이 프로토콜은 고처리량 CRISPR 유전자 편집 워크플로우를 사용하여 조직화되고 클러스터링된 단위의 마이크로 RNA 유전자를 분자적으로 해부합니다. 그리고 이러한 비코딩 RNA 네트워크가 암 진행 경로를 조정하는 방법을 결정합니다. 이 CRISPR 유전자 편집 절차를 통해 연구자는 시간이 많이 걸리는 DNA 벡터 하위 클로닝을 피하면서 고유한 마이크로 RNA 클러스터 결실 조합을 운반하는 전체 세포주 패널을 신속하게 생성할 수 있습니다.
이 방법은 마이크로 RNA를 치료 및 진단 도구로 클리닉으로 번역하기 전에 클러스터링된 마이크로 RNA가 종양 성장, 공격성 및 약물 내성을 조절하기 위해 협력적으로 기능하는 방법에 대한 명확한 이해를 제공합니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구 조교 인 Grace Yi가 될 것입니다. 우선, DNA 서열 주석 소프트웨어 프로그램을 사용하여 주변 게놈 영역의 적어도 1킬로바이트에서 관심 있는 마이크로 RNA 클러스터 영역의 완전한 게놈 서열을 포함하는 DNA 파일을 생성한다.
다음으로, 각 표적 마이크로 RNA 유전자좌에 대해 4개의 고유한 CRISPR RNA를 설계합니다. 마이크로 RNA 헤어핀 클러스터의 5 개의 프라임 즉시 보완 DNA 서열을 표적으로 삼도록 설계된 2 개의 CRISPR RNA와 마이크로 RNA 헤어핀 클러스터의 3 개의 프라임 즉시 보완 DNA 서열을 표적으로 삼도록 설계된 2 개의 CRISPR RNA. 생성된 DNA 파일에서 특징 편집 도구를 사용하여 합성할 각 설계된 CRISPR RNA에 대한 DNA 표적 서열을 표시합니다.
CRISPR 세포주의 유전형 분석을 위해 표적화된 마이크로 RNA 클러스터 영역 옆에 PCR 프라이머를 설계 및 합성했습니다. 새로 생성된 렌티 유도성 Cas9 세포주에 대해 독시사이클린 농도 곡선을 수행하여 Cas9 단백질 유도를 위한 최적 조건을 결정합니다. 각 6웰 플레이트의 웰당 4번째 세포를 5회 10회 플레이트하고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 바람직한 배지에서 성장시킨다.
최종 독스 농도 곡선이 밀리리터당 0,5100, 150, 250 내지 500 나노그램인 바람직한 배지에서 독스를 희석한다. 6개의 웰 플레이트에 앉은 각 웰의 웰에 1개에서 6개까지 라벨을 붙입니다. 배지를 제거하고 적절한 dox 농도로 교체하십시오.
24 시간, 48 시간 및 72 시간 dox 유도 및 dox 중단 후 120 시간까지 플레이트를 1-4 개까지 성장시킵니다. 각 시점에서 접시의 우물을 수확하십시오. 용해물 분리를 위해 세포 펠릿과 리파 완충액을 처리합니다.
40마이크로그램의 단백질로 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 Cas9 단백질 유도를 측정하고 최적의 Cas9 농도를 결정합니다. 종이에, 전체 마이크로 RNA 클러스터, 다양한 클러스터형 마이크로 RNA 유전자 조합 및 개별 마이크로 RNA 클러스터 구성원을 대상으로 하는 24웰 플레이트의 각 웰로 형질전환될 5개의 프라임 및 3개의 프라임 CRISPR RNA 쌍 조합을 매핑합니다. 렌티유도캐스트된 9개의 세포주를 24 웰의 웰당 5회 내지 4번째 세포를 최적화된 dox 농도를 함유하는 바람직한 배지에 플레이트화한다.
Cas9 단백질 발현을 유도하기 위해 섭씨 37도, 5% 이산화탄소에서 24-48시간 동안 세포를 성장시킵니다. 렌티 유도성 Cas9 세포를 준비된 5개의 프라임 및 3개의 프라임 가이드 RNA로 형질감염시킵니다. 표적 마이크로 RNA 유전자좌당 4개의 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 라벨을 붙입니다.
각 튜브에서 추적 RNA와 고유한 CRISPR RNA의 1:1 몰비를 함께 혼합하여 두 개의 마이크로몰 가이드 RNA 복합체를 형성합니다. 2.5 마이크로리터의 추적 RNA, 1.25 마이크로리터의 5개의 프라임 포지셔닝된 CRISPR RNA, 1.25 마이크로리터의 3개의 프라임 포지셔닝된 CRISPR RNA, 및 5마이크로리터의 10밀리몰 트리스 hcl pH 7.5 완충액을 1.5밀리리터 원심분리 튜브에 첨가한다. 마이크로 원심분리기를 16, 000회 G에서 30초 동안 혼합하여 혼합한다.
실온에서 5 분 동안 배양하십시오. 각 튜브를 40 마이크로리터의 환원혈청배지에서 10 마이크로리터의 가이드 RNA 복합체로 반응시켰다. 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 섞습니다.
깨끗한 1.5 밀리리터 원심분리 튜브에서, 2 마이크로리터의 형질주입 시약과 48 마이크로리터의 환원된 혈청 배지를 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합하였다. 실온에서 5 분 동안 배양하십시오. 50 마이크로리터의 가이드 RNA 믹스를 함유하는 각각의 튜브에, 희석된 형질주입 시약 50 마이크로리터를 첨가한다.
혼합물을 천천히 위아래로 한 번 피펫팅하여 혼합합니다. 실온에서 20 분 동안 배양하십시오. 독시사이클린이 보충된 400 마이크로리터의 무항생제 배지를 100 마이크로리터의 가이드 RNA 형질주입 믹스를 함유하는 각각의 튜브에 첨가한다.
피펫을 부드럽게 섞습니다. 독시사이클린 유도 렌티인성 Cas9 세포로부터 배지를 제거한다. 500 마이크로리터의 배지 독시사이클린 가이드 RNA 형질전환 믹스를 24웰 플레이트 실험 맵에 기초하여 추가한다.
형질감염된 세포를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소에서 48시간 동안 배양합니다. 배지를 독시사이클린이없는 새로 준비된 배지로 교체하십시오. 세포가 섭씨 24도 및 48 % 이산화탄소에서 37-5 시간 동안 회복되도록하십시오.
형질 감염된 세포를 수확하고 유전형 분석 및 단일 세포 망상에 대비하십시오. 150 마이크로 리터의 재현 된 세포를 세 부분으로 분리합니다. 형질감염된 세포의 1/3을 배지에 냉동하고 장기 보관을 위해 냉동 바이알에 10%DMSO를 냉동합니다.
유전형 분석을 위해 형질감염된 세포의 1/3을 깨끗한 0.2밀리리터 PCR 튜브로 옮깁니다. 단일 세포 콜로니를 생성하기 위해 96웰 플레이트 형식으로 계수 및 희석을 위해 형질감염된 세포의 마지막 1/3을 준비합니다. 12채널 다중 피펫터와 멸균 시약 저장소를 사용하여 각 희석에 대해 플레이트의 두 줄에 웰당 100마이크로리터의 희석된 세포를 추가합니다.
단일 세포 콜로니 확장을 위해 세포가 동시성으로 성장할 때까지 4-6주를 허용합니다. 유전형 분석을 위해 약 10-15개의 단일 세포 콜로니를 수집합니다. 각 표적 마이크로 RNA 유전자좌에 대해 최소 3개의 독립적인 녹아웃 단일 세포 콜로니 라인을 식별합니다.
야생형 단일 세포주를 대조군으로 유지합니다. 세포 펠렛을 4 마이크로리터의 5개의 X DNA 폴리머라제 완충액, 1 마이크로리터의 프로테이나제 K, 1 마이크로리터의 RNase A, 및 뉴클레아제 활성수를 총 부피 20 마이크로리터까지 재현탁시켰다. 열 순환기의 세포를 섭씨 56도에서 30 분, 섭씨 96도에서 5 분 동안 이가 있습니다.
PCR 유전형 분석이 준비될 때까지 세포 용해물을 섭씨 영하 20도에서 보관합니다. 가이드 RNA 5개의 프라임 및 3개의 프라임 가이드 RNA 표적 부위를 측면에 위치시키는 설계된 PCR 프라이머를 사용하여 PCR 유전형 분석 반응을 수행합니다. 텍스트 원고에 언급 된 프로그램을 사용하여 열 순환기에서 PCR 반응을 실행하십시오.
전기영동 분석을 위해 PCR 산물을 1%아가로스 겔에 로드합니다. 녹아웃 유전자형에 대해 예측된 분자 크기의 분리된 PCR 단편에서 DNA를 추출합니다. DNA 시퀀싱을 위해 샘플을 준비합니다.
CRISPR 반응이 성공적인지 확인하고 분리된 PCR 단편의 DNA 시퀀싱을 수행하여 Cas9 절단 부위를 식별하고 마이크로 RNA 유전자좌 결실을 확인합니다. 독특한 CRISPR RNA는 전체 35 킬로 염기 miR-888 클러스터 영역을 표적으로 삼도록 설계되었습니다. miR-743 계열 또는 miR-891 계열 내의 더 작은 클러스터 조합 및 마이크로 RNA 결실.
PCR 반응의 겔 전기영동 분석은 녹아웃 유전자형을 나타내는 예측된 DNA 단편 크기가 각각의 CRISPR 형질주입에 대해 증폭되었음을 나타내었다. 단일 세포 콜로니는 PCR에 의해 유전자형을 서열 검증하였다. 이러한 단리된 녹아웃 PCR 단편의 DNA 시퀀싱은 형질감염된 5개의 프라임 및 3개의 프라임 가이드 RNA가 PAM 부위의 상류에서 대략 3개의 뉴클레오티드 Cas9 절단 결찰을 지시하고 표적화된 마이크로 RNA 유전자좌의 게놈 손실을 검증했음을 확인했습니다.
miR-891a 녹아웃과 야생형 세포를 비교한 WST-1 증식 분석은 마이크로 RNA 모방 렌티바이러스 벡터의 과발현이 전립선 세포 성장을 유도한다는 것을 확인했으며, 따라서 miR-891 a 손실은 상호 효과를 나타낼 것으로 예측되었다. 신중한 가이드 RNA 설계 외에도 각 마이크로 RNA 녹아웃 라인을 통해 단일 세포 콜로니를 빠르게 생성하는 것이 중요합니다. 마이크로 RNA 녹아웃 세포가 생존력의 성장을 감소시키고 야생형 세포와 혼합 집단에서 쉽게 경쟁할 수 있는 경우 특히 관련이 있습니다.
CRISPR 녹아웃 세포주가 결실된 유전자좌에 대해 성숙한 마이크로 RNA를 발현하지 않는다는 것을 확인하기 위해 정량적 실시간 PCR, 노던 블롯 및 RNA 시퀀싱과 같은 추가 방법을 수행해야 합니다.
