Antienflamatuar tümör ilişkili makrofajlar kanserde ilerleme ve kötü prognoz ile bağlantılıdır. Bu protokol, THP-1 monosit benzeri hücreleri 14 gün içinde M2 benzeri makrofajlara ayırt etmek ve polarize etmek için bir kılavuzdur. Şu anda anti-enflamatuar THP-1 polarizasyon için belirlenmiş bir model yoktur.
Bu protokol, farklı bir M2 benzeri makrofaj alt türü oluşturmak için yeterli dinlenme süreleri ve uzun süreli bir polarizasyon işlemi kullanır. Tümör gelişimi, örneğin kolon kanseri ve doku tadilatında, antienflamatuar makrofajlar tarafından kontrol edilir. İşlevlerini araştıran çalışmalar arasında, M2 benzeri farklı bir alt tipin standart olarak oluşturulması tekrarlanabilir bulgular sağlar.
Bir zamanlayıcıyı 150 saniyeye ayarlayarak başlayın. THP-1 hücre hattını içeren donmuş şişeyi sıvı azottan çıkarın ve şişeyi su banyosuna konur koymaz zamanlayıcıyı başlatarak temiz bir su banyosunda 37 santigrat derecede hemen çözün. Çözülme işlemi nedeniyle biriken basıncı serbest bırakmak için kapağı gevşetin, boru açıklığın kirlenmeyi önlemek için suya temas etmemesini sağlayın.
Şişenin içinde yaklaşık dört milimetre büyüklüğünde bir buz parçası kalana kadar hücre süspansiyonu çözün ve hemen bir sonraki adıma geçin. Hücre süspansiyonunun sıvı fazını dokuz mililitre sıcak büyüme ortamı içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra bu sıcak orta hücre süspansiyonunun bir mililitresini THP-1 şişesine aktarın ve kalan buz çipini eritmek için 15 mililitrelik tüpe geri dönün ve geride hücre kalmadığından emin olmak için şişeyi yıkayın.
Süspansiyonu bir mililitre pipetle yukarı ve aşağı pipetle pipetle hafifçe karıştırın. Trypan mavisi kullanarak hücreleri canlılık için saymak için numunenin yaklaşık 10 mikrolitresini çıkarın. Açık sitoplazma içeren hücreler yaşayabilir, mavi bir sitoplazma hücre ölümünü gösterir.
Sayarken, 37 santigrat derecede yedi dakika boyunca 200 kez G'de sıcak hücre süspansiyonu aşağı çevirin. Süpernatant tamamen çıkarın ve mililitre başına 500.000 hücrelik bir hücre yoğunluğu elde etmek için büyüme ortamındaki hücreleri yeniden biriktirin. Süspansiyonu hafifçe karıştırın ve her biri T75 hücre kültürü şişelerine 22 mililitre aktarın.
Şişeleri % 5 karbondioksit konsantrasyonu ile 37 santigrat derecede bir inkübatörde dik olarak saklayın ve büyüme ortamını her üç ila dört günde bir değiştirin. Hücreleri 24 kuyu hücre kültürü plakalarına kuyu başına mililitre başına 300.000 yoğunlukta tohumlamak için hücre süspansiyonu hazırlayın. Ortayı hafifçe karıştırın ve 50 mililitrelik tüplerde 26 mililitrelik bir aliquots hazırlayın.
Hücre içeren ortamın bir mililitresini 24 kuyu plakasının her kuyusuna aktarın. Aktarımlar arasında yukarı ve aşağı pipetleme yaparak ortamı hafifçe karıştırın. PMA'nın yeni hazırlanmış çalışma çözümünü buzda tutun ve kuyu başına 100 nanogram PMA ekleyin.
72 saat boyunca başka bir işlem yapmadan inkübatördeki plakaları kuluçkaya yatırın. 72 saat sonra, büyüme ortamını çıkarın ve pipet uçlarıyla kuyuların dibine dokunmamasını sağlayarak bir mililitre taze büyüme ortamı ile değiştirin. Hücrelerin inkübatörde 96 saat daha dinlenmesine izin verin.
Büyüme ortamını çıkarın ve bir mililitre taze büyüme ortamı ile değiştirin. Kuyu başına 20 nanogram interlökin 4 ve 20 nanogram interlökin 13 ekleyin. Daha sonra hücrelerin inkübatörde 48 saat dinlenmesine izin verin.
48 saat sonra tüm işlemi tekrarlayın ve hücrelerin inkübatörde 48 saat daha dinlenmesine izin verin. Büyüme ortamını çıkarın ve bir mililitre taze büyüme ortamı ile değiştirin. Daha sonra hücrelerin inkübatörde 48 saat dinlenmesine izin verin.
Ilık hücre ortamını her kuyudan çıkarın ve kalsiyum ve magnezyum içermeyen bir mililitre buz gibi PBS karışımı ve% 5 FBS ile değiştirin. Ardından hücre plakasını hemen 45 dakika boyunca buza yerleştirin. Buzda 45 dakika sonra, mini hücre sıyırıcıları kullanarak hücreleri kazıyın.
Müstakil makrofajları buz üzerinde tutulan 15 mililitrelik bir tüpte soğuk PBS ve%5 FBS'ye hafifçe aktarın. Polarizasyon yönteminden türetilen makrofajlar CD14'ün yanı sıra CD11b işaretleyicilerinin ifadesini gösterir. CD14 ve CD11b monosit ve makrofaj belirteçleri sırasıyla hücrelerin %70,9'u ve %74,7'si ile ifade edildi.
Hücreler, hücrelerin %0,2'sinde M1 benzeri işaretleyici CD80'in düşük yüzey seviyelerini, hücrelerin %62,6'sında ise M2 benzeri işaretleyici CD206'nın yüksek yüzey seviyelerini gösterdi. Ortadaki THP-1 hücreleri bir şişenin dibine batma eğiliminde olduğundan ve mekanik stres yoluyla aktive etmek kolay olduğundan, hücrelerin nazik bir şekilde karıştırılması ve işlenmesi önemlidir. M2 benzeri makrofajlar tekrarlanabilir şekilde oluşturulur ve QR-TPCR, ELISA ve akış sitometrisi kullanılarak karakterize edilmiştir.
Bu, kanser gelişiminde veya doku tadilatında anti-enflamatuar mekanizmaların araştırılmasının temelidir.
