פרוטוקול זה מפרט את השיטה של מיקרוסקופ הרחבת אולטרה-מבנה בשלושה שלבי מחזור חיים במבחנה של טריפנוזומה קרוזי, הפתוגן האחראי למחלת צ'אגאס. פרוטוקול זה מציע חלופה לטכניקות הדמיה ומיקרוסקופ אלקטרונים ברזולוציית העל הנוכחיות, עם היתרון של היותו תואם למיקרוסקופים קונבנציונליים הנמצאים ברוב מעבדות הביולוגיה ובמתקני ליבת מכונות. הוא משתמש בטכניקות נפוצות ברוב מעבדות המחקר כדי להשיג תמונות המאפשרות שחזור תלת מימדי.
הפרוטוקול מאפשר מחקר של מבנים ננומטריים בטריפנוזומטים ומאפשר בדיקה של אוכלוסיית תאים והדמיה של כל נפח התא המעניין ברזולוציה גבוהה. הוא שימושי במיוחד עבור סוגי תאים ספציפיים למדע בשלבים חולפים של מחזור התא והתמיינותו. כדי לקבל רזולוציה גדולה עוד יותר, נשתמש בשילוב של ExM עם טכניקות מיקרוסקופיות ברזולוציית על על מנת להגיע לרזולוציות מתחת ל-20 ננומטר.
התחל על ידי הכנת Trypanosoma cruzi epimastigote השעיה מתרבית שלב יומן במדיום LIT בתוספת 10% FCS. צנטריפוגה את המתלה ב 5, 000 G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את הגלולה פעמיים עם PBS, ולאחר מכן להשהות מחדש 200 מיקרוליטר של PBS.
יש להדביק את המתלה לכיסוי עגול בקוטר 12 מ"מ המצופה בפולי-די-ליזין ולדגור עליו בטמפרטורת החדר למשך 15 עד 20 דקות לפני מניעת קישור צולב. לאסוף את supernatant של תא Vero monolayer נגוע trypomastigotes ארבעה ימים לאחר ההדבקה. באמצעות תא ספירת תאי נויבאואר, לקבוע את ריכוז טריפומסטיגוטים.
צנטריפוגה את השעיית התא ב 7, 000 G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפה והשעיה מחדש של התאים ב-PBS, העבירו את תרחיף התא לכיסוי מצופה ליזין ודגרו על החלקת הכיסוי בטמפרטורת החדר למשך 10 עד 15 דקות לפני מניעת קישור צולב. כדי להשיג אמסטיגוטים מתאי ורו נגועים, הניחו חלקת כיסוי עגולה סטרילית בקוטר 12 מ"מ בתחתית צלחת תרבית רקמה 24.
לאחר מכן, להכין השעיה של תאי Vero ב DMEM בתוספת 2% FCS, וזרע 500 מיקרוליטר של התרחיף לתוך כל באר. יש לדגור על הצלחת למשך הלילה כדי להבטיח חיבור לתאים. לאחר מכן, לשטוף את התאים פעמיים עם 500 מיקרוליטר של PBS סטרילי.
מוסיפים T.cruzi trypomastigotes לתוך התאים ודגורים מוקדם יותר במשך שש שעות. התחל על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של פתרון מניעת קישור צולב לכל באר של צלחת 24 בארות. לאחר מכן, לטבול את 12 מ"מ Poly-D-Lysine ציפוי כיסוי מחליקים עם טפילים דבק.
לאחר מילוי הבארות הריקות במים כדי להפחית את האידוי, אטמו את הצלחת בסרט איטום ודגגרו. כדי לעבד את הדגימות, תחילה הרכיבו תא לח בצלוחית פטרי על ידי הנחת סרט איטום על גבי נייר טישו. לאחר מכן, הרטיבו את נייר הטישו במים ודגרו בחום של מינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי לקרר אותו.
הניחו את החדר הלח והקריר על קרח. לאחר מכן, באמצעות פיפטה פסטר שלושה מיליליטר, לשאוף את פתרון מניעת קישור צולב מן הבארות של צלחת 24 באר. כעת, השתמשו בפינצטה כדי להסיר את פתקי הכיסוי והניחו אותם על נייר הטישו כשהטפילים פונים כלפי מעלה.
קח 90 מיקרוליטר של תמיסה מונומרית בצינור והוסף חמישה מיקרוליטרים כל אחד של TEMED מופשר ו- APS. מערבבים את התערובת למשך שתיים עד שלוש שניות. פיפטה 35 מיקרוליטר של תערובת זו מעל סרט האיטום עבור כל החלקת כיסוי, ומיד להשתמש בפינצטה כדי להניח את החלקות הכיסוי מעל הטיפה עם טפילים הפונים כלפי מטה.
לדגור על החדר הלח על קרח במשך חמש דקות, ולאחר מכן ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. התחל על ידי pipeting שני מיליליטר של תמיסת denaturation לתוך כל באר של צלחת שש באר. מעבירים את פתקי הכיסוי המזוהמים המכילים טפילי Trypanosoma cruzi לתמיסת הדנטורציה ודגורים בתסיסה עדינה.
כדי לעודד היפרדות ג'ל. באמצעות מרית מתכת, בזהירות להעביר את הג'ל לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של תמיסת דנטורציה. לדגור על הצינור עם מכסה מאובטח על בלוק חימום.
השתמש פיפטה P1000 כדי לשאוף את תמיסת הדנטורציה מצינורות מיקרוצנטריפוגה. בעזרת מרית מתכת, מעבירים את הג'ל לצלחת פטרי המכילה 10 מיליליטר מים טהורים במיוחד ומשאירים אותו למשך 30 דקות. בעזרת פיפטת פסטר חד פעמית של שלושה מיליליטר, מחליפים את המים האולטרה-טהורים בצלחת, ומשאירים את הג'ל שקוע למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
למחרת, למדוד את קוטר ג'ל עם קליפר כדי לחשב את ההתפשטות. הדגימות נראו כג'ל מישורי ושקוף שהתרחב פי 4 עד 4.5 במים. התחילו את הסימון הפלואורסצנטי על ידי שטיפת עיגולי הג'ל המורחבים המכילים את הטפילים עם PBS.
השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את העיגולים במרכז לריבועים בגודל 10 על 10 מילימטר. כעת, מעבירים כל ריבוע לצלחת באר 12 ודגרים עליו ב-500 מיקרוליטר של הנוגדן הראשוני המדולל ב-2% PBS ו-BSA, עם רעידות. לאחר מכן, לדגור את ריבועי הג'ל בצלחת שש בארות המכילה שני מיליליטר של PBS עם 0.1% polysorbate 20 במשך 10 דקות, עם רעיד.
לאחר העברת הג'ל לצלחת 12 באר, להוסיף 500 מיקרוליטר של נוגדן משני PBS עם DAPI ו 10 מיקרוגרם למיליליטר של אסטר NHS מצומד פלואורופור הרצוי. דוגרים על הג'ל במשך 2.5 שעות בחום של 37 מעלות תחת תסיסה עדינה. לאחר שטיפת הג'ל שלוש פעמים בפוליסורבט PBS 20 כמו קודם, להעביר את הג'ל לצלחת פטרי עם מים טהורים במיוחד לדגור במשך 30 דקות.
מניחים ריבוע בגודל 10 על 10 מ"מ של חתיכת הג'ל המורחבת על צלחת תחתונה בקוטר 35 מ"מ. בדוק את הכיוון של הטפילים בהגדלה של 10 או 20X. דמיינו את הדגימות במיקרוסקופ קונפוקלי עם יעד טבילה בשמן פי 63, בעל צמצם מספרי של 1.4.
רכוש ערימות Z, את הרוחב של כל צעד Z, וקבע אמפירית את זמן החשיפה לפיקסל, ולאחר מכן רכוש את עוצמת האות ואת המיטוב של זמני הרכישה באמצעות זום הסריקה להגדלה יעילה, אם תרצה. פתח את ערימת Z באמצעות תוכנת עיבוד תמונה וקבץ את התמונות המוערמות באמצעות אפשרות הפרוייקט של קבוצה Z עבור כל ערוץ. לאחר מכן, בחר את הקרנת העוצמה המרבית.
מזג תמונות בעזרת הכלי מזג ערוצים. בחר בצבע של כל ערוץ והוסף את סרגל קנה המידה באמצעות הכלי סרגל קנה מידה בתוכנת העיבוד. ההתפשטות הראשונית סיפקה רזולוציה אפקטיבית של 70 ננומטר, ואילו ההתפשטות המשנית הראתה גורמי התפשטות של כ-4.5.
צביעת כל שלושת שלבי מחזור החיים במבחנה של T.cruzi בסמנים ציטו-שלדיים הראתה לוקליזציה של המחוך המיקרוטובולרי והאקסונם של החלבון. עיבוי כרומטין הובחן בבירור כאשר הוכתם ב- DAPI. אימונולוקליזציה של סמני אלפא טובולין שחפפו לתיוג פאן פרוטאום באפימסטיגוטים הראתה כי גוף הבסיס המוכתם באנטי-אלפא-טובולין ו-FITC התחלק.
תיוג פאן פרוטאום עזר לזהות מבנים שונים של טפילים בכל שלבי מחזור החיים.
