מקרופאגים הקשורים לגידול אנטי דלקתי קשורים להתקדמות ולאבחנה לקויה בסרטן. פרוטוקול זה הוא מדריך להבחנה וקיטוב של תאים דמויי THP-1 למקרופאגים דמויי M2 תוך 14 יום. נכון לעכשיו אין מודל מבוסס לקיטוב THP-1 אנטי דלקתי.
פרוטוקול זה משתמש בתקופות מנוחה נאותות ובתהליך קיטוב ממושך כדי ליצור סוג משנה ייחודי דמוי מקרופאג' דמוי M2. התפתחות הגידול, למשל, בסרטן המעי הגס ובשיפוץ רקמות, נשלטת על ידי מקרופאגים אנטי דלקתיים. בין מחקרים החוקרים את תפקידם, יצירה סטנדרטית של תת-סוג דמוי M2 מובהק מבטיחה ממצאים ניתנים לשחזור.
התחל על-ידי הגדרת שעון שעון התזמן למשך 150 שניות. הסר את הנקינה הקפואה המכילה את קו התא THP-1 מן החנקן הנוזלי להפשיר את הסליל מיד ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים נקיים, מתחיל את הטיימר ברגע שהביחינה מוכנסת לאמבט המים. לשחרר את המכסה כדי לשחרר את הלחץ שנבנה עקב תהליך ההפשרה, להבטיח כי פתיחת הצינור לא ליצור קשר עם המים כדי למנוע זיהום.
להפשיר את השעיית התא עד שבב קרח על ארבעה מילימטרים בגודל נשאר בתוך המשחקון ולהמשיך לשלב הבא מיד. העבר את השלב הנוזלי של השעיית התא לצינור 15 מיליליטר המכיל תשעה מיליליטר של מדיה צמיחה חמה. לאחר מכן העבר מיליליטר אחד של השעיית תא בינוני חם זה לתוך מקטורן THP-1 ובחזרה לצינור 15 מיליליטר כדי להמיס את שבב הקרח הנותר, ולשטוף את הקרבון כדי להבטיח שלא יישארו תאים מאחור.
מערבבים את המתלים בעדינות על ידי צנרת אותו למעלה ולמטה עם פיפטה של מיליליטר אחד. הסר כ 10 microliters של המדגם לספור את התאים עבור קיימא באמצעות כחול טריפן. התאים עם ציטופלסמה ברורה הם קיימא, ציטופלסמה כחולה מצביעה על מוות תאים.
תוך כדי ספירה, לסובב את השעיית התא החם ב 200 פעמים G במשך שבע דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant לחלוטין resuspend התאים במדיום צמיחה כדי להשיג צפיפות תא של 500, 000 תאים למיליליטר. מערבבים את המתלים בעדינות ומעבירים 22 מיליליטר לתוך צלוחיות תרבית תאים T75 כל אחד.
לאחסן את הבקבוקונים זקופים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם ריכוז 5% פחמן דו חמצני ולהחליף את מדיה הצמיחה כל שלושה עד ארבעה ימים. הכן את השעיית התא לזרוע את התאים בצפיפות של 300, 000 למיליליטר לבאר לתוך לוחות תרבית תאים 24-well. מערבבים את המדיום בעדינות ומכין עליקוטים של 26 מיליליטר בצינורות 50 מיליליטר.
מעבירים מיליליטר אחד של המדיום המכיל תאים לכל באר של צלחת 24-well. מערבבים את המדיה בעדינות על ידי צנרת אותה למעלה ולמטה בין העברות. שמור את פתרון העבודה המוכן טרי של PMA על קרח ולהוסיף 100 ננוגרם של PMA לכל טוב.
לדגור על הצלחות באינקובטור ללא טיפול נוסף במשך 72 שעות. לאחר 72 שעות, להסיר את מדיום הצמיחה ולהחליף אותו עם מיליליטר אחד של מדיום צמיחה טרי, להבטיח לא לגעת בתחתית הבארות עם טיפים pipette. תן לתאים לנוח עוד 96 שעות באינקובטור.
הסר את מדיום הצמיחה ולהחליף אותו עם מיליליטר אחד של מדיום צמיחה טרי. הוסף 20 ננוגרם של אינטרלוקין 4 ו 20 ננוגרם של אינטרלוקין 13 לבאר. ואז תן לתאים לנוח במשך 48 שעות באינקובטור.
חזור על כל התהליך לאחר 48 שעות ולתת לתאים לנוח עוד 48 שעות באינקובטור. הסר את מדיום הצמיחה ולהחליף אותו עם מיליליטר אחד של מדיום צמיחה טרי. ואז תן לתאים לנוח במשך 48 שעות באינקובטור.
הסר את בינוני התא החם מכל באר ולהחליף אותו עם תערובת מיליליטר אחד של PBS קר כקרח ללא סידן ומגנזיום ו 5% FBS. ואז מיד למקם את צלחת התא על קרח במשך 45 דקות. לאחר 45 דקות על קרח, לגרד את התאים באמצעות מגרדי תאים מיני.
העבירו בעדינות את המקרופאגים המנותקים ל-PBS קר ו-5% FBS בצינור של 15 מיליליטר שנשמר על קרח. המקרופאגים הנגזרים משיטת הקיטוב מציגים את הביטוי של CD14, כמו גם סמני CD11b. סמני המונוציט והמקרופיג' CD14 ו- CD11b באו לידי ביטוי ב- 70.9% ו- 74.7% מהתאים, בהתאמה.
תאים הראו רמות פני שטח נמוכות של CD80 סמן דמוי M1 ב 0.2% של תאים, ורמות פני השטח גבוהות של CD206 סמן דמוי M2 ב 62.6% של תאים. כמו תאי THP-1 בינוני נוטים לשקוע לתחתית של בוחן וקל להפעיל באמצעות מתח מכני, ערבוב עדין וטיפול של התאים חשוב. מקרופאגים דמויי M2 נוצרים באופן חוזר, והם מאופיינים באמצעות QR-TPCR, ELISA וציטומטריית זרימה.
זהו הבסיס לחקירת מנגנונים אנטי דלקתיים בהתפתחות סרטן או שיפוץ רקמות.
