESC = cellula staminale embrionale aploide partogenetica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig05.jpg"> Figura 5: Sviluppo di embrioni semi-clonati. (A) Sviluppo preimpianto di embrioni semi-clonati in vitro. L'espressione EGFP è inizialmente osservata negli embrioni a quattro cellule al secondo giorno dopo l'iniezione intracitoplasmatica. Al giorno 4, l'intensa espressione EGFP può essere osservata nelle blastocsti; barra di scala = 100 μm. ( B )Untopo semi-clonato ottenuto dopo il trasferimento di embrioni a 2 cellule a una femmina ricevente. A 74 dpp, il topo semi-clonato (punta di freccia) ha consegnato i suoi primi cuccioli (asterisco) per nascita naturale dopo l'accoppiamento con un maschio webster svizzero di tipo selvatico. Gli embrioni semi-clonati e il topo semi-clonato mostrato in questa figura sono identici a quelli riportati in Aizawa etal. Abbreviazioni: EGFP = proteina fluorescente verde migliorata; .dpp, giorni dopo il parto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4">Soluzione di gelatina</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentrazione di scorte</td>
			<td>Volume/peso</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr><tr><td>Acqua</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>gelatina</td>
			<td>-</td>
			<td>1 g</td>
			<td>0.2%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Mezzo aploide a cellule staminali embrionali (HaESC)</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentrazione di scorte</td>
			<td>Volume/peso</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr><tr><td>NDiff 227</td>
			<td>-</td>
			<td>10 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>CHIR 99021</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>3 μL</td>
			<td>3 μM</td>
		</tr><tr><td>PD 0325901</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>1 μM</td>
		</tr><tr><td>Lif</td>
			<td>1 x 106 UI/mL</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>1.000 UI/mL</td>
		</tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td>
			<td>100x</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Buffer di manutenzione HaESC</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentrazione di scorte</td>
			<td>Volume/peso</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr><tr><td>Mezzo HaESC</td>
			<td>-</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Soluzione HEPES</td>
			<td>1 M</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Tampone di lavaggio</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentrazione di scorte</td>
			<td>Volume/peso</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr><tr><td>DMEM / F-12</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Frazione BSA</td>
			<td>7.5%</td>
			<td>7,1 mL</td>
			<td>0.5%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Mef medium</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentrazione di scorte</td>
			<td>Volume/peso</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr><tr><td>DMEM</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Fbs</td>
			<td>-</td>
			<td>56 mL</td>
			<td>10%</td>
		</tr><tr><td>β-mercaptoetanolo</td>
			<td>14,3 mol/L</td>
			<td>3,9 μL</td>
			<td>100 μM</td>
		</tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td>
			<td>100x</td>
			<td>5,6 mL</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Buffer di Lysis</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentrazione di scorte</td>
			<td>Volume/peso</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr><tr><td>Acqua</td>
			<td>-</td>
			<td>8,25 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Tris-HCl (pH 8.5)</td>
			<td>1 M</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr><tr><td>Edta</td>
			<td>0,5 M</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr><tr><td>Soluzione SDS</td>
			<td>10%</td>
			<td>200 μL</td>
			<td>0.2%</td>
		</tr><tr><td>NaCl</td>
			<td>5 M</td>
			<td>400 μL</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr><tr><td>Proteinasi K</td>
			<td>20 mg/mL</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>100 μg/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Mezzo di attivazione</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentrazione di scorte</td>
			<td>Volume/peso</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr><tr><td>KSOM</td>
			<td>-</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Cloruro di stronzio</td>
			<td>1 M</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr><tr><td>EGTA</td>
			<td>0,5 M, pH 8,0</td>
			<td>4 μL</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Soluzione PVP</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentrazione di scorte</td>
			<td>Volume/peso</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr><tr><td>Mezzo M2</td>
			<td>-</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Pvp</td>
			<td>-</td>
			<td>0,6 g</td>
			<td>12%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Soluzione PMSG</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentrazione di scorte</td>
			<td>Volume/peso</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr><tr><td>Pbs</td>
			<td>-</td>
			<td>450 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>PMSG</td>
			<td>500 UI/mL</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>50 UI/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">soluzione hCG</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentrazione di scorte</td>
			<td>Volume/peso</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr><tr><td>Pbs</td>
			<td>-</td>
			<td>450 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>HCG</td>
			<td>500 UI/mL</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>50 UI/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Mezzo di ialuronidasi</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentrazione di scorte</td>
			<td>Volume/peso</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr><tr><td>Mezzo M2</td>
			<td>-</td>
			<td>380 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>ialuronidasi</td>
			<td>10 mg/mL</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>0,5 mg/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Abbreviazioni: LIF = fattore inibitorio della leucemia; MEF = fibroblasto embrionale del topo;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">FBS = siero bovino fetale; DMEM = Mezzo aquila modificato di Dulbecco; BSA = albumina di siero bovino;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">EDTA = acido etilendiamminatetraacetico; SDS = dodecilsolfuro di sodio; EGTA = acido tetraacetico etilene-bis(ossienenitrilo);;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">PBS = salina tamponata da fosfati; PVP = polivinilpirrolidone; hCG = gonadotropina corionica umana;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">PMSG = gonadotropina siere della cavalla incinta.</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Ricetta di mezzo, tampone e soluzione.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>nome</td>
			<td colspan="2">Sequenza (da 5' a 3')</td>
			<td>applicazione</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P1</td>
			<td colspan="2">GTG GTT AGT TCT ATA TGG GG</td>
			<td>Genotipizzazione</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P2</td>
			<td colspan="2">AGA TGG GGT CAT TCT TTT CC</td>
			<td>Genotipizzazione</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P3</td>
			<td colspan="2">TCT TAC AGT CTG GTC TTG GT</td>
			<td>Genotipizzazione</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P1</td>
			<td colspan="2">TGT GCA GCA GCA AAG CTA AG</td>
			<td>Genotipizzazione</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P2</td>
			<td colspan="2">CCA CAA AAA CCT CCC TTT CA</td>
			<td>Genotipizzazione</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P3</td>
			<td colspan="2">ATA CGA TAC GGC AAC CAA CG</td>
			<td>Genotipizzazione</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA1-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCA TGA ACT CAG AAG AGA CTG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA1-R</td>
			<td colspan="2">AAA CCA GTC TCT TCT GAG TTC ATG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA2-F</td>
			<td colspan="2">CAC CAG GTG AGA ACC ACT GCT GAG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA2-R</td>
			<td colspan="2">AAA CCT CAG CAG TGG TTC TCA CCT</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA1-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCG TAC AGA GCT CCA TGG CAC</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA1-R</td>
			<td colspan="2">AAA CGT GCC ATG GAG CTC TGT ACG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA2-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCT GCT TAG AGG TAC TAC GCT</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA2-R</td>
			<td colspan="2">AAA CAG CGT AGT ACC TCT AAG CAG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Elenco degli oligonucleotidi.

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Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

Questo articolo mira a dimostrare l'uso di cellule staminali embrionali aploidi aploidi partenogenetiche come sostituto dello sperma per la costruzione di embrioni semi-clonati.

Applicazione delle cellule staminali embrionali aploidi partinogenetiche del topo come sostituto dello sperma

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

4.5K Views.  ETH Zurich. Questo articolo mira a dimostrare l'uso di cellule staminali embrionali aploidi aploidi partenogenetiche come sostituto dello sperma per la costruzione di embrioni semi-clonati.

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Use of Freeze-thawed Embryos for High-efficiency Production of Genetically Modified Mice

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. The CRISPR/Cas9 system allows researchers to modify the genome with unprecedented efficiency, fidelity, and simplicity. Harnessing this technology, researchers are seeking a rapid, efficient, and easy protocol for generating GM mice. Here we introduce an improved method for cryopreservation of one-cell embryos that leads to a higher developmental rate of the freeze-thawed embryos. By combining it with optimized electroporation conditions, this protocol allows for the generation of knockout and knock-in mice with high efficiency and low mosaic rates within a short time. Furthermore, we show a step-by-step explanation of our optimized protocol, covering CRISPR reagent preparation, in vitro fertilization, cryopreservation and thawing of one-cell embryos, electroporation of CRISPR reagents, mouse generation, and genotyping of the founders. Using this protocol, researchers should be able to prepare GM mice with unparalleled ease, speed, and efficiency.

Here, we present a modified method for cryopreservation of one-cell embryos as well as a protocol that couples the use of freeze-thawed embryos and electroporation for the efficient generation of genetically modified mice.

Uso di embrioni congelati per la produzione ad alta efficienza di topi geneticamente modificati

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. ...

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Genetica

CRISPR/Cas9-Mediated Highly Efficient Gene Targeting in Embryonic Stem Cells for Developing Gene-Manipulated Mouse Models

The CRISPR/Cas9 system has made it possible to develop genetically modified mice by direct genome editing using fertilized zygotes. However, although the efficiency in developing gene-knockout mice by inducing small indel mutation would be sufficient enough, the efficiency of embryo genome editing for making large-size DNA knock-in (KI) is still low. Therefore, in contrast to the direct KI method in embryos, gene targeting using embryonic stem cells (ESCs) followed by embryo injection to develop chimera mice still has several advantages (e.g., high throughput targeting in vitro, multi-allele manipulation, and Cre and flox gene manipulation can be carried out in a short period). In addition, strains with difficult-to-handle embryos in vitro, such as BALB/c, can also be used for ESC targeting. This protocol describes the optimized method for large-size DNA (several kb) KI in ESCs by applying CRISPR/Cas9-mediated genome editing followed by chimera mice production to develop gene-manipulated mouse models.

Here we present a protocol for developing genetically modified mouse models using embryonic stem cells, especially for large DNA knock-in (KI). This protocol is tuned up using CRISPR/Cas9 genome editing, resulting in significantly improved KI efficiency compared with the conventional homologous recombination-mediated linearized DNA targeting method.

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Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

Iniezione di spermatide rotondo di topo

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

<meta charset="utf8"></head><body>Modello murino ICSI-ET per studiare gli impatti a lungo termine sul metabolismo del glucosio

Monitoring Blood Glucose in Mouse Offspring After Intracytoplasmic Sperm Injection

Human lifespan is considerably long, while mouse models can simulate the entire human lifespan in a relatively short period, with one year of mouse life roughly equivalent to 40 human years. Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is a commonly used assisted reproductive technology in clinical practice. However, given its relatively recent emergence about 30 years ago, the long-term effects of this technique on human development remain unclear. In this study, we established the ICSI combined with embryo transfer (ET) method using a mouse model. The results demonstrated that normal mouse sperm, after undergoing in vitro culture and subsequent ICSI, exhibited a fertilization rate of 89.57% and a two-cell rate of 87.38%. Following ET, the birth rate of offspring was approximately 42.50%. Furthermore, as the mice aged, fluctuations in glucose metabolism levels were observed, which may be associated with the application of the ICSI technique. These findings signify that the mouse ICSI-ET technique provides a valuable platform for evaluating the impact of sperm abnormalities on embryo development and their long-term effects on offspring health, particularly concerning glucose metabolism. This study provides important insights for further research on the potential effects of the ICSI technique on human development, emphasizing the necessity for in-depth investigation into the long-term implications of this technology.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Esplorare gli impatti a lungo termine sulla salute dell'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi sulla prole

Here, we present a protocol to establish an intracytoplasmic sperm injection (ICSI)-embryo transfer (ET) mouse model, allowing us to observe age-related changes in glucose metabolism that may be attributed to ICSI, providing insights into its potential long-term impacts on human development.

Monitoraggio della glicemia nella prole di topo dopo l'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi

Human lifespan is considerably long, while mouse models can simulate the entire human lifespan in a relatively short period, with one year of mouse life ...

Isolamento e genotipizzazione di embrioni di topo gastrulanti per il sequenziamento di singole cellule

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states within samples. Before single-cell advances, the feasibility of capturing the dynamic cellular landscape and rapid cell transitions during early development was limited. In this paper, a robust pipeline was designed to perform single-cell and nuclei analysis on mouse embryos from embryonic day E6.5 to E8, corresponding to the onset and completion of gastrulation. Gastrulation is a fundamental process during development that establishes the three germinal layers: mesoderm, ectoderm, and endoderm, which are essential for organogenesis. Extensive literature is available on single-cell omics applied to wild-type perigastrulating embryos. However, single-cell analysis of mutant embryos is still scarce and often limited to FACS-sorted populations. This is partially due to the technical constraints associated with the need for genotyping, timed pregnancies, the count of embryos with desired genotypes per pregnancy, and the number of cells per embryo at these stages. Here, a methodology is presented designed to overcome these limitations. This method establishes breeding and timed pregnancy guidelines to achieve a higher chance of synchronized pregnancies with desired genotypes. Optimization steps in the embryo isolation process coupled with a same-day genotyping protocol (3 h) allow for microdroplet-based single-cell to be performed on the same day, ensuring the high viability of cells and robust results. This method further includes guidelines for optimal nuclei isolations from embryos. Thus, these approaches increase the feasibility of single-cell approaches of mutant embryos at the gastrulation stage. We anticipate that this method will facilitate the analysis of how mutations shape the cellular landscape of the gastrula.

Autore in primo piano: una pipeline per analizzare embrioni mutanti specifici per il lignaggio con risoluzione di una singola cellula

This paper establishes a pipeline for high-quality single-cell and nuclei suspensions of gastrulating mouse embryos for sequencing of single cells and nuclei.

Sequenziamento dell'RNA a singola cellula di embrioni interi di topo mutanti: dall'epiblasto alla fine della gastrulazione

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states ...

Applicazione delle cellule staminali embrionali aploidi partinogenetiche del topo come sostituto dello sperma

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Uso di embrioni congelati per la produzione ad alta efficienza di topi geneticamente modificati

Targeting genico altamente efficiente mediato da CRISPR/Cas9 in cellule staminali embrionali per lo sviluppo di modelli murini manipolati da geni

Iniezione di spermatide rotondo di topo

Iniezione di spermatide rotondo di topo

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Monitoraggio della glicemia nella prole di topo dopo l'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi

Monitoraggio della glicemia nella prole di topo dopo l'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi

Monitoraggio della glicemia nella prole di topo dopo l'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi

Sequenziamento dell'RNA a singola cellula di embrioni interi di topo mutanti: dall'epiblasto alla fine della gastrulazione

Sequenziamento dell'RNA a singola cellula di embrioni interi di topo mutanti: dall'epiblasto alla fine della gastrulazione