הליך זה רגיש מאוד ומאפשר הדמיה של מספר תמלילים עם רקע מינימלי. שיטה זו יכולה ליצור מפות מדויקות של פרופיל התמלול של סוגי תאים הטרוגניים מאוד. אם נדגים את ההליך, אני וג'ונסון בוב-מנואל, טכנאי מחקר במעבדה.
התחל על ידי איסוף המסה הגנגלית הוואגליונית כולה מהעכבר בן שמונת השבועות מכל צד, בעזרת היקף ניתוח ומכשירים כירורגיים. לאחר עריפת ראשו של העכבר, השתמש במלקחיים קטנים כדי להסיר את עצם החזה ואת השרירים omohyoid לרוחב קנה הנשימה כדי לחשוף את העצם העורפית. נקה את כל האזור של שרירים ורקמות עד העורק הראשי, העצב הוואגוס hypoglossal ומגנום foramen גלויים.
ואז לחתוך את כל העצב hypoglossal עם מספריים קפיציים קטנים. אתר עבור גנגליון הנודד כמסה שקופה קרוב למגנום פורם. בעזרת מספריים קטנים, שברו בזהירות את עצם העורף.
כדי לחשוף את גנגליון הצוואר עוד יותר, אתר מלנוציטים שחורים על פני השטח של הצוואר כציון דרך חזותי. כאשר הגנגליונים נמצאים, לחתוך את הקשרים העצביים בין המסה הגנגליונית vagal ולמשוך בעדינות על הקצה ההיקפי של עצב הוואגוס ובו זמנית חיתוך גנגליון הצוואר לכיוון גזע המוח עם מספריים קפיץ קטן להפקת המסה הגנגליונית כולה. הסר את רקמת הלחמית, המסה הגנגליונית והשומן שנדבק לעצב הוואגוס.
שמירה על כחצי סנטימטר של עצב vagus כדי להקל על טיפול ולוקליזציה של דגימות. מניחים את להסיר הגרעינים בעזרת מלקחיים עדינים בצינורות צנטריפוגות מיקרו 1.5 מילימטרים. ודגרה ב-4 מעלות צלזיוס בפורמלין במשך 24 שעות.
ואז עם 30% סוכרוז ל-24 שעות. לאחר הדגירה, למקם את הגרעינים בתוך טיפה של קוטר ארבעה מילימטר של מדיום טמפרטורת חיתוך אופטימלי על פיסת רדיד אלומיניום. ולביטוי את הדגימה על מצע של קרח יבש.
חותכים את הדגימות הקפואות עם קריוסטט לחלקים של עובי של 14 מיקרומטר במינוס 20 מעלות צלזיוס ולאסוף את החלקים החתוכים על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית כמו שלוש סדרות 42 מיקרומטר זה מזה. לשטוף את השקופיות עם מקטעי רקמות PBS. ואופים במשך 30 דקות ב 60 מעלות צלזיוס בתנור אפייה.
לאחר מכן, postfix השקופיות ב 4%פורמלין במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מייבשים את השקופיות באופן סדרתי ב-50%70% וב-100% אתנול למשך חמש דקות כל אחת. ולהחיל תמיסת מי חמצן על הדגימות במשך 10 דקות לפני שטיפה במים מזוקקים כפולים.
עבור הכלאה במקום, או ISH, לטפל בדגימות עם ריאגנט אחזור היעד במשך חמש דקות. לאחר מכן לשטוף ברצף את הדגימות במים מזוקקים כפולים 100%אתנול ואחריו ייבוש אוויר. באמצעות עט הידרופובי, ליצור מחסום סביב הדגימות.
בעוד הדגימות מטופלות בפרוטאז במשך 30 דקות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס ותנור הכלאה, מחמם מראש את הבדיקות ב -40 מעלות צלזיוס ומצנן אותן בטמפרטורת החדר לפני השימוש. לאחר המעבר מהתנור, לדגור על השקופיות עם השילוב הרצוי של בדיקות היעד במשך שעתיים ב 40 מעלות צלזיוס בתנור הכלאה. דגירה רקמת שליטה שלילית עם דיהידרודיפיקולינט רדוקטאז או DapB, גשושית C1 היעד במשך שעתיים ב 40 מעלות צלזיוס.
יש לשטוף את השקופיות במאגר הכביסה ולאחסן חמש פעמים נתרן מלוח סיטראט בטמפרטורת החדר למשך הלילה. למחרת, לשטוף את השקופיות עם חוצץ לשטוף לפני הדגירה עם ריאגנטים הגברה. ולהתייחס עם ריאגנטים ספציפיים לערוץ כמתואר בכתב היד.
לשטוף את השקופיות ואחריו טיפול עם DapB במשך 30 שניות. לאחר מכן מיד להחיל את מדיום הרכבה על כל שקופית ומניחים להחליק כיסוי על קטע הרקמה. שמור את הרקמות אופקיות במחזיק שקופית בארבע מעלות צלזיוס עד הדמיה.
הכן מיקרוסקופ קונפוקלי להדמיה על-ידי הגדרת הפרמטרים הנדרשים. רכש את התמונות עם קו בממוצע של ארבעה וגודל פיקסלים של לפחות 1024 עד 1024 כדי לשפר את איכות התמונות. לאחר מרוצה הפרמטרים הרכישה, להתחיל לרכוש את התמונות באמצעות אותן הגדרות.
ייחס צבעים כוזבים לכל ערוץ כדי להקל על הפריט החזותי. באמצעות התמונות הדיגיטליות, בצע ספירת תאים על-ידי זיהוי קווי המתאר של פרופילים חיוביים של טווח RNA עם גרעין אחד מוכתם קלות עם DapB. חשב את אחוז הפרופילים החיוביים של טווח ה- RNA המבטאים כל תעתיק.
פרמטרי הרכישה האופטימליים נבחרו עבור כל לייזר בהתבסס על הפלואורסצנטיות הלא מוגדרת המתקבלת ברקמת הבקרה השלילית. הפלואורסצנטיות האנדוגנית בגנגליון הנודות של עכבר צעיר היא מינימלית. ודגרה עם גשושית DapB, זה לא הביא אותות.
בלייזר כוח מוגבר ורווח עם לייזר 488 ננומטר, רקע לא רצוי ונקודות פלואורסצנטיות אקראיות מופיעים. טכניקת היקף הרנ"א הוחלה כדי לזהות שלושה גנים בקטעי רקמות של המסה הגנגלית של הווגל. פרופיל הרקמה היה חיובי עבור GHSR ו- CCK1R.
הפרופיל כלל גם תמלילי Phox2b וגם CCK1R בחלק rostral של גנגליון הנודים. כתוצאה של מולטיפלקס ISH בנוירונים afferent הנודים, אותות Phox2b שנצברו במיוחד נוירונים afferent, הממוקם גנגליון הנודים. אותות CCK1R שכותרתו אינטנסיבית נוירונים רבים בגנגליון הנודים.
בהגדלה נמוכה, תאים המבטאים אותות CCK1R או GSHR נמוכים לא ניתן היה לראות בקלות. DapB עזר לדמיין את הרקמה ולזהות נוירונים vagal afferent עם גרעין גדול ומוכתם קלות. בהגדלה גבוהה, פרופילים חיוביים Phox2b ניכרים.
פרופילים 2 ו-3 הם תאי Phox2b עם אותות CCK1R גבוהים ומתונים. פרופיל ארבע ביטא הן את GHSR והן את CCK1R. כתוצאה של מולטיפלקס ISH של נוירונים afferent הצוואר, התמליל PRDM12 ניתן לראות במיוחד שנצבר נוירונים afferent הממוקם גנגליון הצוואר.
בהגדלה גבוהה, אותות מתונים עבור CCK1R זוהו בפרופילים 1 ו -2. פרופיל שלוש הוא נציג של תאי PRDM12 שלילי עבור CCK1R או GHSR. עקביות של ביתור היא גורם חשוב.
חשוב באותה מידה לוודא כי הפרמטרים רכישת הדמיה אינם מייצרים אותות רקע לא רצויים. מולטיפלקס בהכלאה במקום הפך תקן הזהב מבוסס מולקולרית, במיוחד בתחום neuroanatomy. שיטה זו יכולה להיות משולבת בקלות עם אימונוהיסטוכימיה.
