מטרת המחקר שלנו היא לחקור את הפתוגנזה של טרשת נפוצה. כדי להשיג מטרה זו הקמנו תוכנית נתיחה מהירה כדי להשיג וללמוד את המוח מאנשים עם טרשת נפוצה. ישנם שני היבטים מיוחדים של תכנית הנתיחה שלאחר המוות שלנו, הראשון הוא שזה מהיר. אנחנו אוספים את המוח של פחות משש עד שמונה שעות של מוות.
זה מאפשר מחקרים מולקולריים מתקדמים. ההיבט השני הוא שאנחנו עושים MRI במקום לפני שאנחנו מזיזים את המוח. זה מאפשר לנו לתאם שינויים פתולוגיים עם שינויי הדמיה מוחית.
הדגמה חזותית מאפשרת לצופים להבין כיצד אנו מארגנים את המרחב והזמן שלנו כדי להשיג תוצאות מיטביות. עיבוד רקמות שקורה במהירות ובזהירות מאפשר ניתוח RNA, כשל חיסוני, אימונובלוט ומתאמי MRI. חוקרים חדשים עשויים להיאבק עם עיבוד רקמות עם שלמות רקמות ירודה.
הימנעות זמני קיבוע ארוך שלאחר המוות חשוב ו סטריציות רקמת MRI יכול להיות מאתגר כך התייעצות עם מומחי ניתוח MRI יכול להיות מאוד שימושי. ההדגמה של ההליך תהיה אמילי כריסטי וכריסטינה וולסקו. טכנאים מהמעבדה שלנו.
לאחר דימות תהודה מגנטית במקום, לשקול ולצלם את המוח ולמקם כל דורה המצורפת במיכל של 4% Paraformaldehyde או PFA. הפרד את המוח הקטן ואת גזע המוח מן המוח הקטן ולצלם את המוח הקטן. השתמש בדיקה כדי להפריד את עצבי הראייה, chiasm ודרכיים ולכרות את המבנה עם אזמל.
הפרד את ההמיספרות המוחיות לאורך ותצלם כל חצי כדור בנפרד. דיו קליפת המוח המוטורית העיקרית או PMC עבור חצי הכדור השמאלי, rephotograph את הרקמה ולמקם את הרקמה במיכל 3.3 ליטר עבור קיבעון ארוך. כדי לסלק את PMC עבור חצי הכדור הימני להסיר את קרום המוח כיסוי rephotograph הרקמה.
הבא תצות את PMC באמצעות אזמל. ואז לצלם את PMC חצוי ליד חצי הכדור. חותכים את PMC לשישה חלקים בגודל שווה דיו ההיבט rostral של כל מקטע.
ואז למקם כל קטע אחר לתוך מכולות מלאות PFA עבור קיבעון קצר. ולהצמיד להקפיא את החלקים הנותרים לאחסון בשקיות מקפיא אטום, קריר מספר אחד. חותכים את חצי הכדור הימני הקדמי לחלקים האחוריים לחלקים עבים של קורונול בעובי סנטימטר אחד.
לתקן כל סעיף אחר PFA הצמד להקפיא את החלקים הנותרים לאחסון בשקיות מקפיא אטום, קריר מספר אחד. הפרד את גזע המוח מהמוח הקטן והצב את גזע המוח במיכל מלא PFA עבור קיבעון קצר. חותכים כל חצי כדור מוחי לארבעה קטעים קשתיים קבועים באותה מידה ולצלם את הנוף המדיאלי והצלי.
לאחר מכן מניחים את פרוסות hemispheric המוח הקטן השמאלי במיכל של PFA עבור קיבעון קצר. ולהצמיד להקפיא את פרוסות hemispheric המוח הקטן הנכון לאחסון בשקיות מקפיא אטום, במקרר מספר אחד. לאחר קבלת חוט השדרה עם שורשי העצב להסיר את חוט השדרה דורה מאטר ולאחסן את דורה PFA.
הפרד את שורשי העצבים הימניים והשמאליים וחותכים את שורשי העצבים האחוריים והקציניים השמאליים בחוט השדרה לצורך קיבעון קצר ב- PFA. חותכים את שורשי העצבים האחוריים והעצבים האחוריים הנכונים מ אקורד עמוד השדרה ומקפיאים את הרקמות האלה לאחסון בשקיות מקפיא אטומות, במקרר מספר שתיים. לאחר מכן לצלם את caudal-ביותר 20 ס"מ של חוט השדרה לחתוך שני מקטעי העברה סנטימטר מן caudal לכיוון rostral של החוט עבור קיבעון קצר PFA והקפאה הצמד.
ואז לצלם את החלק rostral הנותר של חוט השדרה. וחותכים שני מקטעי העברה סנטימטר מן caudal לכיוון rostral של הכבל עבור קיבעון קצר PFA והקפאה הצמד. חותכים חלקים של עניין מן הרקמות הקבועות קצר או ארוך.
מניחים את החלקים לתוך בארות בודדות של צלחת שש היטב ולשטוף את הרקמות עם שלוש חמש דקות שוטף בשני מיליליטר של PBS טרי לכל לשטוף, עם רועד. לאחזור אנטיגן, יש לחמם במיקרוגל את החלקים למשך 2-3 דקות ב זכוכית המכילה בערך 30 מיליליטר של חיץ ציטראט מילימילארי של 10 מילימולרים. כאשר החלקים התקררו לטמפרטורת החדר להעביר את הדגימות לתוך צלחת חדשה שש באר במשך שלוש חמש דקות שוטף ושני מיליליטר של PBS, בתוספת 0.3% טריטון X-100 ל הבאר, לכל לשטוף.
ואחריו חסימת פרוקסידאז אנדוגני בשני מיליליטר של 3%מי חמצן בתוספת 0.3% טריטון X-100 ב PBS במשך 30 דקות, בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לשטוף את החלקים שלוש פעמים בשני מיליליטר של PBS בתוספת טריטון X-100 לכל לשטוף, כפי שהודגם. ואחריו חסימה בשני מיליליטר של 3% סרום עזים רגיל PBS בתוספת טריטון X-100 במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, הדגירה את החלקים מ לילה עד חמישה ימים בנוגדנים העיקריים של עניין בארבע מעלות צלזיוס ואחריו שלוש חמש דקות שטיפה בשני מיליליטר של PBS לכל לשטוף. הדגירה את החלקים בתסומה מורכבת אבידין ביוטין או קומפלקס ABC במשך שעה אחת, בטמפרטורת החדר. עקוב אחר זה עם שלוש חמש דקות שטיפות ב- PBS.
סמן את החלקים עם שני מיליליטר של Diaminobenzidine מסונן בתוספת מי חמצן לגם במשך שלוש עד שמונה דקות. כאשר הצבע התפתח כראוי, לשטוף את החלקים שלוש פעמים PBS בנפרד להעביר כל קטע למיכל מלא PBS. מקם כל מקטע באופן שטוח, תחת שקופיות רקמה בודדות.
ובעדינות להרים כל שקופית מתוך PBS, שמירה על החלקים שטוחים ככל האפשר. השתמש בשתי מברשות צבע כדי לשטח בעדינות ולמתח כל רקמה. ולהשתמש במגבת נייר כדי לטבול את המים העודפים.
לאחר מכן הר את החלקים עם מדיום הרכבה מתאים ולאטום כל להחליק כיסוי עם לק ציפורניים ברור. חלקי רקמות נבדקים לנוכחות נגעים של חומר לבן והאזורות שנבחרו מוכתמות בפעילות חיסונית ו demyelination. בנגעים חריפים של Sceloris מרובים רבים של אקסונים אלה demyelinated לפעול כמו נורות נסיגה אקסונאלי המשקפות את הקצוות הפרוקסימליים של אקסונים מקוצרים.
הצפיפות של אקסונים מנופים בנגעים חריפים עולה על 11000 למילימטר מעוקב בנגעים פעילים לעומת רק 15 באזורים סמוכים שאינם נגעים חומר לבן. אוליגודנדרוציטים שזה עתה נוצרו נמצאים גם בנגעים רבים של טרשת נפוצה כרונית. תהליכים אלה מקשרים עם האקסונים המהוללים אך אינם מיאלינטים אותם.
חיפוש מייצג ובלתי משוחד אחר שינויים בגנים עצביים בקורטקסט מוטורי קפוא במהירות המתקבל מחולי טרשת נפוצה כרוניים, זיהה הפחתות משמעותיות ב-23 מחקרי אישורים של שליח מיטוכונדריאלי גרעיני ומקודד באמצעות אימונוציטוכימיה ובהכלאה סיטו הצביע על כך שגנים אלה הועשרו מאוד בנוירונים של הקרנה קליפתית ושמקיטוכונדריה מבודדת מאקסונים של הקרנה מציגה גליקוליזה מופחתת. השוואה של ביטוי הגן נוירונודי בהיפוקמפוס מיאלין ו demyelinated מגלה הפחתות RNA שליח עצבי כולל חלבונים המעורבים בזיכרון ולמידה. יתר על כן, בהשוואה לשליטה בקליפת המוח, אובדן עצבי קליפת המוח גדול באופן משמעותי באוכלוסיית משנה של חולי טרשת נפוצה שיש להם demyelination של חוט השדרה cortext מוחי אבל לא של החומר הלבן המוחי.
במהלך עיבוד רקמות, ודא כי כאשר החלקים coronal נחתכים הם נחתכים באופן עקבי לגבי עובי וכיוון. ושהם שוכבים שטוחים כאשר צפים בתיקון או כאשר קפוא. בנוסף לניתוח האימונוהיסטוכימי, איסוף הרקמות הקפואות מספק לנו את ההזדמנות לבצע ניתוח גנטי ופרוטומי.
טכניקות אלה סייעו בזיהוי של קבוצה חדשה של חולי טרשת נפוצה עם נגעים חומר לבן מוחי על MRI אבל ללא כל demyelination חומר לבן משמעותי. תם שם הספר "מיילוקורטי טרשת נפוצה".
