Este procedimiento es altamente sensible y permite una visualización de varias transcripciones con un fondo mínimo. Este método puede generar mapas precisos del perfil transcripcional de tipos de células altamente heterogéneas. Demostrando el procedimiento estaremos Johnson Bob-manuel y yo, un técnico de investigación en el laboratorio.
Comience recolectando toda la masa ganglionar vagal del ratón de ocho semanas de edad de cada lado, con la ayuda de un endoscopio de disección e instrumentos quirúrgicos. Después de la decapitación del ratón, use pinzas pequeñas para eliminar el esternohioideo y los músculos omohioides laterales a la tráquea para exponer el hueso occipital. Limpie toda la región de músculos y tejidos hasta que la arteria carótida, el nervio vago e hipogloso y el foramen magnum sean visibles.
Luego corte todo el nervio hipogloso con pequeñas tijeras de resorte. Localice el ganglio de la dosis como una masa translúcida cerca del foramen magnum. Usando tijeras pequeñas, rompa cuidadosamente el hueso occipital.
Para exponer aún más el ganglio yugular, ubique los melanocitos negros en la superficie de la yugular como un hito visual. Cuando se encuentren los ganglios, corte las uniones nerviosas entre la masa ganglionar vagal y tire suavemente del extremo periférico del nervio vago mientras corta simultáneamente el ganglio yugular hacia el tronco encefálico con pequeñas tijeras de resorte para la extracción de toda la masa ganglionar. Retire el tejido conjuntivo, la masa ganglionar y la grasa que se adhieren al nervio vago.
Manteniendo aproximadamente medio centímetro del nervio vago para facilitar el manejo y localización de las muestras. Coloque el removedor a los ganglios con la ayuda de fórceps finos en tubos de micro centrífuga de 1,5 milímetros. E incubar a cuatro grados centígrados en formalina durante 24 horas.
Y luego con 30% de sacarosa durante 24 horas. Después de la incubación, coloque los ganglios dentro de una gota de un diámetro de cuatro milímetros de medio de temperatura de corte óptima en una pieza de papel de aluminio. Y frasee la muestra en un lecho de hielo seco.
Corte las muestras congeladas con un criostato en secciones de 14 micrómetros de espesor a menos 20 grados centígrados y recoja las secciones cortadas en los portaobjetos de microscopio de vidrio como tres series separadas por 42 micrómetros. Enjuague los portaobjetos con secciones de tejido en PBS. Y hornea durante 30 minutos a 60 grados centígrados en un horno de hornear.
Luego, coloque las diapositivas en 4% de formalina durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Deshidratar en serie los portaobjetos en 50%70% y 100% etanol durante cinco minutos cada uno. Y aplique la solución de peróxido de hidrógeno a las muestras durante 10 minutos antes de enjuagar en agua destilada doble.
Para la hibridación in situ, o ISH, trate las muestras con el reactivo de recuperación objetivo durante cinco minutos. Luego enjuague secuencialmente las muestras en agua destilada doble y etanol 100%, seguido de secado al aire. Usando una pluma hidrofóbica, cree una barrera alrededor de las muestras.
Mientras las muestras se tratan con proteasa durante 30 minutos a 40 grados centígrados y un horno de hibridación, precalentar las sondas a 40 grados centígrados y enfriarlas a temperatura ambiente antes de su uso. Después de salir del horno, incube las diapositivas con la combinación deseada de sondas objetivo durante dos horas a 40 grados centígrados en un horno de hibridación. Incubar tejido de control negativo con la dihidrodipicolinato reductasa o DapB, sonda C1 objetivo durante dos horas a 40 grados centígrados.
Enjuague los portaobjetos en tampón de lavado y guárdelo cinco veces citrato de sodio salino a temperatura ambiente durante la noche. Al día siguiente, enjuague las diapositivas con tampón de lavado antes de la incubación con reactivos de amplificación. Y tratar con reactivos específicos del canal como se describe en el manuscrito.
Lave los portaobjetos seguido de un tratamiento con DapB durante 30 segundos. Luego aplique inmediatamente el medio de montaje en cada diapositiva y coloque un deslizamiento de cubierta sobre la sección de tejido. Mantenga los tejidos horizontales en un portaobjetos a cuatro grados centígrados hasta la toma de imágenes.
Prepare un microscopio confocal para la obtención de imágenes estableciendo los parámetros requeridos. Adquiera las imágenes con un promedio de cuatro líneas y un tamaño de píxeles de al menos 1024 para 1024 para mejorar la calidad de las imágenes. Una vez satisfecho con los parámetros de adquisición, comience a adquirir las imágenes utilizando la misma configuración.
Atribuye colores falsos a cada canal para facilitar la visualización. Utilizando las imágenes digitales, realice el conteo celular identificando el contorno de los perfiles positivos del alcance del ARN con un núcleo ligeramente teñido con DapB. Calcule el porcentaje de perfiles positivos de ARN que expresan cada transcripción.
Se eligieron los parámetros óptimos de adquisición para cada láser en función de la fluorescencia inespecífica obtenida en el tejido de control negativo. La fluorescencia endógena en el ganglio de nodosis de un ratón adulto joven es mínima. Y la incubación con una sonda DapB, no dio lugar a señales.
A mayor potencia láser y ganancia con el láser de 488 nanómetros, aparecen fondos no deseados y puntos fluorescentes aleatorios. Se aplicó la técnica de alcance de ARN para detectar tres genes en secciones tisulares de la masa ganglionar vagal. El perfil tisular fue positivo para GHSR y CCK1R.
El perfil incluyó transcripciones de Phox2b y CCK1R en la parte rostral del ganglio de la nodosis. Como resultado del ISH multiplex en las neuronas aferentes nodosas, las señales Phox2b se acumularon específicamente en las neuronas aferentes, ubicadas en el ganglio de la nodosis. Las señales CCK1R marcaron intensamente muchas neuronas en el ganglio de la nodosis.
A bajo aumento, las células que expresaban señales bajas de CCK1R o GSHR no se podían observar fácilmente. DapB ayudó a visualizar el tejido e identificar neuronas aferentes vagales con un núcleo grande y ligeramente teñido. A gran aumento, los perfiles positivos de Phox2b son evidentes.
Los perfiles dos y tres son células Phox2b con señales CCK1R altas y moderadas. El perfil cuatro expresó tanto GHSR como CCK1R. Como resultado del ISH múltiplex de las neuronas aferentes yugulares, la transcripción PRDM12 se pudo ver específicamente acumulada en neuronas aferentes ubicadas en el ganglio yugular.
A gran aumento, se detectaron señales moderadas para CCK1R en los perfiles uno y dos. El perfil tres es un representante de las células PRDM12 negativas para CCK1R o GHSR. La consistencia de la disección es un factor importante.
Es igualmente importante verificar que los parámetros de adquisición de imágenes no generen señales de fondo no deseadas. La hibridación multiplex in situ se ha convertido en el estándar de oro en el establecimiento molecular, especialmente en el campo de la neuroanatomía. Este método se puede combinar fácilmente con inmunohistoquímica.
