Miniscope in vivo calcium imaging consente ai ricercatori di esaminare l'attività coordinata spazialmente e temporalmente da centinaia di neuroni in strutture cerebrali profonde di animali che si comportano liberamente. L'imaging del calcio miniscopio in vivo offre molti vantaggi, tra cui la possibilità di eseguire registrazioni specifiche per tipo di cellula, su larga scala e longitudinali. Il nostro protocollo chirurgico per l'iniezione virale e l'impianto di lenti GRIN è compatibile con qualsiasi sistema di imaging a singolo fotone e due fotoni commerciali o personalizzati per l'imaging del calcio in vivo nel cervello profondo.
A dimostrare la procedura sarà Rashmi Thapa, uno studente laureato del mio laboratorio. Dopo aver disinfettato l'area chirurgica rasata di un topo anestetizzato, utilizzare un bisturi per fare un'incisione di due centimetri attraverso la pelle lungo la linea mediana per esporre la lambda e il bregma del cranio. Dopo aver localizzato la bava dentale da 0,5 millimetri in una posizione posteriore anteriore di 1,94 millimetri e laterale mediale a 0,5 millimetri dal bregma, iniziare a perforare il cranio.
Quindi, caricare il virus nella siringa del microlitri utilizzando il pannello di controllo della micro pompa e prelevare 500 nanolitri di bolle d'aria seguiti da 800 nanolitri del virus ad una portata di 50 nanolitri al secondo. Spostare lentamente l'ago nel tessuto cerebrale fino alla coordinata Z mirata di 1,75 millimetri ventrali dorsali e quindi spostarlo leggermente fino alla coordinata Z del ventrale dorsale di 1,65 millimetri. Sul pannello di controllo, impostare la micropompa per iniettare 500 nanolitri del virus alla portata di 50 nanolitri al minuto prima di premere il pulsante Esegui per iniettare il virus.
Al termine dell'iniezione, allineare i bordi della pelle e chiudere con attenzione l'incisione con una sutura 4-0. Applicare un unguento antibiotico sulla zona cucita per prevenire l'infezione. Per impiantare l'indice di gradiente o la lente GRIN, asportare un'area triangolare della pelle di 1,5 centimetri di altezza e 1,5 centimetri di base dal lato anteriore tra gli occhi al lato posteriore dietro la lambda usando forbici fini.
Dopo che il cranio è stato accuratamente pulito e asciugato, applicare cianoacrilato sui bordi della pelle e attaccare la pelle al cranio. Dopo cinque minuti, quando il cianoacrilato si asciuga, individuare una bava per trapano dentale di 1,2 millimetri di diametro in una posizione posteriore anteriore di 1,94 millimetri, laterale mediale a 0,8 millimetri dal bregma. Perforare il cranio, seguito dalla rimozione della dura utilizzando una punta dell'ago calibro 30.
Pulire tutti i pezzi di detriti ossei con pinze affilate angolate di 45 gradi. Quindi, collegare un ago smussato lucidato manualmente calibro 27 al supporto dell'ago accoppiato a un braccio robotico inclinato con un angolo di 10 gradi e collegare l'altra estremità del supporto dell'ago al sistema di aspirazione della casa. Individuare la punta dell'ago per toccare semplicemente il bregma prima di fare clic sul pulsante Bregma per impostare la coordinata Z di bregma su zero.
Impostare il valore X di ingresso su 0,8, il valore di ingresso Y su 1,94, il valore Z di ingresso su 1,0 e fare clic sul pulsante Trova per spostare l'ago sulla parte superiore del foro praticato sul cranio. Centrare la punta dell'ago sul foro praticato e portarlo verso il basso fino allo zero di posizione Z. Accendere il vuoto e iniziare a risciacquare l'area del cervello esposta con liquido cerebrospinale artificiale, o ACSF, attraverso un sistema di tubi a gravità controllata collegato a un ago calibro 30 con una punta piegata.
ACSF viene continuamente gonfiato con una miscela di gas del 95% di ossigeno e 5% di anidride carbonica mentre viene filtrato attraverso un filtro da 0,2 micron. Utilizzando il software AutoStereota, l'aspirazione del tessuto cerebrale verrà completata in quattro round. Per il primo round di aspirazione, assicuratevi che il valore Z sia uguale a zero.
Quindi, nella sessione zStep, fare clic e controllare la prima e la seconda riga. Impostare i valori per la prima riga su 0,2 e 1. Impostare i valori per la seconda riga su 0,15 e 4.
Nella sessione in modalità, impostare la dimensione dell'ago 27 gauge e 1.2. Impostare Dims 0,9. Tutti gli altri valori saranno predefiniti.
Per avviare l'aspirazione, fare clic in sequenza sui pulsanti NotSet, KeepZero e Start. Il primo round di aspirazione genera una tasca a colonna con 0,8 millimetri di profondità e 1 millimetro di diametro. Nel terzo round di aspirazione, fate clic e selezionate la prima riga per la sessione zStep e impostate i valori per la prima riga su 1.8 e 1.
Nella sessione in modalità, impostare la dimensione dell'ago 27 gauge e 2.2. Inizia l'aspirazione mantenendo gli altri valori uguali a quelli del round precedente. Dopo il terzo round di aspirazione, la profondità della tasca della colonna è di 1,8 millimetri.
L'ultimo round di aspirazione è quello di ripulire il sangue accumulato nella parte inferiore della tasca. Impostare i valori per la prima riga su 1,6 e 1 nella sessione zStep e impostare la dimensione dell'ago 27 gauge e 2,2 e Dims 0,6 nella sessione in modalità prima di iniziare l'aspirazione. Una volta che la tasca è priva di sangue, interrompere il vuoto, interrompere l'irrigazione di ACSF e portare l'ago su 2 millimetri in coordinata Z e 0,5 millimetri anteriormente al centro.
Posizionare la lente GRIN sterile da 1 millimetro nella tasca del tessuto cerebrale. Quindi, applicare l'agarosio fuso nello spazio tra la lente GRIN e il tessuto cerebrale con l'aiuto di una spatola. Dopo che l'agarosio forma un gel, rimuovere l'agarosio in eccesso usando una micro lama.
Mescolare la polvere di cemento dentale e il liquido catalizzatore in un po 'di miscelazione pre-refrigerato e applicare uno strato di cemento resina adesivo auto-polimerizzante sul cranio, iniziando circondando la lente GRIN e quindi coprendo l'intero cranio esposto. In un pozzo di plastica pulito, mescolare la polvere di cemento dentale e il carbone nero con il liquido per applicare uno strato sottile della miscela sopra il primo strato di cemento dentale. Lasciare indurire per cinque minuti.
Collegare il Miniscope al cavo e accendere il software personalizzato NuView. In NuView, fai clic su Hardware, seleziona LED1 e fai clic sul pulsante Stream per visualizzare le immagini dal vivo. Per interrompere lo streaming live, fai clic sul pulsante Stop.
Quindi, sistemare il Miniscope in un braccio di tenuta Miniscope personalizzato. Con l'aiuto di controller motorizzati, posizionare il Miniscope appena sopra l'obiettivo GRIN esposto, rendendolo parallelo alla superficie dell'obiettivo. Abbassare lentamente il miniscopio verso l'obiettivo GRIN e regolare la sua posizione Z fino a trovare il miglior piano di messa a fuoco.
Applicare il primo strato di cemento dentale attorno alla base del Miniscope senza alterare la posizione del Miniscope. Dopo che il cemento è indurito, rimuovere delicatamente il braccio di tenuta in modo che il Miniscope possa stare da solo sulla testa del mouse. Applicare un secondo strato di cemento dentale attorno alla base per riempire tutti gli spazi vuoti, assicurandosi che non vi siano perdite di luce LED dagli spazi vuoti.
Lasciare che il cemento dentale si indurisca. Dopo aver brevemente anestetizzato il mouse con isoflurano, allentare la vite di bloccaggio nella base con un piccolo cacciavite prima di rimuovere il cappuccio protettivo e pulire la superficie della lente GRIN con un batuffolo di cotone imbevuto di acetone. Collegare il miniscopio al cavo e avviare il software NuView per iniziare a identificare il piano focale migliore regolando la posizione del miniscopio rispetto alla base stringendo leggermente o allentando con l'aiuto di pinze smussate.
Una volta determinato il miglior piano focale, stringere la vite di bloccaggio prima di scollegare il cavo e rimettere il mouse nella sua gabbia di casa. Attivare il software della telecamera di comportamento per visualizzare l'arena di comportamento del mouse tramite una funzione di livestream. Regolare manualmente la messa a fuoco della fotocamera superiore.
Seleziona Trigger Strobe e seleziona abilita / disabilita trigger, quindi fai clic sul pulsante Registra. Quindi utilizzare Sfoglia per selezionare una posizione in cui verranno salvate le registrazioni del comportamento. Selezionare il formato immagine desiderato.
Avvicinare il mouse all'arena e collegare il Miniscope al cavo collegato al sistema di acquisizione dati. Quindi posiziona il mouse al centro dell'arena. Nel software della telecamera comportamentale, fare clic su Avvia registrazione.
In NuView, controlla LED1, fai clic su Cattura e quindi attiva i pulsanti per avviare la registrazione. Ciò consente registrazioni simultanee dell'imaging del calcio e del comportamento del topo. Premi Stop dopo 3.000 fotogrammi e salva i file.
Al termine della registrazione, anestetizzare brevemente il mouse con isoflurano, staccare il Miniscope dalla base e posizionare il cappuccio protettivo sulla base prima di rimettere il mouse nella sua gabbia di casa. La mappa cellulare dell'imaging di calcio in vivo subottimale conteneva alcuni neuroni attivi, mentre quella dell'imaging di successo includeva diverse centinaia di neuroni attivi nell'area focalizzata. Nel tipico esempio di un'imaging di calcio in vivo senza successo, la regione è stata osservata essere scura e conteneva meno di cinque neuroni attivi, o la regione era luminosa ma non aveva neuroni attivi.
Nell'analisi rappresentativa, vengono mostrate la mappa cellulare a fluorescenza di proiezione massima e i transitori di calcio da una successiva registrazione di imaging del calcio in vivo. La valutazione post-mortem per l'espressione di GCaMP6f e l'impianto della lente GRIN nella PFC mediale di un topo sperimentale ha indicato che GCaMP6f è stato espresso e la lente GRIN è stata impiantata precisamente nella regione cerebrale desiderata. Per ottenere una buona imaging del calcio, è necessario assicurarsi che l'emorragia si sia completamente fermata e che il campo sia privo di coaguli di sangue prima di impiantare la lente GRIN.
Questa tecnica può essere utilizzata per studiare i cambiamenti del circuito neurale nel modello murino di diversi disturbi del cervello umano e testare se un candidato farmaco può normalizzare i circuiti alterati.
