Injection virale stéréotaxique et implantation de lentilles à indice de gradient pour l’imagerie calcique in vivo du cerveau profond

L’imagerie calcique in vivo Miniscope permet aux chercheurs d’examiner l’activité coordonnée spatialement et temporellement de centaines de neurones dans les structures cérébrales profondes d’animaux se comportant librement. L’imagerie calcique in vivo Miniscope offre de nombreux avantages, notamment la possibilité d’effectuer des enregistrements spécifiques au type de cellule, à grande échelle et longitudinal. Notre protocole chirurgical pour l’injection virale et l’implantation de lentilles GRIN est compatible avec tous les systèmes d’imagerie à photon unique et à deux photons commerciaux ou personnalisés pour l’imagerie calcique in vivo du cerveau profond.

Rashmi Thapa, un étudiant diplômé de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Après avoir désinfecté la zone chirurgicale rasée d’une souris anesthésiée, utilisez un scalpel pour faire une incision de deux centimètres à travers la peau le long de la ligne médiane pour exposer le lambda et le bregma du crâne. Après avoir localisé la bavure de forage dentaire de 0,5 millimètre dans une position antérieure postérieure de 1,94 millimètre et latérale médiale de 0,5 millimètre à partir de la bregma, commencez à percer le crâne.

Ensuite, chargez le virus dans la seringue de microlitre à l’aide du panneau de commande de la micropompe et retirez 500 nanolitres de bulle d’air suivis de 800 nanolitres du virus à un débit de 50 nanolitres par seconde. Descendez lentement l’aiguille dans le tissu cérébral jusqu’à la coordonnée Z ciblée de 1,75 millimètre ventral dorsal, puis déplacez-la légèrement jusqu’à la coordonnée Z de ventral dorsal de 1,65 millimètre. Sur le panneau de commande, réglez la micro-pompe pour injecter 500 nanolitres du virus au débit de 50 nanolitres par minute avant d’appuyer sur le bouton Exécuter pour injecter le virus.

Lorsque l’injection est terminée, alignez les bords de la peau et fermez soigneusement l’incision avec une suture 4-0. Appliquez une pommade antibiotique sur la zone cousue pour prévenir l’infection. Pour implanter un indice de gradient ou une lentille GRIN, excisez une zone triangulaire de la peau de 1,5 centimètre de hauteur et une base de 1,5 centimètre de la face antérieure entre les yeux vers la face postérieure derrière le lambda à l’aide de ciseaux fins.

Une fois le crâne soigneusement nettoyé et séché, appliquez du cyanoacrylate sur les bords de la peau et attachez la peau au crâne. Après cinq minutes, lorsque le cyanoacrylate sèche, localisez une bavure de forage dentaire de 1,2 millimètre de diamètre à une position postérieure antérieure de 1,94 millimètre, latérale médiale de 0,8 millimètre du bregma. Percez à travers le crâne, puis retirez la dure-mère à l’aide d’une pointe d’aiguille de calibre 30.

Nettoyez tous les débris osseux avec des pinces pointues inclinées à 45 degrés. Ensuite, fixez une aiguille d’extrémité émoussée polie manuellement de calibre 27 au porte-aiguille couplé à un bras robotique incliné avec un angle de 10 degrés et connectez l’autre extrémité du porte-aiguille au système d’aspirateur de la maison. Localisez la pointe de l’aiguille pour simplement toucher le bregma avant de cliquer sur le bouton Bregma pour régler la coordonnée Z du bregma sur zéro.

Définissez la valeur x d’entrée sur 0,8, la valeur d’entrée Y sur 1,94, la valeur d’entrée Z sur 1,0 et cliquez sur le bouton Rechercher pour déplacer l’aiguille sur le dessus du trou percé sur le crâne. Centrez la pointe de l’aiguille sur le trou percé et ramenez-la à la position Z zéro. Allumez le vide et commencez à rincer la zone cérébrale exposée avec du liquide céphalo-rachidien artificiel, ou ACSF, à l’aide d’un système de tuyauterie à gravité contrôlée relié à une aiguille de calibre 30 avec une pointe pliée.

ACSF est continuellement bouillonné avec un mélange gazeux de 95% d’oxygène et 5% de dioxyde de carbone tout en étant filtré à travers un filtre de 0,2 micron. En utilisant le logiciel AutoStereota, l’aspiration du tissu cérébral se terminera en quatre tours. Pour le premier tour d’aspiration, assurez-vous que la valeur Z affiche zéro.

Ensuite, dans la session zStep, cliquez et vérifiez les première et deuxième lignes. Définissez les valeurs de la première ligne sur 0,2 et 1. Définissez les valeurs de la deuxième ligne sur 0,15 et 4.

En mode session, réglez la taille de l’aiguille 27 jauge et 1.2. Réglez Dims 0,9. Toutes les autres valeurs seront par défaut.

Pour démarrer l’aspiration, cliquez séquentiellement sur les boutons NotSet, KeepZero et Start. Le premier cycle d’aspiration génère une poche colonne de 0,8 millimètre de profondeur et 1 millimètre de diamètre. Dans le troisième cycle d’aspiration, cliquez et vérifiez la première ligne de la session zStep et définissez les valeurs de la première ligne sur 1,8 et 1.

En mode session, réglez la taille de l’aiguille 27 jauge et 2.2. Commencez l’aspiration en gardant les autres valeurs les mêmes que celles du tour précédent. Après le troisième cycle d’aspiration, la profondeur de la poche de la colonne est de 1,8 millimètre.

La dernière série d’aspirations consiste à nettoyer le sang accumulé au fond de la poche. Définissez les valeurs de la première ligne sur 1,6 et 1 dans la session zStep et définissez la taille de l’aiguille 27 jauge et 2,2 et Dims 0,6 dans la session Mode avant de commencer l’aspiration. Une fois que la poche est libre de sang, arrêtez le vide, arrêtez l’irrigation de l’ACSF et amenez l’aiguille de 2 millimètres en coordonnée Z et de 0,5 millimètre avant au centre.

Placez la lentille GRIN stérile de 1 millimètre dans la poche de tissu cérébral. Ensuite, appliquez l’agarose fondue dans l’espace entre la lentille GRIN et le tissu cérébral à l’aide d’une spatule. Après que l’agarose a formé un gel, éliminer l’excès d’agarose à l’aide d’une micro lame.

Mélangez la poudre de ciment dentaire et le liquide catalyseur dans un puits de mélange pré-refroidi et appliquez une couche de ciment de résine adhésive auto-durcissant sur le crâne, en commençant par entourer la lentille GRIN, puis en recouvrant tout le crâne exposé. Dans un puits en plastique propre, mélangez la poudre de ciment dentaire et le charbon de bois noir avec du liquide pour appliquer une fine couche du mélange sur la première couche de ciment dentaire. Laissez durcir pendant cinq minutes.

Connectez le Miniscope au câble et allumez le logiciel personnalisé NuView. Dans NuView, cliquez sur Matériel, cochez LED1 et cliquez sur le bouton Flux pour afficher les images en direct. Pour arrêter la diffusion en direct, cliquez sur le bouton Arrêter.

Ensuite, installez le Miniscope dans un bras de maintien Miniscope sur mesure. À l’aide de contrôleurs motorisés, localisez le Miniscope juste au-dessus de l’objectif GRIN exposé, en le rendant parallèle à la surface de l’objectif. Abaissez lentement le Miniscope vers l’objectif GRIN et ajustez sa position Z jusqu’à ce que le meilleur plan de mise au point soit trouvé.

Appliquez la première couche de ciment dentaire autour de la base du Miniscope sans modifier la position du Miniscope. Une fois le ciment durci, retirez doucement le bras de maintien de sorte que le Miniscope puisse se tenir seul sur la tête de la souris. Appliquez une deuxième couche de ciment dentaire autour de la base pour combler tous les espaces, en vous assurant qu’il n’y a pas de fuite de lumière LED des espaces.

Laissez le ciment dentaire durcir. Après avoir brièvement anesthésié la souris avec de l’isoflurane, desserrez la vis de verrouillage de la base avec un petit tournevis avant de retirer le capuchon de protection et nettoyez la surface de la lentille GRIN avec un coton-tige imbibé d’acétone. Connectez le Miniscope au câble et démarrez le logiciel NuView pour commencer à identifier le meilleur plan focal en ajustant la position du Miniscope par rapport à la base en resserrant ou en desserrant légèrement à l’aide de pinces contondantes.

Une fois le meilleur plan focal déterminé, serrez la vis de verrouillage avant de déconnecter le câble et de replacer la souris dans sa cage d’origine. Activez le logiciel de la caméra de comportement pour afficher l’arène de comportement de la souris via une fonction de diffusion en direct. Réglez manuellement la mise au point de l’appareil photo supérieur.

Sélectionnez Trigger Strobe et cochez activer/désactiver le déclencheur, puis cliquez sur le bouton Enregistrer. Utilisez ensuite Parcourir pour sélectionner un emplacement où les enregistrements de comportement seront enregistrés. Sélectionnez le format d’image souhaité.

Rapprochez la souris de l’arène et connectez le Miniscope au câble relié au système d’acquisition de données. Placez ensuite la souris au centre de l’arène. Dans le logiciel de la caméra de comportement, cliquez sur Démarrer l’enregistrement.

Dans NuView, cochez LED1, cliquez sur Capturer, puis déclenchez des boutons pour démarrer l’enregistrement. Cela permet des enregistrements simultanés de l’imagerie calcique et du comportement de la souris. Appuyez sur Arrêter après 3 000 images et enregistrez les fichiers.

Lorsque l’enregistrement est terminé, anesthésiez brièvement la souris avec de l’isoflurane, détachez le Miniscope de la base et placez le capuchon de protection sur la base avant de replacer la souris dans sa cage d’origine. La carte cellulaire de l’imagerie calcique in vivo sous-optimale contenait des neurones actifs, tandis que celle de l’imagerie réussie comprenait plusieurs centaines de neurones actifs dans la zone ciblée. Dans l’exemple typique d’une imagerie calcique in vivo infructueuse, on a observé que la région était sombre et contenait moins de cinq neurones actifs, ou que la région était brillante mais n’avait pas de neurones actifs.

Dans l’analyse représentative, la carte cellulaire de fluorescence de projection maximale et les transitoires calciques d’un enregistrement in vivo successif d’imagerie calcique sont montrés. L’évaluation post-mortem de l’expression de GCaMP6f et de l’implantation de lentilles GRIN dans le PFC médial d’une souris expérimentale a indiqué que GCaMP6f a été exprimé et que la lentille GRIN a été implantée avec précision dans la région cérébrale souhaitée. Pour obtenir une bonne imagerie calcique, il est nécessaire de s’assurer que le saignement s’est complètement arrêté et que le champ est exempt de caillots sanguins avant d’implanter la lentille GRIN.

Cette technique peut être utilisée pour étudier les changements de circuit neuronal dans le modèle murin de différents troubles cérébraux humains et tester si un candidat médicament peut normaliser les circuits altérés.