생체 계면 활성제는 액체의 표면 장력과 두 개의 서로 다른 단계 사이의 interficial 장력을 감소시킬 수있는 능력을 가진 미생물에 의해 생성 된 공감 표면 활성 분자입니다. 이 분자들의 공감적 성질은 두 개의 서로 다른 위상 사이의 계면에서 스스로를 정렬하고 한 단계의 가용화를 다른 단계로 향상시킬 수있게합니다. 생체 계면 활성제는 그들이 제공하는 다양한 장점 때문에 화학 물질에 비해 많은 주목을 받고 있습니다.
여기에는 더 높은 특이성, 낮은 독성, 더 큰 구조적 다양성, 준비 용이성, 높은 생분해성, 더 높은 환경 적합성 및 극한 환경 조건에서의 활동이 포함됩니다. 이 비디오에서는 로도코커스, 리시니바실러스 및 파에니바실러스의 다양한 균주에 의해 생산된 생물학적 계면활성제를 스크리닝, 특성화 및 적용 생체 계면활성제와 관련된 방법을 시연합니다. 우리는 샌드 팩 컬럼 기술에 의한 잔류 오일의 회수에 있어서 이들 세 미생물 균주에 의해 생산된 생체계면활성제의 조합의 적용을 평가하는 방법을 추가로 예시한다.
이 작업은 Preeti Srivastava 박사와 Manoj Kumar 박사의지도하에 수행되었습니다. 미생물의 성장을 위해, 백 밀리리터의 오토클레이브 루리아 국물을 함유하는 플라스크에 접종하고, 하룻밤 사이에 재배된 종자 배양물 한 밀리리터를 층류 기류 캐비닛 내부의 플라스크에 첨가한다. 플라스크를 7일 동안 섭씨 30도 및 180RPM의 회전식 인큐베이터에서 배양한다.
인큐베이션 기간이 완료된 후, 플라스크를 수확하고, 배양액을 원심분리 튜브로 옮긴다. 배양물을 섭씨 4도에서 냉장 원심분리기에서 20분 동안 4, 500 G에서 원심분리한다. 무세포 상청액을 신선한 비이커에 부드럽게 붓고 생체 계면 활성제 생산을위한 스크리닝 분석에 사용하십시오.
방울 붕괴 분석법에 의한 생체 계면활성제 생산을 스크리닝하기 위해, 깨끗한 유리 슬라이드를 취하여 슬라이드의 표면을 200 마이크로리터의 오일로 코팅한다. 이제 20 마이크로 리터의 세포가없는 상청액을 오일의 중앙에 넣고 2 ~ 세 분 동안 방해받지 않도록하십시오. 방울이 무너지면 생체 계면 활성제의 존재에 대해 상청액을 양성으로 평가하십시오.
오일 확산 분석에서 페트리 플레이트에 20 밀리리터의 이중 증류수를 취하여 물 표면에 200 마이크로 리터의 원유를 첨가하십시오. 이제 20 마이크로 리터의 세포가없는 상청액을 오일의 중앙에 넣고 1 분 동안 방해받지 않도록하십시오. 오일 변위의 결과로 클리어링 구역이 형성되면 생체 계면 활성제의 존재에 대해 상청액을 양성으로 평가하십시오.
유화 지수 분석에서 네 밀리리터의 휘발유와 무세포 상청액을 각각 깨끗한 유리 튜브에 첨가하십시오. 그런 다음 혼합물을 세 분 동안 격렬하게 사용하고 다음 24 시간 동안 방해받지 않고 그대로 두십시오. 무세포 상청액의 표면 장력을 측정하려면 표면 장력이 결정되어야 하는 액체로 유리 용기를 청소하십시오.
액체를 용기에 넣고 선박 홀더에 선박을 장착하십시오. 프로브 홀더의 잠금을 해제하고 프로브를 장착합니다. 수동 컨트롤러를 사용하여 플랫폼의 높이를 조정하여 프로브가 액체 표면에서 두 ~ 세 밀리미터 떨어져 있도록 합니다.
그런 다음 소프트웨어로 이동하여 종이에 언급 된 단계에 따라 표면 장력을 측정하십시오. 측정이 완료되면 플랫폼의 높이를 낮추고 장비에서 프로브와 선박을 잠금 해제하고 마운트 해제하십시오. 생체 계면 활성제의 추출을 위해, 두 개의 정상 염산을 사용하여 무세포 상등액의 pH를 두 개로 조정하십시오.
혼합물을 하룻밤 사이에 섭씨 네 도에 보관하십시오. 다음날, 같은 부피의 클로로포름 메탄올 혼합물을 첨가하고, 20분 동안 격렬하게 혼합한다. 자유로운 분리가 일어나도록 혼합물을 방해받지 않고 두십시오.
물과 메탄올을 함유하는 윗면을 제거하고, 생체계면활성제를 함유하는 하부 면을 흄 후드에서 증발시키도록 남겨둔다. 유기 상을 증발시킨 후, 꿀 색깔의 생체 계면활성제를 세 밀리리터의 클로로포름에 재용해시키고, 이 혼합물을 생체 계면활성제의 특성화 및 동정을 위해 사용한다. 추출된 생체계면활성제의 크로마토그래피 특성화를 위해, TLC 플레이트 상에 20 마이크로리터의 바이오계면활성제를 스팟한다.
플레이트를 건조시킨 후, TLC 플레이트를 클로로포름 메탄올 혼합물로 포화된 챔버 내부에 놓고 TLC를 실행한다. 지질 검출을 위해, 요오드의 일부 과립을 신선한 챔버에 추가하고 챔버를 다섯 ~ 10 분 동안 포화시킵니다. TLC를 챔버 내부에 놓고 노란색 반점의 발달을 관찰하십시오.
단백질 및 탄수화물 검출을 위해 TLC 플레이트에 비 수소 또는 아니스알데히드를 뿌리고 섭씨 110도에서 가열하고 색의 발달을 관찰하십시오. NMR 분석을 위해 튜브를 스패너에 삽입하십시오. 조정 된 튜브를 사용하여 튜브의 높이를 조정하십시오.
스패너와 함께 NMR 튜브를 MR 기계에 놓고 종이에 언급 된 단계를 따라 NMR 스펙트럼을 얻으십시오. 향상된 오일 회수 실험을 위해 유리 컬럼을 가져 와서 유리 양모와 유리 비드로 바닥 콘센트를 밀봉하십시오. 토양 꼭대기에 액체를 첨가 할 수있는 방식으로 모래 토양으로 기둥을 되돌립니다.
홀더에 기둥을 장착하고 토양 위에 유리 구슬을 추가하십시오. 컬럼에 50 밀리리터의 염수 용액을 주입하고 흐름을 수집하여 불량한 부피를 결정하십시오. 원유가 통과하도록 강제하여 열에서 염수를 제거하십시오.
열에서 나오는 염수와 오일의 부피를 수집하여 초기 오일 포화 부피를 결정합니다. 24 시간 후, 10 개의 가난한 양의 소금물로 기둥을 채우고 열에서 나오는 기름을 모아 이차 오일 회수를 추정하십시오. 이차 오일 회수 후 컬럼에 남아있는 오일은 잔류 오일에 해당한다.
이제 추출된 생체계면활성제를 유리 비이커에 첨가하여 생체계면활성제의 혼합물을 제조하였다. 생체계면활성제와 혼합물을 컬럼에 첨가하고, 다음 24시간 동안 방해받지 않고 방치한다. 24시간 후, 컬럼 밖으로 암시된 오일과 물의 양을 측정하여 추가 또는 향상된 오일 회수를 결정한다.
세 미생물 균주의 무세포 상청액은 생체계면활성제의 존재에 대해 양성으로 점수가 매겨졌고, 이는 낙하 붕괴, 오일 확산 및 에멀젼 형성을 초래하였다. 생체계면활성제 생산의 확인은 무세포 국물의 표면 장력의 측정에 의해 제공되었다. 로도코커스와 리시니바실러스의 성장으로 인해 배지의 표면 장력이 미터 당 59mN에서 45mN으로 감소했습니다.
paenibacillus의 성장으로 인해 배지의 표면 장력이 미터 당 59에서 28.4mN으로 감소했습니다. 에멀젼 안정성 분석은 세 개의 미생물 균주에 의해 생산된 생체계면활성제가 다양하고 환경적인 조건 하에서 큰 안정성을 나타냈다는 것을 보여주었다. 에멀젼 지수는 인큐베이션 온도, pH 및 무세포 브로쓰의 염 농도가 변화되었을 때 어떠한 유의한 변화도 나타내지 않았다.
추출된 생체계면활성제의 DLC 특성화는 세 균주 모두에 의해 생산된 생체계면활성제가 글리콜화되었다는 것을 보여주었다. 생체 계면 활성제의 화학적 확인은 로도코커스와 리신 바실러스가 약 네 개의 80 달톤의 질량으로 람노 지질 (rhamnolipid)으로 확인 된 동일한 생체 계면 활성제를 생성한다는 것을 보여주었습니다. 반면에 Paenibaccilus는 약 802 달톤의 질량을 가진 세 개의 지질 사슬을 포함하는 람노리질을 생산합니다.
생체계면활성제의 조합은 모래 기둥으로부터 잔류 오일의 56.5%를 회수할 수 있었다. 로도코커스, lsyinibaccilus 및 paenibacillus의 균주로부터의 생체계면활성제 생산을 검정하고, 상기 균주는 생체계면활성제의 생산에 대해 양성으로 점수화하였다. 생성된 생체계면활성제는 람노지질로 특성화되고 확인되었다.
생체 계면활성제 조합이 모래 팩 기술에서 잔류 오일의 56 %를 회수하는 데 성공했기 때문에 바이오 계면활성제 조합은 오일 저장소 내부에 갇힌 잔류 오일을 회수하기 위해 현장 응용 분야에 사용될 수 있습니다.
