Противовоспалительные макрофаги, связанные с опухолью, связаны с прогрессированием и плохим прогнозом при раке. Этот протокол является руководством для дифференцировки и поляризации моноцитоподобных клеток THP-1 в M2-подобные макрофаги в течение 14 дней. В настоящее время не существует установленной модели противовоспалительной поляризации THP-1.
Этот протокол использует адекватные периоды покоя и длительный процесс поляризации для создания отдельного M2-подобного подтипа макрофагов. Развитие опухоли, например, при раке толстой кишки и ремоделирование тканей, контролируются противовоспалительными макрофагами. Среди исследований, изучающих их функцию, стандартизированное создание отдельного M2-подобного подтипа обеспечивает воспроизводимые результаты.
Начните с установки таймера на 150 секунд. Извлеките замороженный флакон, содержащий клеточную линию THP-1, из жидкого азота и разморозьте флакон сразу при 37 градусах Цельсия на бане с чистой водой, запуская таймер, как только флакон будет помещен на водяную баню. Ослабьте крышку, чтобы освободить давление, созданное из-за процесса оттаивания, гарантируя, что отверстие трубы не контактирует с водой, чтобы избежать загрязнения.
Разморозьте клеточную суспензию до тех пор, пока во флаконе не останется ледяной чип размером около четырех миллиметров, и немедленно переходите к следующему шагу. Перенесите жидкую фазу клеточной суспензии в 15-миллилитровую трубку, содержащую девять миллилитров теплой среды роста. Затем переложите один миллилитр этой теплой средней клеточной суспензии во флакон THP-1 и обратно в 15-миллилитровую трубку, чтобы растопить оставшийся ледяной чип, и промыть флакон, чтобы убедиться, что клетки не остались позади.
Осторожно перемешайте суспензию, пипеткой вверх и вниз с помощью одной миллилитровой пипетки. Удалите приблизительно 10 микролитров образца, чтобы подсчитать клетки на жизнеспособность, используя трипан синий. Клетки с прозрачной цитоплазмой жизнеспособны, синяя цитоплазма указывает на гибель клеток.
Во время подсчета вращайте теплую клеточную суспензию в 200 раз G в течение семи минут при 37 градусах Цельсия. Удалите супернатант полностью и повторно суспендировать клетки в питательной среде для достижения плотности клеток 500 000 клеток на миллилитр. Аккуратно перемешайте суспензию и переложите по 22 миллилитра в колбы для культивирования клеток Т75 каждая.
Храните колбы в вертикальном положении в инкубаторе при 37 градусах Цельсия с концентрацией углекислого газа 5% и обменивайтесь питательными средами каждые три-четыре дня. Подготовьте клеточную суспензию для засева клеток с плотностью 300 000 на миллилитр на лунку в 24-лунонные пластины для культивирований клеток. Аккуратно перемешайте среду и приготовьте аликвоты по 26 миллилитров в 50-миллилитровых тубах.
Перенесите один миллилитр клеточно-содержащей среды в каждую лунку 24-луночной пластины. Осторожно перемешайте носитель, пипетируя его вверх и вниз между передачами. Свежеприготовленный рабочий раствор ПМА выдержать на льду и добавить 100 нанограммов ПМА на скважину.
Инкубировать пластины в инкубаторе без какой-либо дальнейшей обработки в течение 72 часов. Через 72 часа удалите питательную среду и замените ее одним миллилитром свежей питательной среды, следя за тем, чтобы не коснуться дна колодцев кончиками пипетки. Дайте клеткам отдохнуть еще 96 часов в инкубаторе.
Удалите питательную среду и замените ее одним миллилитром свежей питательной среды. Добавьте 20 нанограммов интерлейкина 4 и 20 нанограммов интерлейкина 13 на скважину. Затем дайте клеткам отдохнуть в течение 48 часов в инкубаторе.
Повторите весь процесс через 48 часов и дайте клеткам отдохнуть еще 48 часов в инкубаторе. Удалите питательную среду и замените ее одним миллилитром свежей питательной среды. Затем дайте клеткам отдохнуть в течение 48 часов в инкубаторе.
Извлеките теплую клеточную среду из каждой лунки и замените ее смесью одного миллилитра ледяного холодного PBS без кальция и магния и 5% FBS. Затем сразу же поместите клеточную пластину на лед на 45 минут. Через 45 минут на льду соскоблите ячейки с помощью мини-скребков.
Осторожно перенесите отсоединенные макрофаги в холодный PBS и 5% FBS в 15-миллилитровую трубку, храня тумбу, хранящегося на льду. Макрофаги, полученные из метода поляризации, показывают экспрессию CD14, а также маркеров CD11b. Моноцитарные и макрофаговые маркеры CD14 и CD11b экспрессировались в 70,9% и 74,7% клеток соответственно.
Клетки показали низкие поверхностные уровни M1-подобного маркера CD80 в 0,2% клеток и высокие поверхностные уровни M2-подобного маркера CD206 в 62,6% клеток. Поскольку клетки THP-1 в среде имеют тенденцию опускаться на дно флакона и легко активируются при механическом воздействии, важно бережное смешивание и обработка клеток. M2-подобные макрофаги воспроизводимо созданы и были охарактеризованы с использованием QR-TPCR, ELISA и проточной цитометрии.
Это является основой для исследования противовоспалительных механизмов развития рака или ремоделирования тканей.
