חלבונים פוטורצפטורים המתויגים על ידי GFP, כמו ערוץ היונים TRPL GFP, מאפשרים לנו לחקור הובלת חלבונים בתאי עצב באמצעות טכניקות לא פולשניות. שיטה זו יכולה לשמש גם לניטור ניוון פוטורצפטורים. לפיכך, ניתן לחקור את הבסיס המולקולרי של מחלות תורשתיות הגורמות לעיוורון בבני אדם בעין דרוזופילה.
ניתן להעריך לוקליזציה תאית של חלבונים המתויגים ב-GFP על-ידי התבוננות בפלואורסצנציה בפסאודו-פופיל העמוק או על-ידי מיקרוסקופיה של טבילה במים. שתי השיטות מאפשרות קביעה מהירה של לוקליזציה של חלבונים חזותיים והתבוננות בפגמים מבניים של rhabdomeres עקב התנוונות של תאים פוטורצפטורים. כדי להשיג תמונות באיכות גבוהה, ההיבט החשוב ביותר הוא הכיוון של עין הזבוב.
בעת ביצוע טכניקה זו, יש להתמקד באומטידיה הממוקמת מעט לכיוון פריפריית העין. אני אדגים את הפרוצדורה של הדמיית DPP, בעוד ששתי הטכניקות המשתמשות במיקרוסקופיה של טבילה במים יודגמו על ידי עמיתתי, ד"ר קריסטינה וגנר, ומתיאס זגר, דוקטורנט בקבוצה שלנו. כדי להתחיל פסאודו-פופיל עמוק, או DPP, הדמיה, להרדים זבובים בני יום עד שלושה ימים, ולמקם אחד מהם במרכז מטרת המיקרוסקופ בצדו, כך שעין שמאל או ימין תעמוד מול המטרה באופן רדיאלי בדיוק.
הגדל את ההגדלה כך שתתאים לעין כולה, ומרכז את האומטידיה המרכזית של העין. במידת האפשר, הקטינו את עומק השדה של המיקרוסקופ על ידי התאמת הסרעפת בעלת הקשתית הכפולה לסביבה רדודה. לאחר מכן, הפעל את מנורת ה- UV של המיקרוסקופ בעוצמה מרבית.
לאחר מכן, בחר את סט המסנן הפלואורסצנטי של המיקרוסקופ בהתאם לחלבון הפלואורסצנטי המבוטא בעיניים, והגדר את נתיב האור לעבר המצלמה המותקנת במיקרוסקופ. באמצעות תכונת ההדמיה החיה בתוך התוכנה, התאם את בהירות התמונה להגדרה המזהה רק אותות ספציפיים מהעין על ידי העלאת זמן החשיפה וצבר ערך. התאימו מחדש את המיקוד של המיקרוסקופ לעין כדי ליצור את התמונה העל-גבית של ה-DPP.
לאחר מכן, צלם תמונה של ה- DPP הפלואורסצנטי. כדי להכין זבוב בווריאציה קטלנית, הדביקו חתיכת פלסטלינה על שקופית אובייקט וחתיכה נוספת למרכז צלחת פטרי. מלאו את צלחת הפטרי במים מזוקקים מקוררים בקרח ובכמה פתיתי קרח.
לאחר מכן, שים זבוב אחד מורדם קרח מתחת למיקרוסקופ סטריאו על גבי שקופית האובייקט המצופה פלסטלינה. סובבו את הזבוב על גבו, ונקבו סיכת חרקים דרך מרכז בית החזה. קבעו את הסיכה אופקית בשקופית האובייקט המצופה פלסטלינה, וכיוונו את העין השמאלית או הימנית של הזבוב כלפי מעלה.
לאחר מכן, קבעו בזהירות את החלקת האובייקט עם הצד נטול הפלסטלינה שלו הפונה כלפי מטה בצלחת פטרי, ובכך מנעו סיבוב של ראש הזבוב. ודא שעין הזבוב מכוסה במים. לחלופין, כדי להכין זבוב בווריאציה לא קטלנית, העבירו תחילה את ראש הזבוב המורדם בקרח לקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר, ודחפו בזהירות את הזבוב לכיוון הקצה עם אוויר דחוס.
לאחר מכן, באמצעות אזמל, חתכו את קצה הפיפטה ממש מול הראש, ובאמצעות פינצטה דוחפים בזהירות את הזבוב כמה מילימטרים לתוך קצה הפיפטה. חותכים שוב את קצה הפיפטה, ודוחפים את הזבוב בחזרה לכיוון הקצה עם האוויר הדחוס כך שרק ראש הזבוב בולט מקצה הפיפטה. לאחר הדבקת חתיכת פלסטיקין על שקופית אובייקט, לחץ את קצה הפיפטה לתוכה כך שעין שמאל או ימין פונה כלפי מעלה.
ודא שהעין מכוונת כראוי מתחת למיקרוסקופ. לרכישת תמונה, בחר מטרה לטבילה במים. במקרה של וריאציה לא קטלנית, השתמש בפיפטה של מעבדה כדי להדביק טיפה גדולה של מים צוננים לחלק התחתון של מטרת טבילת המים.
מקם בזהירות את שקופית האובייקט עם הזבוב המוכן על במת המיקרוסקופ. לאחר מכן, הנמיכו את מטרת טבילת המים באופן ידני עד שהיא תיצור קשר עם פני המים או שעינו של הזבוב תיגע בטיפה. לאחר מכן, החלף את נתיב האור לכיוון מצלמת המיקרוסקופ, וצור תמונה חיה.
התאימו מחדש את המיקוד למצלמה, והעריכו את כיוון העין, בהתחשב בכך שהעין חייבת להתמודד עם מטרת המיקרוסקופ באופן רדיאלי. השתמש בתוכנת טבלת בדיקת המידע כדי לזהות פיזור יתר. במקרה של זבובים ללא פיגמנט, התאם את זמן החשיפה כך שהפיקסלים הבהירים ביותר יהיו ממש מתחת לגבול הרוויה עבור כל תמונה.
הקלט תמונה ושמור אותה כקובץ גולמי כדי לאחסן בארכיון את כל המטא-נתונים המתאימים של ההקלטה. לאחר מכן, ייצא את התמונה בפורמט tif. כדי לכמת פלואורסצנציה יחסית של eGFP ברבדומרים של מיקרוגרפים של טבילת מים, התאם את הגדרות ImageJ על-ידי לחיצה על נתח, לאחר מכן הגדר מדידות, וסמן רק את התיבה עבור ערך אפור ממוצע.
ייבא את תמונת ה- tif על-ידי לחיצה על קובץ ולאחר מכן פתח. בחר אזור מייצג של התמונה במיקוד, והגדל אותה ל- 200 עד 300% על-ידי הקשה חוזרת ונשנית על Control ויחד. לאחר מכן, בחר את הכלי סגלגל, ותוך כדי לחיצה על מקש Shift צור בחירה מעגלית בתמונה שהיא קטנה משמעותית מרבדומר פלואורסצנטי אחד.
לאחר מכן, חפש את הגודל המדויק המוצג מתחת לסרגל הכלים בחלון הראשי של ImageJ. כדי למדוד את עוצמות הפלואורסצנציה בתוך הסלקציה המעגלית, הזז את המעגל ל-rhabdomere הראשון עם מקשי החצים במקלדת, ולחץ על נתח ולאחר מכן מדוד. חלון תוצאה המפרט את הערך האפור שנמדד יופיע.
המשך עם מדידות של rhabdomeres שניים עד שישה, וגם למדוד את אות הרקע. במקרה של זבובים ללא פיגמנט, בצע מדידות נוספות של אזורי גוף התא המתאימים. מדוד את הפלואורסצנציה של שני אומטידיה נוספים, וכתוצאה מכך שלושה שכפולים טכניים.
סמן את האומטידיה המנותחת באמצעות הכלי עיפרון ושמור תמונה זו לתיעוד. בחר והעתק את הערכים האפורים שנמדדו מחלון התוצאה והדבק אותם בתוכנת גיליון אלקטרוני לצורך חישובים נוספים. מיין את ערכי עוצמת הפלואורסצנציה לפי מקורם לקטגוריות rhabdomere, גוף התא והרקע, וחשב את העוצמה הממוצעת מכל קטגוריה.
לאחר מכן, חשב את הכמות היחסית של eGFP הקיימת ברבדומר באמצעות הנוסחה הראשונה עבור עיניים ללא פיגמנט והשנייה עבור עיניים פיגמנטיות. לחלופין, כדי לכמת את המורפולוגיה של העין על ידי פלואורסצנציה eGFP במיקרוגרפים של טבילת מים, בחר שלושה אומטידיה סמוכים באזור מייצג של התמונה שנמצאת בפוקוס. הערך את 18 ה-rhabdomeres של הבחירה בנפרד על פי עוצמת ה-eGFP, חדות הקצוות והניגודיות שלהם ביחס לאות הרקע שמסביב.
לבסוף, תן ציון ל-rhabdomeres הגלויים בבירור עם ערך של שני rhabdomeres הנראים לעין שבועיים עם ערך של אחד, ו-rhabdomeres נעדרים עם ערך של אפס כדי ליצור מדד ניוון. בזבובי דרוזופילה מהונדסים המבטאים חלבון היתוך EGFP TRPL, פלואורסצנציה רבדומרלית נעלמת באור עקב טרנסלוקציה של eGFP TRPL. זה מאפשר ביצוע בדיקה גנטית כדי לזהות מוטנטים פגומים בהפנמה של eGFP TRPL.
בזבובי בקרה, eGFP TRPL עובר טרנסלוקציה מתוך הרבדומרים לתוך גוף התא לאחר 16 שעות של תאורה, וכתוצאה מכך נוצרת ירידה משמעותית בפלואורסצנציה הרבדומרלית בהשוואה למצב המותאם לחושך. הדגירה הכהה השנייה מעלה שוב את הפלואורסצנציה הרבדומרלית לעבר הערך ההתחלתי. עם זאת, בטרנסלוקציה TRPL מוטציה פגומה vps35MH20, תבנית הפלואורסצנציה אינה משתנה באופן דרסטי לאחר 16 שעות של תאורה והסתגלות חשוכה לאחר מכן במשך 24 שעות.
שיטת כימות זו יכולה לזהות פגם במיחזור מובהק ביותר מבחינה סטטיסטית. זבובים בעלי עיניים לבנות מאפשרים זיהוי של אותות פלואורסצנטיים הן מהרבדומרים והן מגוף התא. לעומת זאת, בזבובים אדומי עיניים, אותות פלואורסצנטיים ניתנים לזיהוי רק ברבדומרים אך לא בגוף התא.
לגבי הכימות של ניוון הרשתית, ניתן להעריך את הפלואורסצנציה eGFP TRP במשך מספר שבועות. כאשר הוחזקו במחזור אור של 12 שעות ו-12 שעות חשוך במשך שבועיים, מדד הניוון ירד בזבובים מוטנטיים אך לא בזבובי בקרה. בפרוטוקול זה, יש להבחין בין עיניים פיגמנטיות ללא פיגמנטיות.
מאחר שפיגמנטציה משפיעה על האות הפלואורסצנטי, מיקרוסקופיה כמותית של טבילת מים עברה אופטימיזציה לשני המקרים בנפרד. הדמיית DPP ומיקרוסקופיה של טבילה במים הן שיטות בתפוקה גבוהה עם רזולוציה מוגבלת. כדי לחקור לוקליזציה תת-תאית, אנו ממליצים על מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית על חלקי רקמות.
לניתוח מפורט של פנוטיפים ניווניים, ניתן לבצע מיקרוסקופיית אלקטרונים.
