Stereotaktische virale Injektion und Gradientenindex-Linsenimplantation für Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Miniscope in vivo Calcium-Bildgebung ermöglicht es Forschern, die räumlich und zeitlich koordinierte Aktivität von Hunderten von Neuronen in tiefen Gehirnstrukturen frei verhaltender Tiere zu untersuchen. Miniscope in vivo Calcium-Bildgebung bietet viele Vorteile, einschließlich der Möglichkeit, Aufnahmen durchzuführen, die zelltypspezifisch, groß und längs sind. Unser Operationsprotokoll für die virale Injektion und die Implantation der GRIN-Linse ist mit allen kommerziellen oder kundenspezifischen Einzelphotonen- und Zwei-Photonen-Bildgebungssystemen für die Deep-Brain-In-vivo-Kalziumbildgebung kompatibel.

Rashmi Thapa, ein Doktorand aus meinem Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Nachdem Sie den rasierten chirurgischen Bereich einer betäubten Maus desinfiziert haben, verwenden Sie ein Skalpell, um einen zwei Zentimeter großen Schnitt durch die Haut entlang der Mittellinie zu machen, um das Lambda und das Bregma des Schädels freizulegen. Nachdem Sie den 0,5 Millimeter Zahnbohrgrat in eine Position von vorderen hinteren 1,94 Millimetern und medialen lateralen 0,5 Millimetern vom Bregma lokalisiert haben, beginnen Sie mit dem Bohren durch den Schädel.

Als nächstes laden Sie das Virus mit dem Bedienfeld der Mikropumpe in die Mikroliterspritze und ziehen 500 Nanoliter Luftblase ab, gefolgt von 800 Nanolitern des Virus mit einer Durchflussrate von 50 Nanolitern pro Sekunde. Bewegen Sie sich langsam die Nadel hinunter in das Hirngewebe zur angestrebten Z-Koordinate der dorsalen ventralen 1,75 Millimeter und bewegen Sie sie dann leicht bis zur Z-Koordinate der dorsalen ventralen 1,65 Millimeter. Stellen Sie auf dem Bedienfeld die Mikropumpe so ein, dass 500 Nanoliter des Virus mit einer Durchflussrate von 50 Nanolitern pro Minute injiziert werden, bevor Sie auf die Schaltfläche Ausführen klicken, um das Virus zu injizieren.

Wenn die Injektion vorbei ist, richten Sie die Hautränder aus und schließen Sie den Schnitt vorsichtig mit einer 4-0-Naht. Tragen Sie eine antibiotische Salbe auf die genähte Stelle auf, um eine Infektion zu verhindern. Um den Gradientenindex oder die GRIN-Linse zu implantieren, entfernen Sie mit einer feinen Schere einen dreieckigen Bereich der Haut von 1,5 Zentimeter Höhe und 1,5 Zentimeter Basis von der Vorderseite zwischen den Augen bis zur hinteren Seite hinter dem Lambda.

Nachdem der Schädel gründlich gereinigt und getrocknet wurde, tragen Sie Cyanacrylat auf die Hautränder auf und befestigen Sie die Haut am Schädel. Nach fünf Minuten, wenn das Cyanacrylat trocknet, lokalisieren Sie einen Zahnbohrgrat von 1,2 Millimetern Durchmesser zu einer Position von vorderen hinteren 1,94 Millimetern, medial lateral 0,8 Millimeter vom Bregma entfernt. Bohren Sie durch den Schädel, gefolgt von der Entfernung der Dura mit einer 30-Gauge-Nadelspitze.

Reinigen Sie alle Knochenreste mit einer um 45 Grad abgewinkelten scharfen Pinzette. Als nächstes befestigen Sie eine manuell polierte stumpfe Endnadel mit 27 Messgeräten an dem Nadelhalter, der mit einem um 10 Grad geneigten Roboterarm gekoppelt ist, und verbinden Sie das andere Ende des Nadelhalters mit dem Hausvakuumsystem. Suchen Sie die Spitze der Nadel, um nur die Bregma zu berühren, bevor Sie auf die Bregma-Schaltfläche klicken, um die Z-Koordinate von Bregma auf Null zu setzen.

Setzen Sie den Wert für Eingang X auf 0,8, den Wert für Eingabe Y auf 1,94, den Wert für die Eingabe Z auf 1,0 und klicken Sie auf die Schaltfläche Suchen, um die Nadel auf die Oberseite des gebohrten Lochs am Schädel zu bewegen. Zentrieren Sie die Nadelspitze auf das gebohrte Loch und bringen Sie es auf die Z-Position Null. Schalten Sie das Vakuum ein und beginnen Sie, den exponierten Gehirnbereich mit künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) durch ein schwerkraftgesteuertes Schlauchsystem zu spülen, das mit einer 30-Gauge-Nadel mit einer gebogenen Spitze verbunden ist.

ACSF wird kontinuierlich mit einem Gasgemisch aus 95% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid gesprudelt, während es durch einen 0,2-Mikron-Filter gefiltert wird. Mit der AutoStereota-Software wird die Aspiration des Hirngewebes in vier Runden abgeschlossen. Stellen Sie für die erste Aspirationsrunde sicher, dass der Z-Wert Null anzeigt.

Klicken Sie dann in der zStep-Sitzung auf und überprüfen Sie die erste und zweite Zeile. Legen Sie die Werte für die erste Zeile auf 0,2 und 1 fest. Legen Sie die Werte für die zweite Zeile auf 0,15 und 4 fest.

Stellen Sie in der Modussitzung die Nadelgröße 27 und 1,2 ein. Setzen Sie Dims 0.9. Alle anderen Werte sind Standardwerte.

Um die Aspiration zu starten, klicken Sie nacheinander auf die Schaltflächen NotSet, KeepZero und Start. Die erste Aspirationsrunde erzeugt eine Säulentasche mit 0,8 Millimeter Tiefe und 1 Millimeter Durchmesser. Klicken Sie in der dritten Aspirationsrunde auf die erste Zeile für die zStep-Sitzung, und legen Sie die Werte für die erste Zeile auf 1,8 und 1 fest.

Stellen Sie in der Modussitzung die Nadelgröße 27 und 2,2 ein. Beginnen Sie die Aspiration, indem Sie andere Werte wie in der vorherigen Runde beibehalten. Nach der dritten Aspirationsrunde beträgt die Tiefe der Säulentasche 1,8 Millimeter.

Die letzte Runde des Bestrebens besteht darin, Blut zu reinigen, das sich am Boden der Tasche angesammelt hat. Stellen Sie die Werte für die erste Zeile in der zStep-Sitzung auf 1,6 und 1 ein und legen Sie die Nadelgröße 27 Gauge und 2.2 und Dims 0.6 in der Mode-Sitzung fest, bevor Sie mit der Aspiration beginnen. Sobald die Tasche blutfrei ist, stoppen Sie das Vakuum, stoppen Sie die Bewässerung von ACSF und bringen Sie die Nadel um 2 Millimeter in Z-Koordinate und 0,5 Millimeter vor die Mitte.

Legen Sie die sterile 1 Millimeter GRIN-Linse in die Hirngewebetasche. Als nächstes tragen Sie die geschmolzene Agarose mit Hilfe eines Spatels in der Lücke zwischen der GRIN-Linse und dem Hirngewebe auf. Nachdem Agarose ein Gel gebildet hat, entfernen Sie überschüssige Agarose mit einer Mikroklinge.

Mischen Sie das Zahnzementpulver und die Katalysatorflüssigkeit in einer vorgekühlten Mischung und tragen Sie eine Schicht selbsthärtenden Haftharzements auf den Schädel auf, beginnend mit der Umfassung der GRIN-Linse und dann mit dem gesamten freiliegenden Schädel. Mischen Sie in einem sauberen Kunststoffbrunnen Zahnzementpulver und schwarze Holzkohle mit Flüssigkeit, um eine dünne Schicht der Mischung auf die erste Schicht Zahnzement aufzutragen. Lassen Sie es fünf Minuten aushärten.

Schließen Sie das Miniscope an das Kabel an und schalten Sie die speziell entwickelte Software NuView ein. Klicken Sie in NuView auf Hardware, aktivieren Sie LED1 und klicken Sie auf die Schaltfläche Stream, um die Livebilder anzuzeigen. Um das Live-Streaming zu stoppen, klicken Sie auf die Schaltfläche Stopp.

Als nächstes setzen Sie das Miniscope in einen speziell angefertigten Miniscope-Haltearm. Mit Hilfe von motorisierten Controllern positionieren Sie das Miniscope direkt über der belichteten GRIN-Linse, so dass es parallel zur Oberfläche des Objektivs verläuft. Bringen Sie das Miniscope langsam in Richtung GRIN-Objektiv und passen Sie seine Z-Position an, bis die beste Fokusebene gefunden ist.

Tragen Sie die erste Schicht Zahnzement um die Miniscope-Basis auf, ohne die Position des Miniscopes zu verändern. Nachdem der Zement ausgehärtet ist, entfernen Sie vorsichtig den Haltearm, so dass das Miniscope alleine auf dem Mauskopf stehen kann. Tragen Sie eine zweite Schicht Zahnzement um die Basis auf, um alle Lücken zu füllen, und stellen Sie sicher, dass kein LED-Licht aus den Lücken austritt.

Lassen Sie den Zahnzement aushärten. Nachdem Sie die Maus kurz mit Isofluran betäubt haben, lösen Sie die Verriegelungsschraube in der Basis mit einem kleinen Schraubendreher, bevor Sie die Schutzkappe entfernen, und reinigen Sie die Oberfläche der GRIN-Linse mit einem acetongetränkten Wattestäbchen. Schließen Sie das Miniscope an das Kabel an und starten Sie die NuView-Software, um die beste Brennebene zu identifizieren, indem Sie die Position des Miniscopes relativ zur Basis anpassen, indem Sie sie mit Hilfe einer stumpfen Pinzette leicht anziehen oder lockern.

Sobald die beste Fokusebene ermittelt wurde, ziehen Sie die Verriegelungsschraube fest, bevor Sie das Kabel trennen und die Maus wieder in den Hauskäfig legen. Aktivieren Sie die Verhaltenskamera-Software, um die Mausverhaltensarena über eine Livestream-Funktion anzuzeigen. Stellen Sie den Fokus der Top-Kamera manuell ein.

Wählen Sie Trigger Strobe und aktivieren Sie Trigger/Trigger aktivieren/deaktivieren, gefolgt von einem Klick auf die Schaltfläche Aufnahme. Verwenden Sie dann Durchsuchen, um einen Speicherort auszuwählen, an dem Verhaltensaufzeichnungen gespeichert werden. Wählen Sie das gewünschte Bildformat aus.

Bringen Sie die Maus in die Nähe der Arena und verbinden Sie das Miniscope mit dem Kabel, das mit dem Datenerfassungssystem verbunden ist. Platzieren Sie dann die Maus in der Mitte der Arena. Klicken Sie in der Verhaltenskamera-Software auf Aufzeichnung starten.

Aktivieren Sie in NuView LED1, klicken Sie auf Capture und lösen Sie dann Schaltflächen aus, um die Aufnahme zu starten. Dies ermöglicht die gleichzeitige Aufzeichnung von Kalziumbildgebung und Mausverhalten. Klicken Sie nach 3.000 Bildern auf Stop und speichern Sie die Dateien.

Wenn die Aufnahme abgeschlossen ist, betäuben Sie die Maus kurz mit Isofluran, lösen Sie das Miniscope von der Basis und legen Sie die Schutzkappe über die Basis, bevor Sie die Maus wieder in ihren Heimatkäfig legen. Die Zellkarte aus der suboptimalen In-vivo-Kalziumbildgebung enthielt einige aktive Neuronen, während die aus der erfolgreichen Bildgebung mehrere hundert aktive Neuronen im fokussierten Bereich umfasste. Im typischen Beispiel einer erfolglosen In-vivo-Kalziumbildgebung wurde beobachtet, dass die Region dunkel war und weniger als fünf aktive Neuronen enthielt, oder die Region war hell, hatte aber keine aktiven Neuronen.

In der repräsentativen Analyse werden die maximale Projektionsfluoreszenzzellkarte und Calciumtransienten aus einer sukzessiven in vivo Calciumbildgebung gezeigt. Die postmortale Beurteilung der GCaMP6f-Expression und der GRIN-Linsenimplantation in das mediale PFC einer experimentellen Maus ergab, dass GCaMP6f exprimiert wurde und die GRIN-Linse genau in die gewünschte Hirnregion implantiert wurde. Um eine gute Kalziumbildgebung zu erhalten, muss sichergestellt werden, dass die Blutung vollständig gestoppt wurde und das Feld frei von Blutgerinnseln ist, bevor die GRIN-Linse implantiert wird.

Diese Technik kann verwendet werden, um neuronale Schaltkreisänderungen im Mausmodell verschiedener menschlicher Gehirnstörungen zu untersuchen und zu testen, ob ein Arzneimittelkandidat die veränderten Schaltkreise normalisieren kann.