הפרוטוקול שאנו מציגים כאן הוא מוליך למחצה מהיר ונמוך, המבוסס על רצף שיטות לסינון של אנופלוידיה בעוברים. הפרוטוקול המעודן לביצוע הגברה של תבניות וסידור ספריית רצף הופכים את זיהוי PGTA לתפוקה גבוהה, חסכונית וחסכונית בזמן. זמן הריצה של רצף מוליכים למחצה זה הוא רק שעתיים עד ארבע שעות.
קיצור זמן התפנית מקבלת דגימות להנפקת דוחות לחמישה ימים. שיטה זו מספקת ריצוף גנום להקרנת אנופלוידיה, וריאציית מספר העתקה וקריאה לפולימורפיזם נוקלאוטידים יחיד. בשל כימיית רצף שונה, הספריה שהוכנה על-ידי פרוטוקול זה אינה ניתנת לרצף ישירות במערכות רצף אחרות.
אבל אותו רצף, אבל הכנת ספרייה שונה, הוא מסוגל לעשות הקרנה לא פולשנית טרום לידתית. הדגמת ההליך תהיה שיאנגצ'ון גואו, טכנאי מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל ברצף, מערבולת כל ספרייה מדוללת לזמן קצר להסתובב ארבע פעמים על מיני צנטריפוגה במשך שלוש שניות בכל פעם.
לאחר מכן, קחו חמישה מיקרוליטרים של כל ספרייה, כדי להתאגרף לתוך הצינור נטול הגרעין, נקודה אחת חמישה מיליליטר. Vortex הספרייה המעורבת לזמן קצר להסתובב על מיני צנטריפוגה במשך שלוש שניות. הוסף 150 מיקרוליטרים של פתרון השבירה, לשני צינורות התאוששות חדשים.
התקן את צינורות השחזור החדשים, את נתב השחזור ואת לוחית ההגברה. מערבבים על ידי היפוך בקבוק השמן שלוש פעמים. ודא כי הן את הנפט ואת פתרון ההתאוששות הם לפחות שני שליש מלא.
Vortex מאגר PCR לערבב הראשי במשך 30 שניות לזמן קצר להסתובב על מיני צנטריפוגה במשך שלוש שניות. מערבולת חלקיקי הכדור ואת הספרייה המעורבת במשך דקה אחת לזמן קצר להסתובב על מיני צנטריפוגה במשך שלוש שניות. לאחר מכן, הכינו תערובת של 2400 רצועות מיקרוליטר, על ידי הוספת 172 מיקרוליטרים של מים נטולי גרעין, שמונה מיקרוליטרים של הספרייה המעורבת, 120 מיקרוליטרים של תערובת האנזימים ו-100 מיקרוליטרים של חלקיקי הכדור, לצינור המכיל 2000 מיקרוליטרים של מאגר ה-PCR הראשי.
הגדר פיפטה ל- 800 מיקרוליטרים וטען את תערובת הקשירה למסנן התגובה דרך יציאת הדגימה. הפוך את בקבוק השמן שלוש פעמים ולהשתמש פיפטה P1000 להוסיף 200 microliters של שמן התגובה למסנן התגובה. בחר את התוכנית פרוטון ולאחר מכן בחר את הלחצן בסיוע, כדי להבטיח שההתקן הוקם כראוי, על-ידי ביצוע ההוראות בצג.
לאחר מכן לחץ על הבא כדי להפעיל את התוכנית. לטעון 100 microliters של מדגם המוצר PCR אמולסיה, 130 microliters של חרוזים שטופים, 300 microliters של פתרון לשטוף ES, ו 300 microliters של פתרון להמיס לתוך רצועת צינור שמונה. מניחים את רצועת שמונה הצינור על מערכת ההעשרה.
התקן טיפ פיפטה ונקודת אפס חדשה צינור שני מיליליטר ולהתחיל את התוכנית. צנטריפוגה נקודת האפס צינור שני מיליליטר ב 15, 500 פעמים G במשך חמש דקות. השליכו את העל-טבעי, ושמור עשרה מיקרוליטרים של מוצר ההעשרה.
מוסיפים 200 מיקרוליטרים של מים נטולי גרעין לצינור ומערבבים על ידי מערבולת. צנטריפוגה נקודת האפס צינור שני מיליליטר שוב. השליכו את העל-טבעי ושמור 10 מיקרוליטרים של מוצר ההעשרה.
מוסיפים 90 מיקרוליטרים של מים נטולי גרעין לצינור ומערבבים על ידי מערבולת. כדי להכין את התבנית, מערבולת את השליטה החיובית ולסובב בקצרה. הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של הבקרה החיובית ל-100 מיקרוליטרים של מוצר ההעשרה.
וורטקס וצנטריפוגה ב 15, 500 פעמים G במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי ושמור 10 מיקרוליטרים של התבנית. לאחר מכן, הוסף 20 מיקרוליטרים של פריימר רצף, ו 15 microliters של מאגר החישול לצינור התבנית.
מערבולת הצינור לזמן קצר להסתובב על מיני צנטריפוגה במשך שלוש שניות. דגירה הצינור במחזור תרמי עם מכסה מחומם. לאחר מכן הוסיפו 10 מיקרוליטרים של מאגר הטעינה לצינור.
מערבבים על ידי צינור למעלה ולמטה. מערבבים את 55 microliters של מדגם על ידי צינור למעלה ולמטה לטעון את המדגם לטעינת היטב של השבב. שמור את קצה פיפטה בשימוש ואת נקודת האפס צינור PCR שני מיליליטר.
הנח את השבב על שבב מיני צנטריפוגה כאשר מדגם כלשהו להזין את השבב. בדוק את המיקום וצנטריפוגה השבב במשך 10 דקות. הכינו חיץ חישול של 50% על ידי הוספת 500 מיקרוליטרים של חיץ חישול ו-500 מיקרוליטרים של מים נטולי גרעין לצינור אחד של חמישה מיליליטר.
הכן את פתרון הסמקה, על ידי הוספת 500 מיקרוליטרים של חיץ חישול ו 500 microliters של 100%2-propanol לתוך צינור נקודה אחת חמישה מיליליטר. לאחר מכן, הכינו את תערובת הקצף, על ידי הוספת 49 מיקרוליטרים של חיץ החישול של 50% ומיקרוליטר אחד של פתרון הקצף לשני צינורות חדשים של נקודה אחת חמישה מיליליטר. אוויר פיפטה לתוך אחת תערובות קצף, ולהעמיס 120 microliters של הבועות לתוך היטב טעינה.
מעבירים היטב את הנוזל המוגזם מהיציאה לתוך באר הטעינה, ומעבירים את השבב למשך 30 שניות על השבב מיני צנטריפוגה. חזור על התהליך לתערובת הקצף השנייה. הוסיפו 55 מיקרוליטרים של חיץ החישול של 50% לצינור השמור בנקודת האפס שני מיליליטר.
השתמש בקצה פיפטה שמור כדי pipette למעלה ולמטה. טען את כל 55 המיקרוליטרים של מאגר החישול לקרן הטעינה. צנטריפוגה השבב במשך 30 שניות על שבב המיועד מיני צנטריפוגה.
לטעון 100 microliters של פתרון שטיפה לתוך השבב טעינת היטב להשליך את הנוזל מגורש מן היציאה היטב. חזור על שלב טעינה זה פעם אחת. טען 100 מיקרוליטרים של מאגר החישול של 50%, לתוך באר טעינת השבבים.
חזור על שלב טעינה זה במשך שלוש פעמים בסך הכל. הוסיפו 60 מיקרוליטרים של חיץ החישול של 50% ושישה מיקרוליטרים של אנזים רצף לצינור חדש של נקודה אחת חמישה מיליליטר. מערבבים על ידי צינור למעלה ולמטה.
לאט פיפטה 65 microliters של פתרון מעורב זה לתוך השבב טעינה היטב, הימנעות בועות. יש להרחיק את השבב מהאור ולהדרגר בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לבסוף, לאחר הדגירה, מיד לטעון את השבב על הרצף ולחץ על התחל את ריצוף לרוץ על המסך כדי להתחיל רצף.
ניתוח סטטיסטי רטרוספקטיבי על 186 שלב מחשוף ו 1135 עוברי שלב blastocyst הביא מעל 95% WGA שיעורי הצלחה בשני סוגי הדגימות. שיעורי כשל בקרת איכות רצף היו 3.4% בקבוצת שלב המחשוף ורק 1.9% בקבוצת השלבים blastocyst. לצד aneuploidy, ניתן להשתמש בנתונים רצף לניתוח אחר.
לדוגמה, העתק וריאציות מספר בגודל של פחות מחמישה מגה-בסיס, או ניתוח דנ"א מיכונדריאלי, בהתאם לעומק ואיכות רצף. עם השיפור במספר העותקים, החוקרים יכולים להמשיך לחקור את עתיד הפסיפס הכרומוזומלי בעוברים אנושיים בשלב מוקדם.
