Los biosurfactantes son las moléculas empáticas de activo superficial producidas por microorganismos que tienen la capacidad de reducir la tensión superficial del líquido y la tensión interficial entre dos fases diferentes. La naturaleza empática de estas moléculas les permite alinearse en la interfaz entre dos fases diferentes y mejorar la solubilización de una fase en otra. Los biosurfactantes han estado ganando mucha atención en comparación con sus contrapartes químicas debido a las diversas ventajas que ofrecen.
Estos incluyen mayor especificidad, menor toxicidad, mayor diversidad estructural, facilidad de preparación, mayor biodegradabilidad, su mayor compatibilidad ambiental y su actividad en condiciones ambientales extremas. En este video, demostramos los métodos involucrados en el cribado, caracterización y aplicación de biosurfactantes, producidos por diferentes cepas de rodococcus, lysinibacillus y paenibacillus. Ilustramos además los métodos para evaluar la aplicación de la combinación de biosurfactantes, producidos por estas tres cepas microbianas en la recuperación de aceite residual mediante una técnica de columna de paquete de arena.
El trabajo se ha llevado a cabo bajo la dirección del Dr. Preeti Srivastava y el Dr. Manoj Kumar. Para el crecimiento de microbios, inocule los matraces que contienen cien mililitros de caldo Luria en autoclave, agregando un mililitro de cultivo de semillas cultivado durante la noche al matraz dentro del gabinete de flujo de aire laminar. Incubar los matraces en una incubadora rotativa a 30 grados centígrados y 180 RPM durante siete días.
Después de completar el período de incubación, coseche los matraces y transfiera el caldo de cultivo a los tubos de la centrífuga. Centrifugar el cultivo a 4,500 G durante 20 minutos en una centrífuga refrigerada a cuatro grados centígrados. Vierta suavemente el sobrenadante libre de células en un vaso de precipitados fresco y úselo en ensayos de detección para la producción de biosurfactantes.
Para examinar la producción de biosurfactante mediante un ensayo de colapso de gotas, tome un portaobjetos de vidrio limpio y cubra la superficie del portaobjetos con 200 microlitros de aceite. Ahora agregue 20 microlitros de sobrenadante libre de células al centro del aceite y déjelo sin molestar durante dos o tres minutos. Si la gota colapsa, puntúe el sobrenadante positivo para la presencia de biosurfactante.
En el ensayo de propagación de aceite, tome 20 mililitros de agua destilada doble en una placa de Petri y agregue 200 microlitros de petróleo crudo en la superficie del agua. Ahora agregue 20 microlitros de sobrenadante libre de células al centro del aceite y déjelo sin molestar durante un minuto. Si se forma una zona de desbroce como resultado del desplazamiento del petróleo, puntúe el sobrenadante positivo para la presencia de biosurfactante.
En el ensayo de índice de emulsión, agregue cuatro mililitros de gasolina y sobrenadante sin celdas cada uno en un tubo de vidrio limpio. Luego, qué mezclar vigorosamente durante tres minutos y dejarlo sin molestar durante las próximas 24 horas. Para medir la tensión superficial del sobrenadante libre de células, limpie el recipiente de vidrio con el líquido cuya tensión superficial se va a determinar.
Agregue el líquido en el recipiente y monte el recipiente en el soporte del recipiente. Desbloquee el soporte de la sonda y monte la sonda en él. Usando el controlador manual, ajuste la altura de la plataforma, de modo que la sonda esté a dos o tres milímetros de distancia de la superficie del líquido.
Luego vaya a los softwares y siga los pasos mencionados en el documento para medir la tensión superficial. Después de completar la medición, baje la altura de la plataforma y desbloquee y desmonte la sonda y el recipiente del instrumento. Para la extracción de biosurfactante, ajuste el pH del sobrenadante libre de células a dos, utilizando dos ácidos clorhídricos normales.
Guarde la mezcla a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, agregue el mismo volumen de mezcla de metanol cloroformo y mezcle vigorosamente durante 20 minutos. Deje la mezcla sin perturbaciones para que se produzca una separación libre.
Retire la cara superior, que contiene agua y metanol, y deje que la cara inferior que contiene biosurfactante se evapore en una campana de humos. Después de la evaporación de la fase orgánica, vuelva a disolver el biosurfactante de color miel en tres mililitros de cloroformo y use esta mezcla para la caracterización e identificación del biosurfactante. Para la caracterización cromatográfica del biosurfactante extraído, detecte 20 microlitros de biosurfactante en placas TLC.
Después de secar las placas, coloque la placa TLC dentro de la cámara saturada con mezcla de metanol cloroformo y ejecute la TLC. Para la detección de lípidos, agregue algunos gránulos de yodo en la cámara fresca y sature la cámara durante cinco a 10 minutos. Coloque el TLC dentro de la cámara y observe el desarrollo de manchas amarillas.
Para la detección de proteínas y carbohidratos, rocíe la placa TLC con no hidrógeno o anisaldehído, y caliente a 110 grados centígrados y observe el desarrollo del color. Para el análisis de RMN, inserte el tubo en la llave inglesa. Ajuste la altura del tubo utilizando el tubo ajustado.
Coloque el tubo de RMN, junto con la llave inglesa en una máquina de RM y siga los pasos mencionados en el documento para obtener un espectro de RMN. Para un experimento mejorado de recuperación de aceite, tome una columna de vidrio y selle la salida inferior con lana de vidrio y cuentas de vidrio. Retroceda la columna con suelo arenoso de tal manera que se pueda agregar algo de líquido en la parte superior del suelo.
Monte la columna en el soporte y agregue algunas cuentas de vidrio en la parte superior del suelo. Inunde la columna con 50 mililitros de solución de salmuera y recoja el flujo para determinar el volumen deficiente. Retire la salmuera de la columna forzando el paso del petróleo crudo a través de ella.
Recoja el volumen de salmuera y aceite que sale de la columna para determinar el volumen inicial de saturación de aceite. Después de 24 horas, inunde la columna con 10 volúmenes pobres de salmuera y recoja el petróleo que sale de la columna para estimar la recuperación secundaria de petróleo. El aceite que queda en la columna después de la recuperación secundaria de petróleo corresponde al aceite residual.
Ahora prepare una mezcla de biosurfactantes agregando el biosurfactante extraído a un vaso de precipitados de vidrio. Y agregue el biosurfactante y la mezcla a la columna, y déjelo sin molestar durante las próximas 24 horas. Después de 24 horas, mida la cantidad de aceite y agua que ha aludido fuera de la columna para determinar la recuperación de petróleo adicional o mejorada.
Los sobrenadantes libres de células de las tres cepas microbianas obtuvieron una puntuación positiva para la presencia de biosurfactante, ya que resultaron en el colapso de la gota, la propagación del aceite y la formación de emulsiones. La confirmación de la producción de biosurfactante se proporcionó mediante la medición de la tensión superficial del caldo libre de células. Debido al crecimiento de rodocócos y lisinibacilos, la tensión superficial del medio se redujo de 59 a 45 mN por metro.
Debido al crecimiento de paenibacillus, la tensión superficial del medio se redujo de 59 a 28,4 mN por metro. Los ensayos de estabilidad de la emulsión mostraron que los biosurfactantes producidos por las tres cepas microbianas exhibieron una gran estabilidad en condiciones diversas y ambientales. Los índices de emulsión no mostraron ningún cambio significativo cuando se cambiaron la temperatura de incubación, el pH y la concentración de sal del caldo libre de células.
La caracterización DLC del biosurfactante extraído mostró que los biosurfactantes producidos por las tres cepas eran glicolipeds. La identificación química de biosurfactantes mostró que rodococcus y lysinbacillus produjeron el mismo biosurfactante, que fue identificado como ramnolípido, con una masa de alrededor de cuatro 80 daltons. Paenibaccilus, por otro lado, produce un ramnolípido que contiene tres cadenas lipídicas con una masa de alrededor de 802 daltons.
La combinación de biosurfactantes fue capaz de recuperar el 56,5% del aceite residual de la columna de arena. Se probó la producción de biosurfactantes a partir de las cepas de rodococcus, lsyinibaccilus y paenibacillus, y las cepas obtuvieron una puntuación positiva para la producción de biosurfactante. Los biosurfactantes producidos fueron caracterizados e identificados como ramnolípidos.
Dado que la combinación de biosurfactantes tuvo éxito en la recuperación del 56% del aceite residual en una técnica de paquete de arena, la combinación de biosurfactante se puede utilizar en aplicaciones de campo para recuperar el aceite residual atrapado dentro de los depósitos de petróleo.
