Miniskop in vivo kalsiyum görüntüleme, araştırmacıların serbestçe davranan hayvanların derin beyin yapılarındaki yüzlerce nörondan mekansal ve geçici olarak koordine edilmiş aktiviteyi incelemelerini sağlar. Miniskop in vivo kalsiyum görüntüleme, hücre tipine özgü, büyük ölçekli ve uzunlamasına kayıtlar yapma yeteneği de dahil olmak üzere birçok avantaj sunar. Viral enjeksiyon ve GRIN lens implantasyonu için cerrahi protokolümüz, derin beyin in vivo kalsiyum görüntüleme için herhangi bir ticari veya özel yapım tek foton ve iki foton görüntüleme sistemi ile uyumludur.
Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi olan Rashmi Thapa olacak. Anestezi uygulanan bir farenin tıraş edilmiş cerrahi alanını dezenfekte ettikten sonra, kafatasının lambda ve bregmasını ortaya çıkarmak için orta hat boyunca deriden iki santimetrelik bir kesi yapmak için bir neşter kullanın. 0,5 milimetrelik dental matkap çapağını anterior posterior 1,94 milimetre ve medial lateral 0,5 milimetre pozisyonuna getirdikten sonra, kafatasını delmeye başlayın.
Daha sonra, mikro pompanın kontrol panelini kullanarak virüsü mikrolitre şırıngaya yükleyin ve saniyede 50 nanolitre akış hızında 500 nanolitre hava kabarcığı ve ardından 800 nanolitre virüs çekin. İğneyi yavaşça beyin dokusuna 1.75 milimetrelik dorsal ventralin hedeflenen Z koordinatına doğru hareket ettirin ve ardından hafifçe dorsal ventral 1.65 milimetrenin Z koordinatına kadar hareket ettirin. Kontrol panelinde, virüsü enjekte etmek için Çalıştır düğmesine basmadan önce mikro pompayı dakikada 50 nanolitre akış hızında 500 nanolitre virüs enjekte edecek şekilde ayarlayın.
Enjeksiyon bittiğinde, cilt kenarlarını hizalayın ve insizyonu 4-0 dikişle dikkatlice kapatın. Enfeksiyonu önlemek için dikişli bölgeye antibiyotik merhem uygulayın. Degrade indeksi veya GRIN lensi implante etmek için, ince makas kullanarak cildin 1,5 santimetre yüksekliğinde ve 1,5 santimetre tabandaki üçgen bir alanını, gözler arasındaki ön taraftan lambda'nın arkasındaki arka tarafa kadar çıkarın.
Kafatası iyice temizlendikten ve kurutulduktan sonra, cildin kenarlarına siyanoakrilat uygulayın ve cildi kafatasına takın. Siyanoakrilat kuruduğunda beş dakika sonra, 1.2 milimetre çapında bir diş matkap çapağını anterior posterior 1.94 milimetre, medial lateral 0.8 milimetre pozisyonuna getirin. Kafatasını delin, ardından 30 gauge iğne ucu kullanarak dura'yı çıkarın.
Tüm kemik kalıntılarını 45 derece açılı keskin forseps ile temizleyin. Daha sonra, 10 derecelik bir açıyla eğilmiş bir robotik kola bağlı iğne tutucuya manuel olarak parlatılmış bir 27 gauge künt uç iğnesi takın ve iğne tutucunun diğer ucunu ev vakum sistemine bağlayın. Bregma'nın Z koordinatını sıfıra ayarlamak için Bregma düğmesine tıklamadan önce iğnenin ucunu sadece bregma'ya dokunmak için bulun.
Giriş X değerini 0,8, giriş Y değerini 1,94, giriş Z değerini 1,0 olarak ayarlayın ve iğneyi kafatasındaki delinmiş deliğin üstüne taşımak için Bul düğmesine tıklayın. İğnenin ucunu delinmiş deliğe ortalayın ve Z pozisyonu sıfıra indirin. Vakumu açın ve maruz kalan beyin bölgesini, bükülmüş uçlu 30 gauge bir iğneye bağlı yerçekimi kontrollü bir boru sistemi aracılığıyla yapay beyin omurilik sıvısı veya ACSF ile durulamaya başlayın.
ACSF, 0,2 mikronluk bir filtreden süzülürken,% 95 oksijen ve% 5 karbondioksit gaz karışımı ile sürekli olarak kabarcıklanır. AutoStereota yazılımını kullanarak, beyin dokusunun aspirasyonu dört turda tamamlanacaktır. İlk aspirasyon turu için, Z değerinin sıfır görüntülediğinden emin olun.
Ardından zStep oturumunda, birinci ve ikinci satırları tıklayıp kontrol edin. İlk satırın değerlerini 0,2 ve 1 olarak ayarlayın. İkinci satırın değerlerini 0,15 ve 4 olarak ayarlayın.
Mod oturumunda, iğne boyutunu 27 ölçer ve 1,2 olarak ayarlayın. Dims 0.9'u ayarlayın. Diğer tüm değerler varsayılan olacaktır.
Aspirasyonu başlatmak için sırayla NotSet, KeepZero ve Start düğmelerine tıklayın. İlk aspirasyon turu, 0,8 milimetre derinliğinde ve 1 milimetre çapında bir sütun cebi oluşturur. Üçüncü aspirasyon turunda, zStep oturumu için ilk satırı tıklayıp kontrol edin ve ilk satırın değerlerini 1,8 ve 1 olarak ayarlayın.
Mod oturumunda, iğne boyutunu 27 ölçer ve 2,2 olarak ayarlayın. Diğer değerleri önceki turunkiyle aynı tutarak aspirasyona başlayın. Üçüncü aspirasyon turundan sonra, sütun cebinin derinliği 1,8 milimetredir.
Son aspirasyon turu, cebin dibinde biriken kanı temizlemektir. zStep oturumunda ilk satırın değerlerini 1,6 ve 1 olarak ayarlayın ve aspirasyona başlamadan önce Mod oturumunda iğne boyutu 27 ölçer ve 2,2 ve Dims 0,6 olarak ayarlayın. Cep kansız hale geldiğinde, vakumu durdurun, ACSF'nin sulanmasını durdurun ve iğneyi Z koordinatında 2 milimetre ve merkeze 0,5 milimetre önden getirin.
Steril 1 milimetre GRIN lensi beyin dokusu cebine yerleştirin. Daha sonra, erimiş agarozu GRIN lens ve beyin dokusu arasındaki boşluğa bir spatula yardımıyla uygulayın. Agaroz bir jel oluşturduktan sonra, bir mikro bıçak kullanarak fazla agarozu çıkarın.
Diş çimento tozunu ve katalizör sıvısını önceden soğutulmuş bir karıştırma kuyusunda karıştırın ve GRIN lensini çevreleyerek ve daha sonra maruz kalan tüm kafatasını kaplayarak kafatasına kendi kendine sertleşen yapışkan reçine çimento tabakası uygulayın. Temiz bir plastik kutuda, ilk diş çimentosu tabakasının üzerine karışımın ince bir tabakasını uygulamak için diş çimento tozu ve siyah odun kömürünü sıvı ile karıştırın. Beş dakika sertleşmesine izin verin.
Miniscope'u kabloya bağlayın ve özel olarak geliştirilen NuView yazılımını açın. NuView'da Donanım'a tıklayın, LED1'i kontrol edin ve canlı görüntüleri görüntülemek için Akış düğmesine tıklayın. Canlı yayını durdurmak için, Durdur düğmesine tıklayın.
Ardından, Miniscope'u özel yapım bir Miniscope tutma koluna yerleştirin. Motorlu kontrolörlerin yardımıyla, Miniscope'u açıkta kalan GRIN lensin hemen üzerine yerleştirin ve lensin yüzeyine paralel hale getirin. Miniskopu GRIN lense doğru yavaşça indirin ve en iyi netleme düzlemi bulunana kadar Z konumunu ayarlayın.
Miniscope'un konumunu değiştirmeden Miniscope tabanının etrafına ilk diş çimentosu tabakasını uygulayın. Çimento sertleştikten sonra, Miniscope'un fare kafasında kendi başına durabilmesi için tutma kolunu yavaşça çıkarın. Tüm boşlukları doldurmak için tabanın etrafına ikinci bir diş çimentosu tabakası uygulayın, boşluklardan LED ışık sızıntısı olmadığından emin olun.
Diş çimentosunun sertleşmesine izin verin. Fareyi izofluran ile kısa bir süre uyuşturduktan sonra, koruyucu kapağı çıkarmadan önce tabandaki kilitleme vidasını küçük bir tornavida ile gevşetin ve GRIN lensin yüzeyini asetonla ıslatılmış pamuklu çubukla temizleyin. Miniscope'u kabloya bağlayın ve künt forseps yardımıyla hafifçe sıkarak veya gevşeterek Miniscope'un tabana göre konumunu ayarlayarak en iyi odak düzlemini tanımlamaya başlamak için NuView yazılımını başlatın.
En iyi odak düzlemi belirlendikten sonra, kablonun bağlantısını kesmeden ve fareyi tekrar ev kafesine yerleştirmeden önce kilitleme vidasını sıkın. Fare davranış alanını bir canlı yayın işlevi aracılığıyla görüntülemek için davranış kamerası yazılımını açın. Üst kameranın odağını manuel olarak ayarlayın.
Trigger Strobe (Tetikleyici Flaşörü) öğesini seçin ve enable/disable trigger (Tetikleyiciyi etkinleştir/devre dışı bırak) seçeneğini işaretleyin ve ardından Record (Kaydet) düğmesini tıklayın. Ardından, davranış kayıtlarının kaydedileceği konumu seçmek için Gözat'ı kullanın. İstediğiniz görüntü formatını seçin.
Fareyi arenaya yaklaştırın ve Miniscope'u veri toplama sistemine bağlı kabloya bağlayın. Ardından fareyi arenanın ortasına yerleştirin. Behavior camera yazılımında, Kaydı Başlat'ı tıklatın.
NuView'da LED1'i kontrol edin, Yakala'ya tıklayın ve ardından kayda başlamak için düğmeleri tetikleyin. Bu, kalsiyum görüntüleme ve fare davranışının eşzamanlı olarak kaydedilmesini sağlar. 3.000 kare sonra Durdur'a basın ve dosyaları kaydedin.
Kayıt tamamlandığında, fareyi izofluran ile kısaca uyuşturun, Miniscope'u tabandan ayırın ve fareyi ana kafesine geri yerleştirmeden önce koruyucu kapağı tabanın üzerine yerleştirin. Suboptimal in vivo kalsiyum görüntülemeden elde edilen hücre haritası bazı aktif nöronlar içerirken, başarılı görüntülemeden odaklanmış alanda yüzlerce aktif nöron içeriyordu. Başarısız bir in vivo kalsiyum görüntülemenin tipik örneğinde, bölgenin karanlık olduğu ve beşten az aktif nöron içerdiği gözlendi veya bölge parlaktı ancak aktif nöronları yoktu.
Temsili analizde, maksimum projeksiyon floresan hücre haritası ve ardışık in vivo kalsiyum görüntüleme kaydından kalsiyum geçicileri gösterilmiştir. Deneysel bir farenin medial PFC'sinde GCaMP6f ekspresyonu ve GRIN lens implantasyonu için postmortem değerlendirme, GCaMP6f'nin eksprese edildiğini ve GRIN lensin tam olarak istenen beyin bölgesine implante edildiğini göstermiştir. İyi bir kalsiyum görüntüleme elde etmek için, GRIN lensini implante etmeden önce kanamanın tamamen durduğundan ve alanın kan pıhtılarından arındırıldığından emin olmak gerekir.
Bu teknik, farklı insan beyni bozukluklarının fare modelindeki nöral devre değişikliklerini incelemek ve bir ilaç adayının değiştirilmiş devreyi normalleştirip normalleştiremeyeceğini test etmek için kullanılabilir.
