I biotensioattivi sono le molecole tensioattive empatiche prodotte da microrganismi che hanno la capacità di ridurre la tensione superficiale del liquido e la tensione interfacciale tra due diverse fasi. La natura empatica di queste molecole consente loro di allinearsi all'interfaccia tra due diverse fasi e migliorare la solubilizzazione di una fase in un'altra. I biotensioattivi hanno guadagnato molta attenzione rispetto alle loro controparti chimiche a causa dei vari vantaggi che offrono.
Questi includono maggiore specificità, minore tossicità, maggiore diversità strutturale, facilità di preparazione, maggiore biodegradabilità, maggiore compatibilità ambientale e la loro attività in condizioni ambientali estreme. In questo video, dimostriamo i metodi coinvolti nello screening, nella caratterizzazione e nei biotensioattivi applicativi, prodotti da diversi ceppi di rodococco, lysinibacillus e paenibacillus. Illustriamo inoltre i metodi per valutare l'applicazione di combinazioni di biotensioattivi, prodotti da questi tre ceppi microbici nel recupero dell'olio residuo mediante una tecnica a colonna di sabbia.
Il lavoro è stato svolto sotto la guida del Dr.Preeti Srivastava e del Dr.Manoj Kumar. Per la crescita dei microbi, inoculare i palloni contenenti centinaia di millilitri di brodo di Luria autoclavato, aggiungendo un millilitro di coltura di semi coltivata durante la notte al pallone all'interno dell'armadio del flusso d'aria laminare. Incubare i palloni in un incubatore rotante a 30 gradi Celsius e 180 RPM per sette giorni.
Dopo il completamento del periodo di incubazione, raccogliere i palloni e trasferire il brodo di coltura nei tubi della centrifuga. Centrifugare la coltura a 4.500 G per 20 minuti in una centrifuga refrigerata a quattro gradi Celsius. Versare delicatamente il surnatante privo di cellule in un becher fresco e utilizzarlo nei saggi di screening per la produzione di biotensioattivi.
Per lo screening della produzione di biotensioattivi mediante un test di collasso a goccia, prendere un vetrino pulito e rivestire la superficie del vetrino con 200 microlitri di olio. Ora aggiungi 20 microlitri di surnatante senza cellule al centro dell'olio e lascialo indisturbato per due o tre minuti. Se la goccia collassa, segnare il surnatante positivo per la presenza di biotensioattivo.
Nel saggio di diffusione dell'olio, prendere 20 millilitri di acqua a doppia distillazione in una piastra di Petri e aggiungere 200 microlitri di petrolio greggio sulla superficie dell'acqua. Ora aggiungi 20 microlitri di surnatante senza cellule al centro dell'olio e lascialo indisturbato per un minuto. Se si forma una zona di compensazione a seguito dello spostamento dell'olio, assegnare un punteggio positivo al surnatante per la presenza di biotensioattivo.
Nel test dell'indice di emulsione, aggiungere quattro millilitri di benzina e surnatante privo di cellule ciascuno in un tubo di vetro pulito. Quindi cosa la miscela vigorosamente per tre minuti e lasciarla indisturbata per le prossime 24 ore. Per misurare la tensione superficiale del surnatante privo di cellule, pulire il recipiente di vetro con il liquido la cui tensione superficiale deve essere determinata.
Aggiungere il liquido nel recipiente e montare il recipiente sul portasciuga. Sblocca il supporto della sonda e monta la sonda su di esso. Utilizzando il controller manuale regolare l'altezza della piattaforma, in modo tale che la sonda sia a due o tre millimetri di distanza dalla superficie del liquido.
Quindi vai ai software e segui i passaggi menzionati nel documento per misurare la tensione superficiale. Dopo aver completato la misurazione, abbassare l'altezza della piattaforma e sbloccare e smontare la sonda e la nave dallo strumento. Per l'estrazione del biotensioattivo, regolare il pH del surnatante privo di cellule a due, utilizzando due normali acidi cloridrici.
Conservare la miscela a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, aggiungere lo stesso volume di miscela di metanolo cloroformio e mescolare vigorosamente per 20 minuti. Lasciare la miscela indisturbata per una separazione libera.
Rimuovere la faccia superiore, contenente acqua e metanolo, e lasciare evaporare la faccia inferiore contenente biotensioattivo in una cappa aspirante. Dopo l'evaporazione della fase organica, ridistribuire il biotensioattivo color miele in tre millilitri di cloroformio e utilizzare questa miscela per la caratterizzazione e l'identificazione del biotensioattivo. Per la caratterizzazione cromatografica del biotensioattivo estratto, individuare 20 microlitri di biotensioattivo su piastre TLC.
Dopo aver asciugato le piastre, posizionare la piastra TLC all'interno della camera satura di miscela di metanolo cloroformio ed eseguire la TLC. Per il rilevamento dei lipidi, aggiungere alcuni granuli di iodio nella camera fresca e saturare la camera per cinque o 10 minuti. Posizionare il TLC all'interno della camera e osservare lo sviluppo di macchie gialle.
Per il rilevamento di proteine e carboidrati, spruzzare la piastra TLC con non idrogeno o anisaldeide e riscaldare a 110 gradi Celsius e osservare lo sviluppo del colore. Per l'analisi NMR, inserire il tubo nella chiave inglese. Regolare l'altezza del tubo utilizzando il tubo regolato.
Posizionare il tubo NMR, insieme alla chiave inglese in una macchina MR e seguire i passaggi menzionati nel documento per ottenere uno spettro NMR. Per un esperimento di recupero dell'olio migliorato, prendi una colonna di vetro e sigilla l'uscita inferiore con lana di vetro e perline di vetro. Retro la colonna con terreno sabbioso in modo tale che un po 'di liquido possa essere aggiunto nella parte superiore del terreno.
Montare la colonna sul supporto e aggiungere alcune perle di vetro sulla parte superiore del terreno. Inondare la colonna con 50 millilitri di soluzione di salamoia e raccogliere il flusso per determinare il volume scarso. Rimuovere la salamoia dalla colonna costringendo il petrolio greggio a passarci attraverso.
Raccogliere il volume di salamoia e olio che esce dalla colonna per determinare il volume iniziale di saturazione dell'olio. Dopo 24 ore, inondare la colonna con 10 scarsi volumi di salamoia e raccogliere l'olio che esce dalla colonna per stimare il recupero secondario dell'olio. L'olio lasciato nella colonna dopo il recupero secondario dell'olio corrisponde all'olio residuo.
Ora prepara una miscela di biotensioattivi aggiungendo il biotensioattivo estratto a un becher di vetro. E aggiungi il biotensioattivo e la miscela alla colonna e lascialo indisturbato per le prossime 24 ore. Dopo 24 ore, misurare la quantità di olio e acqua che ha alluso fuori dalla colonna per determinare il recupero dell'olio aggiuntivo o migliorato.
I supernatanti privi di cellule dei tre ceppi microbici sono stati valutati positivi per la presenza di biotensioattivi in quanto hanno provocato il collasso delle gocce, la diffusione dell'olio e la formazione di emulsioni. La conferma della produzione di biotensioattivi è stata fornita misurando la tensione superficiale del brodo privo di cellule. A causa della crescita di rhodococcus e lysinibacillus, la tensione superficiale del mezzo si è ridotta da 59 a 45 mN per metro.
A causa della crescita di paenibacillus, la tensione superficiale del mezzo si è ridotta da 59 a 28,4 mN per metro. I saggi di stabilità dell'emulsione hanno dimostrato che i biotensioattivi prodotti dai tre ceppi microbici hanno mostrato una grande stabilità in condizioni diverse e ambientali. Gli indici di emulsione non hanno mostrato alcun cambiamento significativo quando sono stati modificati la temperatura di incubazione, il pH e la concentrazione salina del brodo privo di cellule.
La caratterizzazione DLC del biotensioattivo estratto ha mostrato che i biotensioattivi prodotti da tutti e tre i ceppi erano glicolipedi. L'identificazione chimica dei biotensioattivi ha mostrato che il rodococco e il lysinbacillus producevano lo stesso biotensioattivo, che è stato identificato come rhamnolipid, con una massa di circa quattro 80 dalton. Paenibaccilus, d'altra parte, produce un ramnolipide contenente tre catene lipidiche con una massa di circa 802 dalton.
La combinazione di biotensioattivi è stata in grado di recuperare il 56,5% dell'olio residuo dalla colonna di sabbia. La produzione di biotensioattivi dai ceppi di rodococco, lsyinibaccilus e paenibacillus è stata analizzata e i ceppi sono stati valutati positivi per la produzione di biotensioattivi. I biotensioattivi prodotti sono stati caratterizzati e identificati come ramnolipidi.
Poiché la combinazione di biotensioattivi è riuscita a recuperare il 56% dell'olio residuo in una tecnica di impacco di sabbia, la combinazione di biotensioattivi può essere utilizzata in applicazioni sul campo per recuperare l'olio residuo intrappolato all'interno dei serbatoi di petrolio.
