Bu prosedür son derece hassastır ve minimum arka plana sahip birkaç transkriptin görselleştirilmesine izin verir. Bu yöntem, yüksek heterojen hücre tiplerinin transkripsiyon profilinin doğru haritalarını oluşturabilir. Prosedürü ben ve laboratuvarda araştırma teknisyeni olan Johnson Bob-manuel gösterecek.
Diseksiyon kapsamı ve cerrahi aletler yardımıyla, her iki taraftan sekiz haftalık fareden tüm vagal gangliyonik kütleyi toplayarak başlayın. Farenin kafasını kestikten sonra, oksipital kemiği ortaya çıkarmak için sternohyoid ve omohyoid kaslarını nefes borusuna yanal çıkarmak için küçük önkseçimler kullanın. Şahdamarı, vagus ve hipoglossal sinir ve foramen magnum görünene kadar tüm bölgeyi kas ve dokulardan temizleyin.
Sonra tüm hipoglossal siniri küçük yay makası ile kesin. Nodose ganglionu için foramen magnum'a yakın yarı saydam bir kütle olarak bulun. Küçük makas kullanarak oksipital kemiği dikkatlice kırın.
Şahdamar ganglionunun daha fazla açığa çıkması için, şahdamarının yüzeyindeki siyah melanositleri görsel bir dönüm noktası olarak bulun. Gangliyonlar bulunduğunda, vagal gangliyonik kütle arasındaki sinir bağlantılarını kesin ve tüm gangliyonik kütlenin çıkarılması için küçük yay makası ile beyin sapına doğru şahdamarını keserken vagus sinirinin periferik ucunun hafifçe çekilmesini sağlar. Vagus sinirine yapışan konjonktürel dokuyu, gangliyonik kütleyi ve yağı çıkarın.
Numunelerin işlenmesini ve lokalizasyonunu kolaylaştırmak için vagus sinirinin yaklaşık yarım santimetresini tutmak. 1,5 milimetre mikro santrifüj tüplerinde ince tokmaklar yardımıyla çıkarın gangliyona yerleştirin. Formalin'de 24 saat boyunca 4 santigrat derecede kuluçkaya yatır.
Ve sonra 24 saat boyunca %30 sakkarozla. Kuluçkadan sonra, gangliyonu bir alüminyum folyo parçası üzerinde dört milimetre çapında optimum kesme sıcaklığı ortamının içine yerleştirin. Ve örneği kuru buz yatağında ifade edin.
Kriyostatlı dondurulmuş numuneleri eksi 20 santigrat derecede 14 mikrometre kalınlığında bölümlere ayırın ve cam mikroskop slaytlarındaki kesim bölümlerini üç seri 42 mikrometre olarak toplayın. Slaytları PBS'de doku bölümleriyle durulayın. Ve bir fırın fırınında 60 santigrat derecede 30 dakika pişirin.
Ardından, slaytları dört santigrat derecede 15 dakika boyunca %4 formalin olarak postalayın. Slaytları her biri beş dakika boyunca %50%70 ve %100 etanol olarak seri olarak susuz bırakın. Ve çift damıtılmış suda durulamadan önce numunelere 10 dakika hidrojen peroksit çözeltisi uygulayın.
In situ hibridizasyon veya ISH için, örnekleri hedef alma reaktifi ile beş dakika boyunca tedavi edin. Daha sonra numuneleri çift damıtılmış suda ve% 100 etanolde ve ardından hava kurutmada sırayla durulayın. Hidrofobik bir kalem kullanarak, numunelerin etrafında bir bariyer oluşturun.
Numuneler 40 santigrat derecede 30 dakika boyunca proteaz ve hibridizasyon fırını ile tedavi edilirken, probları 40 santigrat derecede önceden ısıtın ve kullanmadan önce oda sıcaklığında soğutun. Fırından hareket ettikten sonra, bir hibridizasyon fırınında 40 santigrat derecede iki saat boyunca hedef probların istenen kombinasyonu ile slaytları kuluçkaya yatırın. Dihidrodipikolinat redüktaz veya DapB ile negatif kontrol dokusunu kuluçkaya yatırın, hedef C1 probu 40 santigrat derecede iki saat boyunca.
Slaytları yıkama tamponunda durulayın ve bir gecede oda sıcaklığında beş kez tuzlu sodyum sitratında saklayın. Ertesi gün, kireçlenme reaktifleri ile inkübasyondan önce slaytları yıkama tamponu ile durulayın. Ve yazıda açıklandığı gibi kanala özgü reaktiflerle tedavi edin.
Slaytları yıkayın ve ardından DapB ile 30 saniye boyunca tedavi edin. Ardından montaj ortamını hemen her kaydıraktan uygulayın ve doku bölümünün üzerine bir kapak kayması yerleştirin. Görüntülemeye kadar dokuları bir slayt tutucusunda dört santigrat derecede yatay tutun.
Gerekli parametreleri ayarlayarak görüntüleme için bir konfokal mikroskop hazırlayın. Görüntülerin kalitesini artırmak için 1024'e kadar dört satır ortalaması ve en az 1024 piksel boyutuna sahip görüntüleri elde edin. Edinme parametrelerinden memnun olduktan sonra, aynı ayarları kullanarak görüntüleri almaya başlayın.
Görselleştirmeyi kolaylaştırmak için her kanala yanlış renkler atfin. Dijital görüntüleri kullanarak, DapB ile hafifçe boyanmış bir çekirdekle RNA kapsamı pozitif profillerinin ana hatlarını tanımlayarak hücre sayımı gerçekleştirin. Her dökümü ifade eden RNA kapsamı pozitif profillerinin yüzdesini hesaplayın.
Negatif kontrol dokusunda elde edilen spesifik olmayan floresan baz alınarak her lazer için en uygun alma parametreleri seçildi. Genç bir yetişkin farenin nodose ganglionunda endojen floresan minimaldir. Ve bir DapB probu ile inkübasyon, sinyallerle sonuçlanmamıştır.
488 nanometre lazer ile artan güç lazer ve kazançta, istenmeyen arka plan ve rastgele floresan noktalar ortaya çıkar. Vagal gangliyonik kütlenin doku bölümlerindeki üç geni tespit etmek için RNA dürbün tekniği uygulandı. Doku profili GHSR ve CCK1R için pozitifti.
Profil, nodose ganglionunun rostral kısmında hem Phox2b hem de CCK1R transkriptlerini içeriyordu. Nodose afferent nöronlarda multipleks ISH'nin bir sonucu olarak, Phox2b sinyalleri özellikle nodose ganglionunda bulunan afferent nöronlarda birikir. CCK1R sinyalleri nodose ganglionunda birçok nöronun yoğun olarak etiketlendiğini işaret eder.
Düşük büyütmede, düşük CCK1R veya GSHR sinyallerini ifade eden hücreler kolayca gözlemlenemedi. DapB, dokuyu görselleştirmeye ve büyük ve hafif lekeli bir çekirdeğe sahip vagal afferent nöronları tanımlamaya yardımcı oldu. Yüksek büyütmede, Phox2b pozitif profilleri belirgindir.
profiller iki ve üç, yüksek ve orta derecede CCK1R sinyallerine sahip Phox2b hücreleridir. Profil 4 hem GHSR hem de CCK1R'yi ifade etti. Juguler afferent nöronların multipleks ISH'si sonucunda, PRDM12 transkript özellikle juguler ganglion içinde bulunan afferent nöronlarda birikmiş olarak görülebilir.
Yüksek büyütmede, bir ve ikinci profillerde CCK1R için orta derecede sinyaller tespit edildi. Profil üç, CCK1R veya GHSR için negatif prdm12 hücrelerinin bir temsilcisidir. Diseksiyonun tutarlılığı önemli bir faktördür.
Görüntüleme alma parametrelerinin istenmeyen arka plan sinyalleri oluşturmadığını doğrulamak da aynı derecede önemlidir. Multipleks In situ hibridizasyon, özellikle nöroanatomi alanında moleküler olarak kurulan altın standart haline gelmiştir. Bu yöntem immünostokimya ile kolayca birleştirilebilir.
