항 염증 종양 관련 대식세포는 암에서 진행 및 가난한 예후와 연결됩니다. 이 프로토콜은 14 일 이내에 THP-1 단화 세포를 M2와 같은 대식세포로 분화하고 편광하는 가이드입니다. 현재 항염증성 THP-1 편광에 대한 확립된 모델은 없다.
이 프로토콜은 적절한 휴식 기간과 장기간편광 프로세스를 사용하여 고유한 M2와 같은 대식세포 하위 유형을 만듭니다. 종양 발달은 예를 들어, 결장암 및 조직 리모델링에서 항염증성 대식세포에 의해 조절된다. 그들의 기능을 조사하는 연구 중, 뚜렷한 M2 와 같은 하위 타입의 표준화된 창조는 재현 가능한 사실 인정을 보장합니다.
타이머를 150초 동안 설정하여 시작합니다. 액체 질소에서 THP-1 세포줄을 함유 한 냉동 유리병을 제거하고 깨끗한 수조에서 섭씨 37도에서 즉시 유리병을 해동하고 유리병이 수조에 투입되는 즉시 타이머를 시작합니다. 해동 공정으로 인해 축적된 압력을 방출하기 위해 캡을 풀어 튜브 개구부가 오염을 피하기 위해 물에 닿지 않도록 합니다.
얼음 칩의 크기가 약 4밀리미터가 유리병 내에 남을 때까지 세포 서스펜션을 해동하고 즉시 다음 단계로 진행합니다. 세포 현탁액의 액체 상을 따뜻한 성장 매체의 9밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 튜브로 옮는다. 그런 다음 이 따뜻한 중간 세포 현탁액의 1밀리리터를 THP-1 유리병으로 옮기고 15 밀리리터 튜브로 돌려전달하여 남은 얼음 칩을 녹이고 유리병을 플러시하여 세포가 남지 않도록 합니다.
서스펜션을 1밀리리터 파이펫으로 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 섞습니다. 샘플의 약 10 마이크로리터를 제거하여 trypan blue를 사용하여 생존가능성을 위해 세포를 계산합니다. 명확한 세포질이 있는 세포는 실행 가능하고, 청색 세포질은 세포사를 나타냅니다.
계산하는 동안 따뜻한 셀 서스펜션을 섭씨 37도에서 7분 동안 200회 G로 회전합니다. 상체를 완전히 제거하고 밀리리터당 500, 000 세포의 세포 밀도를 달성하기 위해 성장 배지에서 세포를 재연한다. 서스펜션을 부드럽게 혼합하고 22 밀리리터를 T75 세포 배양 플라스크로 옮킨다.
플라스크를 37°C의 인큐베이터에 똑바로 세워 5%의 이산화탄소 농도를 저장하고 3~4일마다 성장 매체를 교환합니다. 세포 현탁액을 잘 24웰 세포 배양판으로 밀리리터당 300, 000의 밀도로 세포를 시드하도록 준비한다. 배지를 부드럽게 섞고 26밀리리터를 50밀리리터 튜브에 준비합니다.
세포 함유 배지의 1밀리리터를 24웰 플레이트의 각 웰로 옮킨다. 전송 사이에 위아래로 파이프를 하여 미디어를 부드럽게 섞습니다. 새로 준비된 PMA 작업 용액을 얼음 위에 보관하고 100나노그램의 PMA를 잘 추가합니다.
72 시간 동안 추가 치료없이 인큐베이터에서 플레이트를 배양하십시오. 72 시간 후, 성장 매체를 제거하고 파이펫 팁과 우물의 바닥을 만지지 않도록, 신선한 성장 매체의 1 밀리리터로 교체. 세포가 인큐베이터에서 또 다른 96 시간 동안 쉬게하십시오.
성장 매체를 제거하고 신선한 성장 매체의 1 밀리리터로 대체하십시오. 인터류빈 4와 20 나노그램의 인터류키(interleukin) 13그램을 잘 넣습니다. 그런 다음 세포가 인큐베이터에서 48 시간 동안 쉬게하십시오.
48 시간 후에 전체 과정을 반복하고 세포가 인큐베이터에서 또 다른 48 시간 동안 쉬게하십시오. 성장 매체를 제거하고 신선한 성장 매체의 1 밀리리터로 대체하십시오. 그런 다음 세포가 인큐베이터에서 48 시간 동안 쉬게하십시오.
각 우물에서 따뜻한 세포 매체를 제거하고 칼슘과 마그네슘과 5 % FBS없이 얼음 차가운 PBS의 1 밀리리터 혼합물로 대체합니다. 그런 다음 즉시 45 분 동안 얼음에 세포 판을 놓습니다. 얼음에 45 분 후, 미니 셀 스크레이퍼를 사용하여 세포를 긁어.
분리된 대식세포는 차가운 PBS로 부드럽게 옮기고 얼음 위에 보관된 15밀리리터 튜브에서 5%FBS를 부드럽게 전달합니다. 편광 방법에서 유래된 대식세포는 CD14의 발현뿐만 아니라 CD11b 마커를 보여 준다. 단세포 및 대식세포 마커 CD14 및 CD11b는 각각 70.9%와 74.7%의 세포로 발현되었다.
세포는 세포의 0.2%에서 M1 과 같은 마커 CD80의 낮은 표면 수준을 보였고, 세포의 62.6%에서 M2와 같은 마커 CD206의 높은 표면 수준을 보였다. 중간 크기의 THP-1 세포가 바이알의 바닥으로 가라앉는 경향이 있고 기계적 스트레스를 통해 활성화하기 쉽기 때문에, 세포의 부드러운 혼합 및 취급이 중요하다. M2와 같은 대식세포는 재현적으로 생성되며 QR-TPCR, ELISA 및 유동 세포측정을 사용하여 특징지어지고 있습니다.
이것은 암 발달 또는 조직 리모델링에 있는 항염증제 기계장치를 조사하기 위한 기초입니다.
