פרוטוקול FASP הוא גישה מעניינת פרוטאומיקה בדרכי השתן שלך בגלל תאימות שלה עם מאגרים denaturing מאוד ובגלל היכולת שלה לרכז את המדגם על המסנן, שהוא קריטי עבור דגימות חלבון מדולל. פרוטוקול FASP בשילוב עם ספקטרומטריית מסת ניתוח עצמאית נתונים מאפשר לנו להשיג כיסוי פרוטאום עמוק בשתן EPS, שהוא שתן שנאסף לאחר בדיקה רקטלית דיגיטלית. אנו מיישמים כעת את השיטה שאתה עומד לראות במאמץ גילוי סמנים ביולוגיים על סרטן הערמונית.
ההליך יוצג על ידי לישיה פרסטגיאקומו, פאולה מורלי וקטינה גבריאלה. דגימות שתן EPS צנטריפוגה בתוך שעתיים של איסוף במשך 10 דקות ב 2, 100 RCF בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לאחסן את supernatants במינוס 80 מעלות צלזיוס עד השימוש.
לזרוק את הדגימות על קרח, או בארבע מעלות. כדי להאיץ את ההליך, אתה יכול להעביר את הדגימות מ מינוס 80 למינוס 20 ביום שלפני העיכול. כפתרונות מלאי, תצטרך 500 DTT מילימולאר, 10%SDS, מאגר Tris טוחן אחד ב pH שמונה.
לדלל 500 מיקרוליטרים של כל דגימת שתן EPS עם 67 מיקרוליטרים של SDS, 67 מיקרוליטרים של DTT ו 33 מיקרוליטרים של מאגר Tris. דגירה ב 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות עם טלטול עדין. להרכיב את יחידת הסינון הצנטריפוגלית עם 10, 000 משקל מולקולרי דלתון מנותק.
לאחר מכן, להוסיף 300 microliters של דגימת שתן EPS מדולל למסנן. צנטריפוגה ב 14, 000 גרם במשך כ 20 דקות. באפשרותך להפסיק את ההליך באופן זמני לאחר כ- 15 דקות בערך כדי לבדוק אם הסינון מתקדם בצורה חלקה.
המשך עד שהפתרון כולו יעבור דרך המסנן. לאחר מכן, להוסיף 200 microliters של חיץ אוריאה וצנטריפוגה ב 14, 000 גרם במשך 15 דקות. חזור על שלב זה בפעם השנייה.
כאשר הזרימה עומדת לגעת במסנן, רוקן את האוסף Eppendorf על-ידי הזרמת הזרימה. חלבונים בטוחים על המסנן. עבור אלקילציה ציסטאין, להכין פתרון iodoacetamide מיד לפני השימוש.
שוקלים כ -10 מיליגרם של iodoacetamide במספר בקבוקון אפנדורף וממיסים אותו במאגר אוריאה בריכוז של 9.25 מיליגרם למיליליטר, או במונחים טוחנים, 50 מילימולאר. הוסף 50 מיקרוליטרים של פתרון iodoacetamide לכל מסנן וצנטריפוגה ב 6, 000 גרם במשך 25 דקות. מהירות הצנטריפוגה הנמוכה יותר תאפשר למסננים לא להתייבש.
לאחר אלקילציה של חלבון, לשטוף את המסננים עם שני 200 aliquots microliter רצופים של מאגר אוריאה וצנטריפוגה ב 14, 000 גרם במשך 20 דקות. השלך את הזרימה. הוסף 200 מיקרוליטרים של 50 מילימולאר שלושה חיץ אתיל אמוניום ביקרבונט וצנטריפוגה ב 14, 000 גרם במשך 20 דקות.
חזור על שלב זה. לאחר השלמת המלאה של שטיפת ביקרבונט האחרונה, מעבירים את יחידת הסינון לצינור איסוף חדש. לאחר מכן, להוסיף 60 microliters של חיץ 50 מילימולאר TEAB.
הוסף מיקרוליטר אחד של פתרון טריפסין בריכוז של 200 ננוגרם לכל מיקרוליטר של טריפסין. לחלופין, ניתן להכין את מאגר העיכול לכל הדגימות בבקבוקון אפנדורף ולהפיץ 61 מיקרוליטרים של מאגר העיכול לכל מסנן. אם אתה משתמש ThermoMixer על מנת למנוע אידוי מדגם במהלך הדגירה לילה, לעטוף כל יחידת מסנן עם שכבה של רדיד אלומיניום, ולאחר מכן שכבה של parafilm.
דגירה הדגימות ב 37 מעלות לילה. בבוקר שלמחרת, העבירו את המסננים לצנטריפוגה העליונה של הספסל לסיבוב קצר מאוד. לאחר סיבוב, לפתוח את העפעפיים Eppendorf ולהוסיף 140 microliters של מים.
צנטריפוגה בקבוקונים ב 14, 000 גרם במשך 25 דקות, על מנת לאסוף את הפפטידים. הנפח שנאסף צריך להיות סביב 190 מיקרוליטרים. על מנת להסיר עקבות של SDS מן העיכול, טיהור חילופי קטיון חזק של פפטידים לפני LC-MS-MS מומלץ.
הכינו את מחזיקי המיקרוקולום על ידי פירסינג מכסי אפנדורף עם כלי חד כמו זוג פינצטה או מספריים. המחזיק יכיל את המיקרוקולום במהלך צנטריפוגה. מאז הם מייגעים להכין, המחזיקים יכולים להיות מנוצלים מספר פעמים.
באמצעות בוטה מחט, להסיר רובד של דיסק החילוץ המתאים. דיסקי מיצוי הם חומרים פולימריים רכים המכילים חלקיקים סורבנט. במקרה זה, sorbent עשוי חלקיקים עם תכונות חילופי קטיון חזק.
התאם את השלט לקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר. באמצעות בוכנה לדחוף את התקע לקראת סוף הקצה. הדיסק הקטן צריך להיות דחף בחוזקה, אבל הימנעות כוח מופרז.
הכנס את הקצה לתוך המחזיק ולהרכיב את מיקרוקולום ספין באמצעות בקבוקון Eppendorf שני מיליליטר שממנו הוסר המכסה המקורי. התקע ממחט מד 16 יהיה בעל יכולת טעינה של כחמישה מיקרוגרם של פפטידים. מצב מיקרוקולום עם שתי שטיפות רצופות.
המהירות המתאימה תהיה תלויה בעוצמה של דחיפת הדיסק לקצה הפיפט. המטרה היא להשיג זרימה בסדר גודל של 20 עד 30 מיקרוליטרים לדקה. נסו לא לייבש את הקצה במהלך הכביסה ובמהלך טעינת הדגימה.
לדלל את המדגם חמישה לקפל בתמיסת לשטוף שני לטעון את התוצאות בתמיסה במהירות איטית יותר. לשאוף לזרימה של כ 15 עד 20 microliters לדקה. במידת הצורך, השלך את הזרימה.
לשטוף את שאריות חומרי ניקוי. לאחר מכן, אפשר לדיסק להתייבש לפני ההקצפה של הפפטיד. מעבירים את המיקרוקולום לצינור 1.5 אפנדורף נקי ומוסיפים מיד את האלונט.
שיהיו שבעה מיקרוליטרים של תמיסת אמוניום אצטט 500 מילימולרית המכילה 20% אצטוניטריל. לדלל את eluate עם 27 microliters של 0.1% חומצה פורמית על מנת להוריד את אחוז הממס האורגני ולאחר מכן להזריק שני microliters של הפתרון וכתוצאה מכך LC-MS-MS עם זיהוי במצב תלוי נתונים. פרטים על הגדרת LC-MS המשמשת בפרוטוקול זה יינתנו בהמשך הווידאו.
לאחר ביצוע חיפוש מסד נתונים ושילוב שגיאות פפטיד, חשב את אזור השיא הכולל. לאחר מכן, השווה אותו לעקומה סטנדרטית חיצונית כדי להעריך את ריכוז הפפטיד בעיכול FASP. לאחר הערכת כמות פפטיד, לטהר aliquot חדש של תקציר FASP המתאים שני מיקרוגרם של פפטידים על ידי שני טיהורים StageTip רצופים כמתואר כאן.
הגדרת LC-MS המשמשת בפרוטוקול זה מבוססת על הזרקה ישירה לעמודה האנליטית. אם אתה משתמש במערכת עם עמודת השמנה, באפשרותך להימנע משלב הטיהור הלא מקוון של C18. זכור להשתמש מחטים ייעודי בוכנות עבור כל חומר כרומטוגרפי.
לאחר eluting את הפפטידים מן קצה שלב C18 עם 10 microliters של אלונט, בחלקו לאדות את eluate בצנטריפוגה ואקום במשך כמה דקות, מנסה למנוע אידוי מלא. לאחר מכן, הוסף 47 מיקרוליטרים של 0.1% חומצה פורמית והנח את הפתרון המתקבל בבקבוקון HPLC לניתוח LC-MS. המערכת המשמשת כאן מבוססת ישירות על טעינת דוגמת עמודה מבלי להשתמש בעמודת השמנה.
עמודים אנליטיים מיוצרים על ידי משיכת נימי מזהה 75 מיקרומטר לאחר הסרת חתיכת ציפוי פוליאמיד. הקצה שנוצר עשוי להיות מעוצב בעדינות עם חותך קרמיקה. נימי לאחר מכן ממוקם לתוך פצצת אריזה ארוז עם 50 מיליגרם לכל מיליליטר isopropanol תרחיף של C18 שלושה חלקיקי שלב נייח מיקרומטר.
יש צורך בלחץ גז של בין 10 ל -20 מוטות של חנקן או הליום. באפשרותך להשתמש בעמודות כרומטוגרפיה חלופיות או מסחריות הפועלות בקצב זרימה של תת-מיקרוליטר לדקה. אסוף את העמודה על קטע T.
שני הקצוות האחרים מחוברים לאספקת החשמל במתח גבוה וללולאת HPLC. להעריך את מתח ספריי אופטימלי על ידי הפעלת המערכת בזרימה isocratic. אז תתחיל את הניתוח שלך.
הפרד את הפפטידים על פני שיפוע כרומטוגרפיה באורך שעתיים כפי שמוצג. רכישת נתונים תכלול סריקה מהירה ומלאה של שירות MS ולאחריה 26 סריקות MS-MS בחלונות מבשר ברוחב משתנה. החל מרוחב 20 m/z, עבור 20 החלונות הראשונים אשר יכסה טווח m/z מ 350 כדי 750 תומפסון.
לאחר מכן, מעבר לרוחב של 50 מ'/ת עבור חמשת החלונות הבאים והסתיים בסריקת MS-MS אחת, ברוחב בידוד של 200 תומפסון. רוחב צר יותר מסביר אזור מאוכלס יותר של הספקטרום במונחים של נוכחות של מבשרי פפטיד. לניתוח DIA תזדקק לספריה ספקטרלית.
כדי ליצור ספריה ספקטרלית, באפשרותך לבצע מספר ניסויים תלויי נתונים באותה מערכת LC-MS-MS שבה השתמשת לרכישת DIA באמצעות אותו שיפוע כרומטוגרפיה. שבר לדוגמה יגדיל את כיסוי הפרוטום. ניתן להשתמש בעצות שלב עבור שבר לדוגמה.
חילופי קטיון חזקים ושלב הפוך בסיסי הם שתי חלופות חוקיות. התחל עם 10 מיקרוגרם של מאגר של כמה תקצירי FASP. חומצי את המדגם באמצעות 0.2%TFA הריכוז הסופי.
טען את הפפטידים על עצות שלב C18 בקיבולת גבוהה. השתמש בדיסקים מרובים במקרה של כמויות פפטיד גבוהות. עבור 10 מיקרוגרם של חומר, מומלץ שני דיסקים.
בצע טיהור C18 כמתואר לעיל. הכינו מספר בקבוקונים לאוסף eluate. עד מספר השברים.
במקרה זה 10 שברים מיוצרים על ידי elution צעד. לאחר הכביסה האחרונה, מוסיפים 20 מיקרוליטרים של האלונט הראשון. 0.2% אמוניום הידרוקסיד, 10 מילימולאר TEAB, 4% אצטוניטריל.
לאחר ביטול מלא של השבר הראשון ב- Eppendorf הראשון, העבר את קצה הבמה לבקבוקון האוסף הבא. לדלל 20 צעדים microliter באמצעות כמו eluent, 0.2% של אמוניום הידרוקסיד, 10 תה מילימולאר, ולאחר מכן הגדלת כמות האצטוניטריל. לאחר תקדיש את המדגם והפעלת ניסויים תלויי נתונים בכל שבר, צור את הספריה הספקטרלית שלך על-ידי חיפוש מסד נתונים בנתוני MS-MS.
לאחר מכן הספרייה תיובא בתוכנה המסוגלת לנתח נתוני DIA לכימות חלבונים בהתבסס על מינימום של פפטיד ייחודי אחד שהוקצה על ידי מינימום של שלושה מעברים. צפו לכסות מגוון רחב של פרוטאום השתן. נתון זה מראה זיהוי וכימות של חלבונים על פני טווח שפע, המשתרע על פני חמישה סדרי גודל.
זרימת העבודה המוצגת כאן משלבת את יתרון הריכוז ואת הרבגוניות של פרוטוקול FASP עם הרגישות של מצב סריקת DIA. שילוב זה מספק מפה עשירה של פרוטאום השתן. מכיוון שהגדרת הניתוח שלנו אינה כוללת שימוש בעמודת לכידה, תקציר ה- FASP טוהר הן על-ידי חילופי קטיון חזקים והן על-ידי עצות שלב הפוכות.
ניתן להשמיט את שלב תיאורי השלבים ההפוך כאשר עמודת השמנה מחוברת ישירות לעמודה האנליטית. השימוש בזרימת עבודה זו מומלץ לניתוח דגימות שתן EPS אך ניתן להרחיב את השימוש בו לפרוטאומיות בדרכי השתן באופן כללי.
