이 절차는 매우 민감하며 최소한의 배경을 가진 여러 전사체를 시각화 할 수 있습니다. 이 방법은 고이질 세포 유형의 전사 프로파일의 정확한 맵을 생성할 수 있다. 절차를 시연하는 것은 저와 실험실의 연구 기술자 인 존슨 밥 마누엘 (Johnson Bob-manuel)이 될 것입니다.
해부 범위와 수술 기구의 도움으로, 각 측면에서 8 주 된 마우스에서 전체 vagal 신경절 질량을 수집하여 시작합니다. 마우스의 참수 후, 작은 집게를 사용하여 후두뼈를 노출시키기 위해 기관으로 스테르노로이드와 오모로이드 근육을 측면으로 제거한다. 경동맥, 미주 및 저혈압 신경 및 포멘 매그넘이 보일 때까지 근육과 조직의 전체 영역을 취소합니다.
그런 다음 작은 스프링 가위로 전체 저혈압 신경을 잘라냅니다. 노도스 신경절을 포라멘 매그넘에 가까운 반투명 질량으로 찾습니다. 작은 가위를 사용하여 후두 뼈를 조심스럽게 부러뜨리습니다.
경추 성 신경절을 더 노출하려면 경구 표면에 검은 멜라닌세포를 시각적 인 랜드 마크로 찾습니다. 신경절이 발견되면, 질 신경절 질량 사이의 신경 부착물을 잘라 내고 미주 신경의 말초 끝을 부드럽게 당기면서 동시에 전체 신경절 질량을 추출하기 위한 작은 스프링 가위로 뇌간을 향해 경정맥 을 절단한다. 결막 조직, 신경절 질량 및 지방미주 신경에 집착 하는 제거.
시료의 취급 및 현지화를 용이하게 하기 위하여 미주 신경의 대략 반 센티미터를 유지합니다. 1.5 밀리미터 마이크로 원심 분리 튜브에 미세 집게의 도움으로 간리아에 제거를 배치합니다. 그리고 24 시간 동안 포르말린에서 섭씨 4도에서 배양하십시오.
그리고 24 시간 동안 30 %의 자당. 인큐베이션 후, 알루미늄 호일 조각에 최적의 절삭 온도 매체의 4 밀리미터 직경의 드롭 안에 간질을 배치합니다. 그리고 드라이 아이스 의 침대에 샘플을 문구.
냉동 샘플을 영하 20도에서 14 마이크로미터 두께의 섹션으로 자르고 유리 현미경 슬라이드의 절단 섹션을 3 시리즈 42 마이크로미터 간격으로 수집합니다. PBS의 조직 섹션으로 슬라이드를 헹구십시오. 그리고 베이킹 오븐에서 섭씨 60도에서 30 분간 구워줍니다.
그런 다음 슬라이드를 섭씨 4도에서 15분 동안 4%의 포르말린으로 후지합니다. 슬라이드를 50%70% 및 100%로 각각 5분간 탈수합니다. 그리고 이중 증류수에서 헹구기 전에 10 분 동안 샘플에 과산화수소 용액을 적용하십시오.
시투 혼성화 또는 ISH의 경우 5분 동안 대상 검색 시약으로 샘플을 처리합니다. 그런 다음 샘플을 이중 증류수와 100% 에탄올로 순차적으로 헹구고 공기 건조를 합니다. 소수성 펜을 사용하여 샘플 주위에 장벽을 만듭니다.
샘플은 섭씨 40도에서 30분 동안 프로테아프로 처리되고 있으며, 프로브를 섭씨 40도에서 예열하여 사용하기 전에 실온에서 식힙니다. 오븐에서 이동한 후 하이브리드화 오븐에서 섭씨 40도에서 2시간 동안 원하는 대상 프로브 조합으로 슬라이드를 배양합니다. 디하이드로디피콜리나테 환원효소 또는 DapB를 통해 음의 대조조직을 배양하고, 섭씨 40도에서 2시간 동안 C1 프로브를 표적화한다.
슬라이드를 세척 버퍼로 헹구고 하룻밤 동안 실온에서 구연산 나트륨을 5배 나타낸 채 보관하십시오. 다음 날, 증폭 시약으로 인큐베이션 전에 세척 버퍼로 슬라이드를 헹지십시오. 그리고 원고에 설명된 바와 같이 채널 특정 시약으로 치료한다.
슬라이드를 씻은 다음 DapB로 30초 동안 트리트먼트를 받아보겠습니다. 그런 다음 즉시 각 슬라이드에 마운팅 배지를 적용하고 티슈 섹션 에 덮개 슬립을 놓습니다. 화상 진찰까지 4섭씨에서 슬라이드 홀더에 조직을 수평으로 유지합니다.
필요한 매개 변수를 설정하여 이미징을 위한 공초점 현미경을 준비합니다. 이미지의 품질을 향상시키기 위해 평균 4개, 픽셀 크기가 1024x 1024로 이미지를 획득합니다. 획득 매개 변수에 만족하면 동일한 설정을 사용하여 이미지 수집을 시작합니다.
시각화를 용이하게 하기 위해 각 채널에 거짓 색상을 특성화합니다. 디지털 이미지를 사용하여, DapB로 가볍게 염색한 핵1개의 핵을 가진 RNA 범위 양성 프로파일의 윤곽을 확인하여 세포 계수를 수행합니다. 각 성적증명서를 표현하는 RNA 범위 양성 프로파일의 백분율을 계산합니다.
네거티브 대조군조직에서 수득된 특이하지 않은 형광에 기초하여 각 레이저에 대해 최적의 획득 파라미터를 선택하였다. 젊은 성인 마우스의 노도스 신경절의 내인성 형광은 최소화됩니다. 그리고 DapB 프로브와 인큐베이션, 그것은 신호를 초래하지 않았다.
488 나노미터 레이저로 증가 된 파워 레이저와 게인에서 원치 않는 배경과 임의의 형광점이 나타납니다. RNA 범위 기술은 vagal 신경절 질량의 조직 단면도에 있는 3개의 유전자를 검출하기 위하여 적용되었습니다. 조직 프로파일은 GHSR 및 CCK1R에 대 한 긍정적인.
프로필은 노도스 신경절의 로스트랄 부분에 Phox2b와 CCK1R 성적 증명서를 모두 포함. 노도스 발신성 뉴런에서 멀티플렉스 ISH의 결과로, Phox2b 신호는 특히 노도스 신경절에 위치한 포이트 뉴런에 축적된다. CCK1R 신호 강렬 하 게 노도스 신경절에 많은 뉴런 레이블.
낮은 배율에서, 낮은 CCK1R 또는 GSHR 신호를 발현하는 세포는 쉽게 관찰할 수 없었다. DapB는 조직을 시각화하고 크고 가볍게 얼룩진 핵으로 vagal 포퍼런트 뉴런을 식별하는 데 도움이되었습니다. 높은 배율에서, Phox2b 양성 프로파일은 분명하다.
프로파일 2 및 3은 높고 적당한 CCK1R 신호를 가진 Phox2b 세포입니다. 프로필 4는 GHSR과 CCK1R을 모두 표현했습니다. 경정맥 성 신경의 멀티플렉스 ISH의 결과로, PRDM12 성적증명서는 경정맥 신경절에 위치한 포성 뉴런에서 구체적으로 축적된 것으로 볼 수 있었다.
높은 배율에서 CCK1R에 대한 적당한 신호가 프로파일 1개와 2개에서 검출되었습니다. 프로파일 3은 CCK1R 또는 GHSR에 대한 음성 PRDM12 세포의 대표이다. 해부의 일관성은 중요한 요소입니다.
이미징 획득 매개 변수가 원치 않는 배경 신호를 생성하지 않는지 확인하는 것이 똑같이 중요합니다. 멀티플렉스 현장 혼성화는 특히 신경 해부학 분야에서 확립된 분자의 금본위제가 되었습니다. 이 방법은 면역 조직 화학과 쉽게 결합 될 수있다.
