הדמיית סידן in vivo של Miniscope מאפשרת לחוקרים לבחון את הפעילות המרחבית והמתואמת באופן זמני ממאות נוירונים במבנים מוחיים עמוקים של בעלי חיים המתנהגים בחופשיות. הדמיית הסידן של Miniscope in vivo מציעה יתרונות רבים, כולל היכולת לבצע הקלטות שהן ספציפיות לסוג התא, בקנה מידה גדול ואורכיות. פרוטוקול הניתוח שלנו להזרקה ויראלית והשתלת עדשת GRIN תואם לכל מערכת הדמיית פוטון בודדת מסחרית או מותאמת אישית ושתי מערכות הדמיית פוטון להדמיית סידן in vivo במוח העמוק.
מי שידגים את ההליך יהיה רשמי טאפה, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. לאחר חיטוי האזור הכירורגי המגולח של עכבר מורדם, השתמש באזמל כדי לבצע חתך של שני סנטימטרים דרך העור לאורך קו האמצע כדי לחשוף את למבדה וברגמה של הגולגולת. לאחר איתור הקידוח הדנטלי בקוטר 0.5 מילימטר למיקום של 1.94 מילימטרים אחוריים קדמיים ו-0.5 מילימטרים רוחביים מדיאליים מהברגמה, התחילו לקדוח דרך הגולגולת.
לאחר מכן, טען את הנגיף למזרק המיקרוליטר באמצעות לוח הבקרה של משאבת המיקרו והמשוך 500 ננוליטרים של בועת אוויר ואחריה 800 ננוליטרים של הנגיף בקצב זרימה של 50 ננוליטרים בשנייה. הזיזו באיטיות את המחט לתוך רקמת המוח אל קואורדינטת Z הממוקדת של הגחון הגבי באורך 1.75 מילימטרים, ואז הזיזו אותה מעט עד לקואורדינטת Z של הגחון הגבי באורך 1.65 מילימטרים. בלוח הבקרה, הגדר את משאבת המיקרו להזריק 500 ננו-ליטרים של הנגיף בקצב זרימה של 50 ננו-ליטרים בדקה לפני שתלחץ על כפתור ה-Run כדי להזריק את הנגיף.
כאשר ההזרקה מסתיימת, יישרו את קצוות העור וסגרו בזהירות את החתך עם תפר 4-0. יש למרוח משחה אנטיביוטית על האזור התפור כדי למנוע זיהום. כדי להשתיל אינדקס שיפוע או עדשת GRIN, יש לשים אזור משולש של העור בגובה 1.5 ס"מ ובסיס של 1.5 ס"מ מהצד הקדמי בין העיניים לצד האחורי שמאחורי הלמבדה באמצעות מספריים עדינים.
לאחר ניקוי יסודי של הגולגולת והתייבשות, יש למרוח ציאנואקרילט על קצות העור ולהצמיד את העור לגולגולת. לאחר חמש דקות כאשר הציאנואקרילט מתייבש, אתרו בור מקדחה דנטלי בקוטר 1.2 מילימטר למיקום של 1.94 מילימטרים אחוריים קדמיים, 0.8 מילימטרים רוחביים מדיאליים מהברגמה. קודחים דרך הגולגולת, ולאחר מכן מסירים את הדורה באמצעות קצה מחט של 30 מדים.
נקו את כל פיסות פסולת העצם עם מלקחיים חדים בזווית של 45 מעלות. לאחר מכן, חברו מחט קצה קהה מלוטשת ידנית של 27 מדים למחזיק המחט המוצמדת לזרוע רובוטית מוטה בזווית של 10 מעלות וחברו את הקצה השני של מחזיק המחט למערכת הוואקום הביתית. אתר את קצה המחט רק כדי לגעת בברגמא לפני שתלחץ על כפתור Bregma כדי להגדיר את קואורדינטת Z של bregma לאפס.
הגדר את ערך הקלט X ל- 0.8, הזן ערך Y ל- 1.94, הזן את ערך Z ל- 1.0 ולחץ על חפש כפתור כדי להזיז את המחט לראש החור שנקדח בגולגולת. מרכזים את קצה המחט אל החור שנקדח ומורידים אותה למצב Z אפס. הפעילו את הוואקום והתחילו לשטוף את אזור המוח החשוף בנוזל מוחי מלאכותי, או ACSF, באמצעות מערכת צינורות מבוקרת כבידה המחוברת למחט של 30 מדים עם קצה כפוף.
ACSF מבעבע באופן רציף עם תערובת גזים של 95% חמצן ו-5% פחמן דו חמצני תוך כדי סינון דרך מסנן של 0.2 מיקרון. באמצעות תוכנת AutoStereota, השאיפה של רקמת המוח תושלם בארבעה סבבים. עבור הסיבוב הראשון של השאיפה, ודא שהערך Z מציג אפס.
לאחר מכן, בהפעלה zStep, לחץ ובדוק את השורה הראשונה והשנייה. הגדר את הערכים עבור השורה הראשונה ל- 0.2 ו- 1. הגדר את הערכים עבור השורה השנייה ל- 0.15 ו- 4.
בהפעלה 'מצב', הגדר את גודל המחט 27 ו-1.2. סט דימס 0.9. כל הערכים האחרים יהיו ברירת המחדל.
כדי להתחיל את השאיפה, לחץ ברצף על הלחצנים NotSet, KeepZero ו-Start. הסיבוב הראשון של השאיפה יוצר כיס עמוד עם עומק של 0.8 מילימטרים וקוטר של מילימטר אחד. בסיבוב השלישי של השאיפה, לחץ ובדוק את השורה הראשונה עבור הפעלת zStep והגדר את הערכים עבור השורה הראשונה ל- 1.8 ו- 1.
בהפעלה 'מצב', הגדר את גודל המחט 27 ו- 2.2. התחל את השאיפה על ידי שמירה על ערכים אחרים זהים לאלה של הסיבוב הקודם. לאחר הסיבוב השלישי של השאיפה, עומק כיס העמוד הוא 1.8 מילימטרים.
הסיבוב האחרון של השאיפה הוא לנקות את הדם שהצטבר בתחתית הכיס. הגדר את הערכים עבור השורה הראשונה ל- 1.6 ו- 1 בהפעלת zStep והגדר גודל מחט 27 מד ו- 2.2 ו- Dims 0.6 בהפעלת מצב לפני תחילת השאיפה. ברגע שהכיס נקי מדם, עצרו את הוואקום, הפסיקו את ההשקיה של ACSF והביאו את המחט למעלה 2 מילימטרים בקואורדינטות Z ו-0.5 מילימטרים קדמיים למרכז.
הכניסו את עדשת ה-GRIN הסטרילית בקוטר 1 מילימטר לכיס רקמת המוח. לאחר מכן, יש למרוח את האגרוז המומס במרווח שבין עדשת ה-GRIN לרקמת המוח בעזרת מרית. לאחר agarose יוצר ג'ל, להסיר עודף agarose באמצעות להב מיקרו.
מערבבים את אבקת המלט הדנטלית ואת נוזל הזרזים בבאר ערבוב מצוננת מראש ומורחים שכבה של מלט שרף דבק מרפא את עצמו על הגולגולת, החל מהקפת עדשת ה-GRIN ולאחר מכן כיסוי כל הגולגולת החשופה. בבאר פלסטיק נקייה, מערבבים אבקת מלט דנטלית ופחם שחור עם נוזל כדי למרוח שכבה דקה של התערובת על גבי השכבה הראשונה של המלט הדנטלי. תנו לו להתקשות במשך חמש דקות.
חבר את המיניסקופ לכבל והפעל את התוכנה שפותחה בהתאמה אישית NuView. ב- NuView, לחץ על חומרה, בדוק את LED1 ולחץ על הזרם כפתור כדי להציג את התמונות החיות. כדי להפסיק את ההזרמה בשידור חי, לחץ על עצור כפתור.
לאחר מכן, התיישבו המיניסקופ בזרוע האחיזה של מיניסקופ שנבנתה בהתאמה אישית. בעזרת בקרים ממונעים, אתרו את המיניסקופ ממש מעל עדשת ה-GRIN החשופה, מה שהופך אותה למקבילה לפני השטח של העדשה. הורידו באיטיות את המיניסקופ לכיוון עדשת ה-GRIN והתאימו את מיקום ה-Z שלו עד שיימצא מישור המיקוד הטוב ביותר.
יש למרוח את השכבה הראשונה של מלט דנטלי סביב בסיס המיניסקופ מבלי לשנות את מיקום המיניסקופ. לאחר הקשחת המלט, הסר בעדינות את הזרוע המחזיקה כך שהמיניסקופ יוכל לעמוד בפני עצמו על ראש העכבר. יש למרוח שכבה שנייה של מלט דנטלי סביב הבסיס כדי למלא את כל הפערים, ולוודא שאין דליפת נורת LED מהמרווחים.
תנו למלט הדנטלי להתקשות. לאחר הרדמה קצרה של העכבר עם איזופלורן, שחררו את בורג הנעילה בבסיס עם מברג קטן לפני הסרת מכסה המגן ונקו את פני השטח של עדשת GRIN עם צמר גפן ספוג אצטון. חברו את המיניסקופ לכבל והפעילו את תוכנת NuView כדי להתחיל לזהות את מישור המוקד הטוב ביותר עם התאמת מיקום המיניסקופ ביחס לבסיס על ידי הידוק קל או התרופפות בעזרת מלקחיים קהים.
לאחר קביעת מישור המוקד הטוב ביותר, הדקו את בורג הנעילה לפני ניתוק הכבל והנחת העכבר בחזרה בכלוב הביתי שלו. הפעל את תוכנת מצלמת ההתנהגות כדי להציג את זירת התנהגות העכבר באמצעות פונקציית שידור חי. כוונו באופן ידני את המיקוד של המצלמה העליונה.
בחר הפעל Strobe ובדוק את הפעל /השבת את ההדק, ולאחר מכן לחץ על לחצן הקלט. לאחר מכן השתמש ב- Browse כדי לבחור מיקום שבו יישמרו הקלטות התנהגות. בחר את תבנית התמונה הרצויה.
קירבו את העכבר לזירה וחברו את המיניסקופ לכבל המקושר למערכת איסוף הנתונים. לאחר מכן הניחו את העכבר במרכז הזירה. בתוכנת מצלמת ההתנהגות, לחץ על התחל הקלטה.
ב- NuView, בדוק את LED1, לחץ על Capture ולאחר מכן הפעל לחצנים כדי להתחיל להקליט. זה מאפשר הקלטות בו זמנית של הדמיית סידן והתנהגות עכבר. לחץ על עצור אחרי 3, 000 מסגרות ושמור את הקבצים.
בסיום ההקלטה, הרדימו לזמן קצר את העכבר עם איזופלורן, נתקו את המיניסקופ מהבסיס והניחו את מכסה המגן מעל הבסיס לפני שהחזירו את העכבר לכלוב הביתי שלו. מפת התאים מהדמיית סידן in vivo תת-אופטימלית הכילה כמה תאי עצב פעילים, בעוד שמתוך הדמיה מוצלחת כללה כמה מאות נוירונים פעילים באזור הממוקד. בדוגמה הטיפוסית של הדמיית סידן in vivo לא מוצלחת, האזור נצפה כהה והכיל פחות מחמישה נוירונים פעילים, או שהאזור היה בהיר אך לא היו בו נוירונים פעילים.
בניתוח הייצוגי מוצגים מפת התאים הפלואורסצנטיים של ההקרנה המקסימלית וחלופי סידן מרישום רציף של הדמיית סידן in vivo. ההערכה שלאחר המוות לביטוי GCaMP6f והשתלת עדשת GRIN ב-PFC המדיאלי של עכבר ניסיוני הצביעה על כך ש-GCaMP6f הובטא ועדשת ה-GRIN הושתלה במדויק באזור המוח הרצוי. כדי לקבל הדמיית סידן טובה, יש צורך להבטיח כי הדימום נעצר לחלוטין ואת השדה נקי קרישי דם לפני השתלת עדשת GRIN.
ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לחקור שינויים במעגלים עצביים במודל העכברים של הפרעות מוחיות אנושיות שונות ולבדוק אם מועמד לתרופה יכול לנרמל את המעגלים שהשתנו.
