Este procedimento é altamente sensível e permite uma visualização de várias transcrições com mínimo de fundo. Este método pode gerar mapas precisos do perfil transcricional de tipos de células altamente heterogêneas. Demonstrando o procedimento, seremos eu e Johnson Bob-manuel, um técnico de pesquisa no laboratório.
Comece coletando toda a massa gânrmônica vagal do rato de oito semanas de cada lado, com a ajuda de um escopo dissecando e instrumentos cirúrgicos. Após a decapitação do camundongo, use pequenos fórceps para remover o esternohyide e os músculos omohióides laterais à traqueia para expor o osso occipital. Limpe toda a região dos músculos e tecidos até que a artéria carótida, o nervo vago e hipoglossal e o foramen magnum sejam visíveis.
Em seguida, corte todo o nervo hipoglossal com uma pequena tesoura de mola. Localize para o gânglio de nodose como uma massa translúcida perto do foramen magnum. Usando uma tesoura pequena, quebre cuidadosamente o osso occipital.
Para expor ainda mais o gânglio jugular, localize melanócitos negros na superfície da jugular como um marco visual. Quando os gânglios são encontrados, corte os laços nervosos entre a massa gangliônica vagal e puxe suavemente a extremidade periférica do nervo vago enquanto simultaneamente corta o gânglio jugular em direção ao tronco cerebral com pequenas tesouras de mola para a extração de toda a massa gangliônica. Remova o tecido conjuntivo, a massa gangliônica e a gordura grudada no nervo vago.
Mantendo aproximadamente meio centímetro do nervo vago para facilitar o manuseio e localização das amostras. Coloque a remoção para gânglios com a ajuda de fórceps finos em tubos de micro centrífugas de 1,5 milímetros. E incubar a 4 graus celsius em formalina por 24 horas.
E depois com 30% de sacarose por 24 horas. Após a incubação, posicione o gânglio dentro de uma gota de quatro milímetros de diâmetro de meio de temperatura de corte ideal em um pedaço de papel alumínio. E frase a amostra em um leito de gelo seco.
Corte as amostras congeladas com um criostat em seções de 14 micrômetros de espessura a menos 20 graus Celsius e colete as seções de corte nos slides do microscópio de vidro como três séries de 42 micrômetros de distância. Enxágüe as lâminas com seções teciduais em PBS. E asse por 30 minutos a 60 graus Celsius em um forno de cozimento.
Em seguida, poste os slides em 4% de formalina por 15 minutos a quatro graus Celsius. Desidratar em série os slides em 50%70% e 100% etanol por cinco minutos cada. E aplique a solução de peróxido de hidrogênio nas amostras por 10 minutos antes de enxaguar em água dupla destilada.
Para hibridização In situ, ou ISH, trate as amostras com o reagente de recuperação de destino por cinco minutos. Em seguida, enxágue sequencialmente as amostras em água dupla destilada e 100% etanol seguido de secagem de ar. Usando uma caneta hidrofóbica, crie uma barreira ao redor das amostras.
Enquanto as amostras estão sendo tratadas com protease por 30 minutos a 40 graus Celsius e um forno de hibridização, pré-aquecimento as sondas a 40 graus Celsius e esfriá-las à temperatura ambiente antes do uso. Depois de sair do forno, incubar os slides com a combinação desejada de sondas-alvo por duas horas a 40 graus Celsius em um forno de hibridização. Incubar tecido de controle negativo com a reductase dihidrodipicolinate ou DapB, sonda C1 alvo por duas horas a 40 graus Celsius.
Enxágüe os slides no tampão de lavagem e armazene em cinco vezes o citrato de sódio salino à temperatura ambiente durante a noite. No dia seguinte, enxágue os slides com tampão de lavagem antes da incubação com reagentes de amplificação. E tratar com reagentes específicos do canal como descrito no manuscrito.
Lave os slides seguidos de tratamento com DapB por 30 segundos. Em seguida, aplique imediatamente o meio de montagem em cada slide e coloque um deslizamento de cobertura sobre a seção de tecido. Mantenha os tecidos horizontais em um suporte de slides a quatro graus Celsius até a imagem.
Prepare um microscópio confocal para imagens definindo os parâmetros necessários. Adquira as imagens com uma média de quatro linhas e um tamanho de pixel de pelo menos 1024 até 1024 para melhorar a qualidade das imagens. Uma vez satisfeito com os parâmetros de aquisição, comece a adquirir as imagens usando as mesmas configurações.
Atribua cores falsas a cada canal para facilitar a visualização. Usando as imagens digitais, realize a contagem de células identificando o contorno de perfis positivos do escopo RNA com um núcleo levemente manchado com DapB. Calcule a porcentagem de perfis positivos de escopo de RNA expressando cada transcrição.
Os parâmetros de aquisição ideais foram escolhidos para cada laser com base na fluorescência inespecífica obtida no tecido de controle negativo. A fluorescência endógena no gânglio de nodose de um rato adulto jovem é mínima. E a incubação com uma sonda DapB, não resultou em sinais.
Com o aumento do laser de potência e ganho com o laser de 488 nanômetros, o fundo indesejado e os pontos fluorescentes aleatórios aparecem. A técnica de escopo de RNA foi aplicada para detectar três genes em seções teciduais da massa gangliônica vagal. O perfil tecidual foi positivo para GHSR e CCK1R.
O perfil incluía transcrições de Phox2b e CCK1R na parte rostral do gânglio nodose. Como resultado do multiplex ISH em neurônios diferentes, sinais de Phox2b especificamente acumulados em neurônios diferentes, localizados no gânglio de nodose. Os sinais CCK1R rotularam intensamente muitos neurônios no gânglio de nodose.
Em baixa ampliação, as células expressando sinais baixos de CCK1R ou GSHR não puderam ser observadas facilmente. DapB ajudou a visualizar o tecido e identificar neurônios vagos com um núcleo grande e levemente manchado. Em alta ampliação, perfis positivos de Phox2b são evidentes.
Os perfis dois e três são células Phox2b com sinais CCK1R altos e moderados. O perfil quatro expressou ghsr e CCK1R. Como resultado do multiplex ISH dos neurônios aferentes jugular, a transcrição PRDM12 pôde ser vista especificamente acumulada em neurônios diferentes localizados no gânglio jugular.
Na alta ampliação, foram detectados sinais moderados para CCK1R nos perfis um e dois. O perfil três é um representante de células PRDM12 negativas para CCK1R ou GHSR. A consistência da dissecção é um fator importante.
É igualmente importante verificar se os parâmetros de aquisição de imagens não geram sinais de fundo indesejados. Multiplex A hibridização in situ tornou-se o padrão-ouro em molecular estabelecido, especialmente no campo da neuroanatomia. Este método pode ser facilmente combinado com a imunohistoquímica.
