הפרוטוקול הוא לנרמל את אוסף המדיום התרבית ואת ניתוח כרומוזומלי פלואיד מבוסס על בדיקת כרומוזומים לא פולשנית NICS של עוברים אנושיים טרום השרשה. היתרון העיקרי של NICS הוא קל לתפעול במקום מיקרו-מניפולציה של TiDieR, חיסכון בזמן והפחתה יעילה של אובדן דגימת ביופסיה פולשנית. שיטת הדגימה גמישה מאוד.
כאן אנו מציעים לכם שתי אפשרויות שונות, אחת לתרבית עוברים שגרתית ברצף, והשנייה לשלב אחד. אלה הם העמיתים העיקריים של הצוות שלנו, ד"ר Yaxin Yao וד"ר Xiaohui Zhu אחראים בעיקר להכנת הספרייה ואת רצף התחדשות NICS. ד"ר ג'יאלין ג'יה ואני משלימים את עבודת האמבריולוגיה ואיסוף הדגימות.
פרופסור ליו הוא מנהיג הקבוצה שלנו. היא גם המחברת המקבילה של מאמר זה. כדי להתחיל, להכין את ריאגנטים וכלים.
יש לחמם מראש ולאזן 20 עד 30 מיקרוליטר של מדיום תרבית והיאלורונידאז לפני השימוש. לאחר מכן הניחו את מדיום התרבית וההיאלורונידאז על משטח עבודה במכסה אדים. מעבירים במהירות את ה-OCCCs המעוכלים בצלחת התרבית לטיפול בביציות ומכסים בשמן מינרלי בכל באר.
שאפו בעדינות ושחררו את הביציות חמש עד 10 פעמים כדי להסיר שאריות תאי גרנולוזה סביב הביציות. חזור על שלב זה בשלוש הבארות הנותרות כדי להסיר לחלוטין את תאי הגרנולוסה. להעריך את השלמות של הסרת תאי גרנולוזה באמצעות מיקרוסקופ.
לאחר מכן לבצע הזרקת זרע intracytoplasmic, המכונה גם ICSI ולהעביר את העובר למדיום התרבית. הכינו 20 עד 30 מיקרוליטר של מיקרו-טיפות בינוניות של תרבית בלסטוציסט לכל עובר. כסו את העוברים בשמן מינרלי בצלחת תרבית רקמה ביום השני ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני ו-5% חמצן.
לאחר העברת העובר ביום השלישי למיקרו-טיפת הכביסה, יש לשאוף בעדינות ולשחרר את העובר במיקרו-טיפה שבשלוש הטיפות באופן סדרתי באמצעות הפיפטות. לאחר מכן להעביר את העובר למדיום תרבית בלסטוציסט. הכינו את טיפות הכביסה ואת המיקרו-טיפות בתרבית.
בשעות אחר הצהריים של היום הרביעי, מעבירים את העובר למיקרו-טיפות שחוממו מראש של מדיום תרבית ושוטפים בעדינות כל עובר באופן סדרתי בשלוש מיקרו-טיפות עם הפיפטות. מעבירים כל עובר למיקרו-טיפה יחידה ייחודית שחוממה מראש של מדיום תרבית לאיסוף דגימה. תרבית את עובר הבלסטוציסט לפני שימור בהקפאה.
לביצוע הוויטריפיקציה לפני שימור העובר בהקפאה, הכינו את טיפות התרבית והעבירו את העובר למיקרו-טיפות שחוממו מראש של מדיום תרבית של 10 עד 15 מיקרוליטר. ולשטוף בעדינות כל עובר באופן סדרתי בשלוש טיפות מיקרו על ידי pipetting בבוקר של היום החמישי. כפי שהודגם בעבר, העבירו כל עובר למיקרו-טיפה יחידה ייחודית שחוממה מראש של מדיום תרבית לאיסוף דגימות.
ותרבית את עובר הבלסטוציסט ב-37 מעלות צלזיוס וב-5% פחמן דו-חמצני לפני שימור בהקפאה. לאחר מכן, כוונן בעדינות את ה- ICM במרחק ניכר מנקודת היעד של קרן הלייזר המתמקדת בצומת התא של הטרופקטודרם כדי ליצור חור קטן בטרופקטודרם כדי לשחרר את הנוזל מחלל הבלסטוקול. כדי לאסוף את הדגימה, הפשירו את החיץ בערכה בטמפרטורת החדר וצנטריפוגה לזמן קצר.
לאחר מכן העבירו את מדיום התרבית מכל עובר מתורבת לתוך צינור PCR נטול RNase-DNase המכיל חמישה מיקרוליטרים של מאגר הליזה של התא. הכינו את הריאגנטים והכלים. לאחר כימות הדנ"א הגנומי מדולל לריכוז של 50 פיקוגרם למיקרוליטר עם מדיום התרבית.
לאחר ערבוב יסודי, צנטריפוגו את הצינור לזמן קצר ב 200 G למשך חמש שניות. לאחר צנטריפוגה של מדיום התרבית במיקרו-צנטריפוגה במשך 30 עד 60 שניות, פיפטה 10 מיקרוליטר של מדיום תרבית מתחתית הצינור דיללה בקרה חיובית ומדיום תרבית טרי לצינור PCR חדש של 0.2 מיליליטר. מוסיפים מיקרוליטר אחד של תערובת אנזימי MT ומערבבים היטב על ידי פיפטינג.
ואז צנטריפוגה מיד למשך שתיים עד שלוש שניות. שים את צינור ה- PCR בתחנת הכנה מדגם מעורב שחומם מראש והפעל את תוכנית הליזיס. לאחר הפשרת חיץ קדם-ליב וערבובו, צנטריפוגו אותו מיד למשך שתיים עד שלוש שניות ב-200 גרם.הכינו תערובת אב לתגובה קדם-ספרייתית על ידי הוספת שני מיקרוליטרים של תערובת אנזימים קדם-ספרייתית ל-60 מיקרוליטר של חיץ קדם-ספרייה.
מערבבים היטב את התגובה וצנטריפוגה קצרה. הוסף 60 מיקרוליטר של תערובת תגובה קדם-ספרייתית למדגם הבינוני שטופל מראש. לאחר ערבוב יסודי על ידי פיפט, צנטריפוגה מיד למשך שתיים עד שלוש שניות ב 200 G.מניחים את צינור ה- PCR בתחנת הכנת הדגימה המחוממת מראש.
הפעל את תוכנית קדם-ספרייה והחזק בארבע מעלות צלזיוס. הכינו תערובת אב לתגובת הספרייה על ידי הוספת 1.6 מיקרוליטר של תערובת אנזימי ספרייה ל-60 מיקרוליטר של מאגר הספרייה. מערבבים היטב את התגובה וצנטריפוגה כפי שהודגם בעבר.
הוסף 60 מיקרוליטר של תערובת התגובה של הספרייה ושני מיקרוליטרים של פריימר הברקוד לכל מוצר קדם-ספרייה. לאחר מכן מערבבים היטב את התגובה ואת הצנטריפוגה כפי שהודגמה. לאחר צנטריפוגה, מניחים את צינור ה- PCR במחזור התרמי.
הפעל את תוכנית הכנת הספרייה ולאחר מכן החזק בארבע מעלות צלזיוס. הכינו את הריאגנטים והכלים. הוסף את חרוזי המגה המוכנים 1X לדוגמת הספרייה.
כמת את הספריות המטוהרות כמתואר בכתב היד של הטקסט והשתמש ב-10 ננוגרם מכל דגימת ספרייה לצורך איגום. עיין במדריך למשתמש של הרצף ובצע ניתוח נתונים לאחר השלמת הרצף. הזן את שם המשתמש והסיסמה בדף הכניסה לניתוח נתונים ב- ChromGo.
לאחר הכניסה, לחץ על צור שליחה תחת הכרטיסיה NICS. לאחר מכן בחר NGS עבור הפלטפורמה, Illumina עבור Corporation, ו- NICSInst עבור מגיב. הזן את פרטי הפרויקט בתיבה תחת מזהה פרויקט.הגדר את העדפות הניתוח והעלה את הקבצים.
לאחר שכל קבצי הרצף הועלו בהצלחה, לחץ על שלח כדי להתחיל בניתוח. הפרוייקטים שנשלחו מפורטים תחת הכרטיסיה הצג שליחות. לחץ על לחצן הצג בשדה דוח כדי להציג את טבלת הסיכום של ניתוח NICS.
לחץ על לחצן יצא דוח כדי לשמור את הדוחות. שישה בלסטוציסטים התקבלו מחולים ו- NICS בוצע בכל ששת העוברים מהיום הרביעי עד היום החמישי בינוני. הפרעות הכרומוזומים שנגרמו על ידי טרנסלוקציה מאוזנת של ההורים התגלו בחמישה כרומוזומים באמצעות בדיקת NICS ולכן הם לא שימשו להעברה.
תוצאות ה-NICS של שני העוברים הראו כי קריוטיפ 45 XN זהה ומחיקת כרומוזום 18 היו שניהם מחיקות כרומוזום 18. הקריוטיפ 46 XN הזרוע הקצרה של הכרומוזום מחיקת אזור אחד הייתה רק הזרוע הקצרה של מחיקת אזור הכרומוזומים. תוצאות NICS הראו קריוטיפ 46 XN עם הזרוע הארוכה של מחיקת אזור כרומוזום 18 והזרוע הקצרה של שכפול כרומוזום באזור אחד.
למרות שהקריוטיפים היו שכפולים של כרומוזום חמש והראו שמונה הבדלים בפסיפס, בדיקת NICS יכלה לסנן את כל 24 הכרומוזומים לאנאופלואידיות. תהליך זה מספק שיטה חדשה להעברת בלסטוציסטים קריוטיפ נורמליים יחידים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להסיר לחלוטין את התאים הקומולאריים כדי למנוע את זיהום המקור האימהי ולאסוף את מדיום התרבית ואת שלב הבלסטוציסט המוסבר כאשר תוכן הדנ"א מספיק להגברה.
על ידי שימוש בטכנולוגיית NICS, המחקר הנוכחי ייעל את שלבי הכנת ספריית WGA ו- WGS תוך כשלוש שעות והצטרפות לתוצאות CCS באופן לא פולשני תוך כתשע שעות. לאחר פיתוחה, הטכניקה סיפקה לקלינאי ב- ART דרך חדשנית לשלב הערכה מורפולוגית עם NICS כדי להעביר עובר אפלואידי עם מורפולוגיה טובה לרחם עשוי לשפר את שיעורי ההריון המתמשכים ואת שיעורי לידות החי.
