هذا الإجراء حساس للغاية ويسمح بتصور العديد من النصوص ذات الخلفية الدنيا. يمكن أن تولد هذه الطريقة خرائط دقيقة للملف الشخصي النسخي لأنواع الخلايا غير المتجانسة للغاية. إثبات الإجراء سيكون أنا وجونسون بوب مانويل، فني أبحاث في المختبر.
تبدأ بجمع كتلة ganglionic المبهم كامل من الماوس ثمانية أسابيع من العمر من كل جانب، مع مساعدة من نطاق تشريح والأدوات الجراحية. بعد قطع رأس الفأرة، استخدم ملقط صغير لإزالة الستيرنوهويد والعضلات الأوموهية الجانبية إلى القصبة الهوائية لفضح العظام القذالية. مسح المنطقة بأكملها من العضلات والأنسجة حتى الشريان السباتي، والأعصاب المبهمة والعصب تحت القباني وماغنوم foramen مرئية.
ثم قطع العصب تحت القباني بأكمله بمقص ربيعي صغير. حدد موقع العقدة العقيدية ككتلة شفافة بالقرب من ماغنوم foramen. باستخدام مقص صغير، كسر بعناية العظام القذالي.
لكشف العقدة الوداجية كذلك، حدد موقع الخلايا الصباغية السوداء على سطح الوداجي كمعلم مرئي. عندما يتم العثور على العقد، وقطع المرفقات العصبية بين كتلة العقدية المبهم وسحب بلطف على الطرف المحيطي من العصب المبهم في حين قطع في وقت واحد العقدة الوداجي نحو جذع الدماغ مع مقص الربيع الصغيرة لاستخراج الكتلة العقدية بأكملها. إزالة الأنسجة الملتحمة، كتلة العقدية والدهون الشائكة إلى العصب المبهم.
حفظ ما يقرب من نصف سنتيمتر من العصب المبهم لتسهيل التعامل مع العينات وتوطينها. وضع إزالة إلى ganglia بمساعدة ملقط غرامة في أنابيب الطرد المركزي 1.5 ملليمترات صغيرة. وحضن في أربع درجات مئوية في الفورمولين لمدة 24 ساعة.
وبعد ذلك مع 30٪ سكروز لمدة 24 ساعة. بعد الحضانة، وضع العقدة داخل قطر أربعة ملليمتر من متوسط درجة الحرارة قطع الأمثل على قطعة من رقائق الألومنيوم. وعبارة العينة على سرير من الجليد الجاف.
قطع العينات المجمدة مع cryostat إلى أقسام من سمك 14 ميكرومتر في ناقص 20 درجة مئوية وجمع أقسام قطع على الشرائح المجهر الزجاجي كما ثلاث سلاسل 42 ميكرومتر وبصرف النظر. شطف الشرائح مع أقسام الأنسجة في برنامج تلفزيوني. ويخبز لمدة 30 دقيقة على حرارة 60 درجة مئوية في فرن الخبز.
ثم، postfix الشرائح في 4٪ الفورماتين لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية. الجفاف المسلسل الشرائح في 50٪ 70٪ و 100٪ الإيثانول لمدة خمس دقائق لكل منهما. وتطبيق محلول بيروكسيد الهيدروجين على العينات لمدة 10 دقائق قبل الشطف في الماء المقطر المزدوج.
بالنسبة للتهجين في الموقع، أو ISH، تعامل مع العينات بمكشف استرجاع الهدف لمدة خمس دقائق. ثم شطف العينات بالتسلسل في الماء المقطر المزدوج والإيثانول 100٪تليها تجفيف الهواء. باستخدام قلم مسعور، قم بإنشاء حاجز حول العينات.
في حين يتم التعامل مع العينات مع بروتياز لمدة 30 دقيقة في 40 درجة مئوية وفرن التهجين، قبل الحرب المسابير في 40 درجة مئوية وتبريدها في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. بعد الانتقال من الفرن، واحتضان الشرائح مع المزيج المطلوب من المسابير الهدف لمدة ساعتين في 40 درجة مئوية في فرن التهجين. احتضان أنسجة التحكم السلبي مع اختزال ثنائي هيدروبيكولينات أو DapB، الهدف C1 التحقيق لمدة ساعتين في 40 درجة مئوية.
شطف الشرائح في عازلة غسل وتخزينها في خمس مرات سيترات الصوديوم المالحة في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، شطف الشرائح مع عازلة غسل قبل الحضانة مع الكواشف تضخيم. والتعامل مع الكواشف قناة محددة كما هو موضح في المخطوطة.
غسل الشرائح تليها العلاج مع DapB لمدة 30 ثانية. ثم تطبيق فورا المتوسطة المتصاعدة على كل شريحة ووضع زلة غطاء على قسم الأنسجة. حافظ على الأنسجة أفقية في حامل الشريحة عند أربع درجات مئوية حتى التصوير.
إعداد مجهر كونفوجكال للتصوير عن طريق تعيين المعلمات المطلوبة. الحصول على الصور مع خط متوسط من أربعة وحجم بكسل لا يقل عن 1024 بحلول عام 1024 لتحسين نوعية الصور. بمجرد الرضا عن معلمات الاستحواذ ، ابدأ في الحصول على الصور باستخدام نفس الإعدادات.
سمة الألوان الزائفة إلى كل قناة لتسهيل التصور. باستخدام الصور الرقمية، قم بإجراء عد الخلايا من خلال تحديد المخطط التفصيلي للملامح الإيجابية لنطاق الحمض النووي الريبي مع نواة واحدة ملطخة بخفة مع DapB. حساب النسبة المئوية للملامح إيجابية نطاق الجيش الملكي النيبالي التعبير عن كل نص.
تم اختيار معلمات الاستحواذ المثلى لكل ليزر استنادا إلى الفلورسينس غير المحدد الذي تم الحصول عليه في أنسجة التحكم السلبية. الفلورة الذاتية في العقدة العقيدية لفأر شاب بالغ ضئيلة. والحضانة مع مسبار DapB ، لم تسفر عن إشارات.
في زيادة ليزر الطاقة وكسب مع الليزر نانومتر 488، خلفية غير مرغوب فيها والنقاط الفلورية عشوائية تظهر. تم تطبيق تقنية نطاق الحمض النووي الريبي للكشف عن ثلاثة جينات في أقسام الأنسجة من الكتلة العقدية المبهمة. وكان ملف الأنسجة إيجابية لGHSR وCCK1R.
وشملت الملف الشخصي كل من Phox2b وCCK1R النصوص في الجزء الوردي من العقدة نودوز. نتيجة لISH متعددة في الخلايا العصبية العقيدة afferent، إشارات Phox2b تراكمت على وجه التحديد في الخلايا العصبية afferent، وتقع في العقدة نودوز. إشارات CCK1R وصفت بشكل مكثف العديد من الخلايا العصبية في العقدة العقيدات.
عند التكبير المنخفض، لا يمكن ملاحظة الخلايا التي تعبر عن إشارات CCK1R أو GSHR منخفضة بسهولة. ساعد DapB على تصور الأنسجة وتحديد الخلايا العصبية المبهمة مع نواة كبيرة وملطخة بخفة. في التكبير العالي ، تظهر ملامح إيجابية Phox2b.
ملامح اثنين وثلاث خلايا Phox2b مع إشارات CCK1R عالية ومعتدلة. وأعرب الملف الرابع عن كل من GHSR وCCK1R. نتيجة لISH متعددة من الخلايا العصبية الوداجي afferent، يمكن أن ينظر إلى نسخة PRDM12 تراكمت على وجه التحديد في الخلايا العصبية afferent تقع في العقدة الوداجية.
عند التكبير العالي، تم الكشف عن إشارات معتدلة لCCK1R في التشكيلات الشخصية 1 و 2. الملف الشخصي الثالث هو ممثل لخلايا PRDM12 السلبية لCCK1R أو GHSR. اتساق تشريح عامل مهم.
ومن المهم بنفس القدر التحقق من أن معلمات الحصول على التصوير لا تولد إشارات خلفية غير مرغوب فيها. أصبح تعدد الخلايا في الموقع التهجين المعيار الذهبي في الجزيئية المنشأة، وخاصة في مجال استئصال الأعصاب. يمكن الجمع بين هذه الطريقة بسهولة مع الكيمياء المناعية.
