Miniscópio em imagem de cálcio vivo capacita os pesquisadores a examinar a atividade espacial e temporalmente coordenada de centenas de neurônios em estruturas cerebrais profundas de animais que se comportam livremente. Miniscópio em imagem de cálcio vivo oferece muitas vantagens, incluindo a capacidade de realizar gravações específicas do tipo celular, em grande escala e longitudinal. Nosso protocolo de cirurgia para injeção viral e implantação de lentes GRIN é compatível com qualquer fóton único comercial ou personalizado e dois sistemas de imagem de fótons para o cérebro profundo em imagem de cálcio vivo.
Demonstrando o procedimento estará Rashmi Thapa, estudante de pós-graduação do meu laboratório. Depois de desinfetar a área cirúrgica raspada de um rato anestesiado, use um bisturi para fazer uma incisão de dois centímetros através da pele ao longo da linha média para expor a lambda e bregma do crânio. Depois de localizar a rebarba de perfuração dentária de 0,5 milímetros para uma posição de 1,94 milímetros posterior anterior e 0,5 milímetros lateral medial do bregma, comece a perfurar através do crânio.
Em seguida, carregue o vírus na seringa microliter usando o painel de controle da micro bomba e retire 500 nanoliters de bolha de ar seguido por 800 nanoliters do vírus a uma taxa de fluxo de 50 nanoliters por segundo. Mova-se lentamente para baixo da agulha para o tecido cerebral para a coordenada Z alvo do ventral dorsal 1,75 milímetros e, em seguida, movê-lo ligeiramente para a coordenada Z de ventral dorsal 1,65 milímetros. No painel de controle, defina a micro bomba para injetar 500 nanoliters do vírus na taxa de fluxo de 50 nanoliters por minuto antes de apertar o botão Executar para injetar o vírus.
Quando a injeção acabar, fore a linha das bordas da pele e feche cuidadosamente a incisão com uma sutura 4-0. Aplique pomada antibiótica na área costurada para prevenir infecções. Para implantar índice de gradiente ou lente GRIN, extirpa uma área triangular da pele de 1,5 centímetro de altura e base de 1,5 centímetros do lado anterior entre os olhos para o lado posterior atrás da lambda usando uma tesoura fina.
Depois que o crânio estiver completamente limpo e seco, aplique cianoacrilato nas bordas da pele e conecte a pele ao crânio. Após cinco minutos quando o cianoacrilato secar, localize uma rebarba de broca dentária de 1,2 milímetros de diâmetro para uma posição de 1,94 milímetros posterior anterior, lateral medial 0,8 milímetros do bregma. Perfurar o crânio, seguido de remover a dura usando uma ponta de agulha calibre 30.
Limpe todos os pedaços de detritos ósseos com fórceps afiados de 45 graus. Em seguida, conecte uma agulha final cega polida manualmente de 27 ao suporte da agulha acoplado a um braço robótico inclinado com um ângulo de 10 graus e conecte a outra extremidade do suporte da agulha ao sistema de vácuo da casa. Localize a ponta da agulha para apenas tocar na bregma antes de clicar no botão Bregma para definir a coordenada Z de bregma a zero.
Defina o valor de entrada X para 0,8, o valor de entrada Y para 1,94, o valor de entrada Z para 1.0 e clique no botão Encontrar para mover a agulha para a parte superior do orifício perfurado no crânio. Centralizar a ponta da agulha para o orifício perfurado e trazê-la para a posição Z zero. Ligue o vácuo e comece a enxaguar a área do cérebro exposta com fluido cerebrospinal artificial, ou ACSF, através de um sistema de tubulação controlado pela gravidade conectado a uma agulha de calibre 30 com uma ponta dobrada.
ACSF é continuamente borbulhado com uma mistura de gás de 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono enquanto é filtrado através de um filtro de 0,2 mícrons. Usando o software AutoStereota, a aspiração do tecido cerebral será completada em quatro rodadas. Para a primeira rodada de aspiração, certifique-se de que o valor Z exibe zero.
Em seguida, na sessão zStep, clique e verifique a primeira e segunda linhas. Defina os valores da primeira linha para 0,2 e 1. Defina os valores para a segunda linha para 0,15 e 4.
Na sessão Mode, ajuste o tamanho da agulha calibre 27 e 1.2. Definir Dims 0.9. Todos os outros valores serão padrão.
Para iniciar a aspiração, clique seqüentemente nos botões NotSet, KeepZero e Start. A primeira rodada de aspiração gera um bolso de coluna com 0,8 milímetros de profundidade e 1 milímetro de diâmetro. Na terceira rodada de aspiração, clique e verifique a primeira linha para a sessão zStep e defina os valores para a primeira linha para 1,8 e 1.
Na sessão Mode, ajuste o tamanho da agulha calibre 27 e 2.2. Inicie a aspiração mantendo outros valores iguais aos da rodada anterior. Após a terceira rodada de aspiração, a profundidade do bolso da coluna é de 1,8 milímetros.
A última rodada de aspiração é limpar o sangue acumulado na parte inferior do bolso. Defina os valores da primeira linha para 1,6 e 1 na sessão zStep e ajuste o tamanho da agulha 27 e 2.2 e Dims 0.6 na sessão mode antes de iniciar a aspiração. Uma vez que o bolso esteja livre de sangue, pare o vácuo, pare a irrigação de ACSF, e traga a agulha para cima 2 milímetros na coordenada Z e 0,5 milímetros anterior ao centro.
Coloque a lente GRIN estéril de 1 milímetro no bolso do tecido cerebral. Em seguida, aplique a agarose derretida na abertura entre a lente GRIN e o tecido cerebral com a ajuda de uma espátula. Depois que agarose forma um gel, remova o excesso de agarose usando uma micro lâmina.
Misture o pó de cimento dental e o líquido catalisador em um poço de mistura pré-refrigerado e aplique uma camada de cimento de resina adesivo auto-curando no crânio, começando por torno da lente GRIN e, em seguida, cobrindo todo o crânio exposto. Em um poço de plástico limpo, misture o pó de cimento dental e o carvão preto com líquido para aplicar uma fina camada da mistura em cima da primeira camada de cimento dental. Deixe endurecer por cinco minutos.
Conecte o Miniscópio ao cabo e ligue o software desenvolvido sob medida NuView. No NuView, clique em Hardware, verifique LED1 e clique no botão Transmitir para ver as imagens ao vivo. Para interromper a transmissão ao vivo, clique no botão Parar.
Em seguida, instale o Miniscópio em um braço de retenção miniscópio personalizado. Com a ajuda de controladores motorizados, localize o Miniscópio logo acima da lente GRIN exposta, tornando-o paralelo à superfície da lente. Abaixe lentamente o Miniscópio em direção à lente GRIN e ajuste sua posição Z até que o melhor plano de foco seja encontrado.
Aplique a primeira camada de cimento dentário ao redor da base do Miniscópio sem alterar a posição do Miniscópio. Depois que o cimento for endurecido, remova suavemente o braço de retenção para que o Miniscópio possa ficar sozinho na cabeça do mouse. Aplique uma segunda camada de cimento dental ao redor da base para preencher todas as lacunas, garantindo que não haja vazamento de luz led das lacunas.
Deixe o cimento dentário endurecer. Depois de anestesiar brevemente o rato com isoflurano, solte o parafuso de bloqueio na base com uma pequena chave de fenda antes de remover a tampa protetora e limpe a superfície da lente GRIN com um cotonete encharcado de acetona. Conecte o Miniscópio ao cabo e inicie o software NuView para começar a identificar o melhor plano focal com o ajuste da posição do Miniscópio em relação à base, apertando ou afrouxando ligeiramente com a ajuda de fórceps contundentes.
Uma vez determinado o melhor plano focal, aperte o parafuso de travamento antes de desconectar o cabo e coloque o mouse de volta em sua gaiola doméstica. Ligue o software da câmera de comportamento para visualizar a arena de comportamento do mouse através de uma função livestream. Ajuste manualmente o foco da câmera superior.
Selecione Acionar Strobe e verifique ativar/desativar o gatilho, seguido de clicar no botão Gravar. Em seguida, use Procurar para selecionar um local onde as gravações de comportamento serão salvas. Selecione o formato de imagem desejado.
Aproxime o mouse da arena e conecte o Miniscópio ao cabo ligado ao sistema de aquisição de dados. Em seguida, coloque o rato no centro da arena. No software da câmera de comportamento, clique em Iniciar gravação.
No NuView, verifique LED1, clique em Capturar e, em seguida, acione botões para iniciar a gravação. Isso permite gravações simultâneas de imagens de cálcio e comportamento do rato. Aperte Stop após 3.000 quadros e salve os arquivos.
Quando a gravação estiver pronta, anestesia brevemente o mouse com isoflurane, retire o Miniscópio da base e coloque a tampa protetora sobre a base antes de colocar o mouse de volta em sua gaiola doméstica. O mapa celular da imagem subótimal in vivo de cálcio continha alguns neurônios ativos, enquanto que a partir de imagens bem sucedidas incluía várias centenas de neurônios ativos na área focada. No exemplo típico de uma imagem in vivo de cálcio in vivo mal sucedida, observou-se que a região era escura e continha menos de cinco neurônios ativos, ou a região era brilhante, mas não tinha neurônios ativos.
Na análise representativa, mostram-se o mapa celular de fluorescência máxima de projeção e os transitórios de cálcio a partir de um registro sucessivo de imagem de cálcio in vivo. A avaliação pós-morte para expressão GCaMP6f e implantação de lentes GRIN no PFC medial de um rato experimental indicou que GCaMP6f foi expressa e a lente GRIN foi implantada precisamente na região cerebral desejada. Para obter uma boa imagem de cálcio, é necessário garantir que o sangramento tenha parado completamente e que o campo esteja livre de coágulos sanguíneos antes de implantar a lente GRIN.
Esta técnica pode ser utilizada para estudar mudanças no circuito neural no modelo de camundongos de diferentes distúrbios cerebrais humanos e testar se um candidato a medicamentos pode normalizar os circuitos alterados.
