הבדיקה והפרוטוקולים שלנו ב- FRET מאפשרים כימות מהיר ורגיש של פעילות אלסטאז וקטספין G חופשיות וכבולות פני השטח בליחה מחולים עם מחלות דרכי הנשימה הנויטרופילית. שיטות אלה, מאפשרים לחקור היבטים שונים של פתופיזיולוגיה פרוטאסים. מדידות קוראי הלוחות מאפשרות הקרנות גדולות.
מיקרוסקופיה קונפוקלית מדמיין פעילות אנזימים עם פתרון תת-תאי. בעוד ציטומטריית זרימה, מאפשרת כימות פעילות פנוטיפים ופרוטאז של תא יחיד באופן מותאם אישית. טכניקה זו ניתן להרחיב למחלות דרכי הנשימה שונות כגון סיסטיק פיברוזיס, bronchiectasis או COPD.
וזה יכול להיות מותאם BioSamples שונים כגון דם או לבאש alveola הסימפונות או דגימות עכברים. לפני תחילת הליך אינדוקציה ליחה, לשאוף 200 מיקרוגרם של בטא 2 אנטגוניסטים קולטן salbutamol. לאחר מכן, לשאוף היפרטוני 6% תמיסת מלח במשך 15 דקות באמצעות nebulizer.
לאסוף את ליחה expectorated בצלחת פטרי. ריר נפרד גושים מהרוק לתוך צלחת פטרי בעזרת קצה פיפטה. לשקול את הריר, ולאחר מכן להוסיף ארבעה חלקים נפח לכל משקל של 10%Sputolysin ו PBS ליחה.
הדגירה את התערובת בטמפרטורת החדר על שייקר נדנדה במשך 15 דקות כדי להמיס את הריר. להרוות את התגובה על ידי הוספת מיליליטר אחד של PBS קר עבור כל מיליליטר של 10% Sputolysin. פיפטה התערובת כדי לקבל פתרון הומוגני.
מסננים את התערובת דרך מסננת תאי ניילון 100 מיקרון לתוך צינור 50 מיליליטר. חזור על שלב הסינון דרך מסננת 40 מיקרון, ולאחר מכן צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 300 פעמים G ב 4 מעלות צלזיוס. מעבירים את הסופרנט לצינור טרי ומאחסנים אותו בקרח.
בעדינות resuspend גלולת התא ב 500 microliters של PBS קר ומניחים אותו על קרח. להפשיר אנזימים על קרח ולהגדיר עקומת אנזים סטנדרטית כמתואר בכתב היד טקסט. במקביל להכנה הסטנדרטית, לדלל דגימות ליחה במאגר ההפעלה.
על קורא הלוחות, הגדר את אורך גל העירור עבור החללית NE FRET NEmo-1 עד 354 ננומטר ואת אורך גל הפליטה ל 400 ננומטר לתורם ו 490 ננומטר עבור מקבל. עבור CG FRET בדיקה sSam להגדיר את אורך גל עירור ל 405 ננומטר ואת הפליטה ל 485 ננומטר לתורם, ו 580 ננומטר עבור מקבל. הוסף 40 מיקרוליטרים של דגימות, תקנים, או כדורי סרק לתוך בארות של צלחת שחור 96 גם חצי שטח ולהוסיף את תערובת הורים.
התחל את קורא הלוחות והקלט את התורם לעלייה ביחס המקבל לאחר כל 60 עד 90 שניות למשך 20 דקות לפחות, או עד שהעלייה באות מגיעה לרמה. יצא את הנתונים וחשב את התורם ליחס מקבל על-ידי חלוקת RFU התורם על-ידי RFU מקבל עבור כל נקודת זמן ומדגם. לאחר מכן חשב את הממוצע של יחס התורם למקבל ואת סטיית התקן.
קבע את השיפוע בתוך הצמיחה הליניארית של התורם לשינוי ביחס המקבל. עבור כל מדידה, resuspend 30, 000 תאי ליחה בנפח של 50 microliters של PBS בצינור 1.5 מיליליטר. הדגירה את תאי כיח עם מעכב מסוים כמו שליטה שלילית אנזים מתאים כשליטה חיובית במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
הוסף 50 מיקרוליטרים של PBS המכיל כתב FRET וכתם גרעיני לכל צינור כדי לקבל ריכוז סופי של 2 מיקרומולאר. דגירה את התערובת בטמפרטורת החדר במשך 10 עד 20 דקות. להרוות את התגובה על ידי הוספת 100 microliters של PBS קר כקרח ומניחים את הדגימות על קרח.
ציטוספין את התערובת על שקופיות מיקרוסקופיה. ואז אוויר יבש ולתקן את התאים עם קרח קר 10% מתנול במשך 10 דקות. לאחר הקיבעון, האוויר יבש ולהרכיב את המדגם עם מדיום הרכבה מתאים.
לכוד את התמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי. תמונה לפחות 100 תאים לכל תנאי לסטטיסטיקה חד משמעית. לבזבז מחדש 1 מיליון תאים ב 100 מיקרוליטרים של PBS בצינור 5 מיליליטר FACS עגול התחתון, ומניחים את הצינור על קרח.
הוסף שני מיקרוליטרים של בלוק FC לכל מדגם. ואז להדגיר את הדגימות במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. מוסיפים נוגדן לכל צינור ומדגירה על קרח בחושך במשך 30 דקות.
לשטוף את התאים עם שני מיליליטר של PBS קר צנטריפוגה ב 300 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס. לבסוף, resuspend ב 200 מיקרוליטרים של PBS. מחלקים את המתלים לשני צינורות, 100 מיקרוליטרים כל אחד ומוסיפים חמישה מיקרוליטרים של כתם הכדאיות של התא.
מוסיפים מעכב NSP ספציפי מתאים לצינור הבקרה השלילית ומדגירה את הדגימה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. הוסף PBS לדגימה וסנן אותו באמצעות מסנן 40 מיקרון לתוך צינור FACS נקי. הוסף את הכתב לדגימת הבקרה השלילית ומערבולת בעדינות.
התחל לרכוש תאים דגירה עם מעכב ספציפי זה ובמידת הצורך, להתאים מעט את השערים, כמו גם את מתחי PMTs הכתב. כדי לתעד שינויים בתורם כדי לקבל יחס עקב פעילות פרוטאז קשורה קרום, שיא 1000 נויטרופילים מכל צינור, כל חמש עד 10 דקות. לחשב את יחס FRET על ידי חלוקת התורם על ידי ערכי ערוץ המקבל עבור הדגימות נמדד על נויטרופילים יחידים קיימא מגודר.
תמונות של נויטרופילים טרום דגירה עם 100 מיקרומולאר Sivilestat או נשאר מטופל לפני הכתב NEmo-2 תוספת מוצגים כאן. האות הגרעיני שימש לזיהוי נויטרופילים לפי המאפיינים שלהם מפולחים גרעינים ואת ההחזר על ההשקעה נבחר באופן ידני. התורם לקבל יחס של נויטרופילים כיח זומם.
כל נקודה מייצגת את הממוצע של החזר על ההשקעה. גטינג cytometry זרימה מאפשר להפלות וללמוד נויטרופילים כיח. התפלגות MFI באפס ו -10 דקות נצפתה לאחר הוספת כתב.
ערכי MFI התורם והמקבל הממוצע עבור 1000 נויטרופילים ליחה חושבו. יחס ה-D/A הגיע לרמה לאחר עלייה ראשונית. אינדוקציה כיח תורמים בריאים לוקח קצת תרגול לפני השלמות.
זכור להירגע ולנשום את התרסיס במשך 10 עד 15 דקות לפני הציפייה. בנוסף, תמיד שומר תאי ליחה על קרח ולעבד אותם בהקדם האפשרי לאחר expectoration. מצאנו כי פעילות פרוטאז כבול פני השטח עולה בקנה אחד עם נזק ריאות מוקדם אצל ילדים עם חומרת מחלת ריאות בחולי CF מבוגרים.
לכן יחד, שיטות אלה מאפשרות לחקור פרוטאזות כסמנים ביולוגיים דלקתיים מוקדמים במחלות דרכי הנשימה נויטרופילית.
