Этот протокол использует высокопроизводительный рабочий процесс редактирования генов CRISPR для молекулярного препарирования микрогенов РНК, организованных и кластеризованных единиц. И определить, как эти некодирующие сети РНК координируют пути прогрессирования рака. Эта процедура редактирования генов CRISPR позволяет исследователю быстро генерировать целую панель клеточных линий, несущих уникальные комбинации делеции кластеров микро-РНК, избегая при этом трудоемкого субклонирования вектора ДНК.
Этот метод обеспечит более четкое понимание того, как кластерные микроРНК функционируют совместно для регулирования роста опухоли, агрессивности и лекарственной устойчивости, прежде чем переводить микроРНК в клинику в качестве терапевтических и диагностических инструментов. Продемонстрировать процедуру будет Грейс Йи, научный сотрудник моей лаборатории. Для начала создайте файл ДНК, содержащий полную геномную последовательность интересующей области кластера микроРНК по меньшей мере в одном килобайте окружающих геномных областей, используя программное обеспечение для аннотирования последовательностей ДНК.
Затем разработайте четыре уникальные РНК CRISPR для каждого целевого микро-РНК-локуса. Две разработанные РНК CRISPR для нацеливания на дополнительные последовательности ДНК сразу же пять основных из кластера микро-РНК шпильки и два разработанных CRISPR РНК для нацеливания на дополнительные последовательности ДНК непосредственно на три основных из кластера микро-РНК шпильки. Используйте инструмент редактирования функций в созданном файле ДНК, чтобы отметить последовательность мишеней ДНК для каждой разработанной CRISPR РНК, подлежащей синтезу.
Разработаны и синтезированы праймеры ПЦР, фланкирующие целевые области кластера микроРНК для генотипирования клеточных линий CRISPR. Выполните кривую концентрации доксициклина на вновь генерируемых лентии индуцируемых клеточных линиях Cas9, чтобы определить оптимальные условия для индукции белка Cas9. Пластина пять раз по 10 четвертых ячеек на лунку каждой из шести лунок плиты и растет при 37 градусах Цельсия, 5% углекислого газа, в предпочтительной среде в течение 24 часов.
Разбавляют докс в предпочтительной среде с конечной кривой концентрации докса в диапазоне от 0 5100, 150, 250 до 500 нанограмм на миллилитр. Обозначьте колодцы каждой сидящей шестилуночной плиты от одной до шести. Удалите среду и замените соответствующими концентрациями докса.
Выращивайте тарелки от одного до четырех до 24 часов, 48 часов и 72 часов индукции докса и 120 часов после отмены докса. Заготавливайте колодцы плиты в каждый момент времени. Обработайте гранулы клеток и буфер рипа для выделения лизата.
Выполните анализ вестерн-блоттинга с 40 микрограммами белка, чтобы измерить индукцию белка Cas9 и определить оптимальную концентрацию Cas9. На бумаге наметьте пять комбинаций первичных и трех основных пар РНК CRISPR, которые будут трансецированы в каждую лунку пластины из 24 лунок, нацеленных на весь кластер микро-РНК, различные кластерные комбинации генов микро-РНК, а также отдельные члены кластера микро-РНК. Пластинчатая ленти индуцируемая литая девятиячеечная линия в пять раз по 10 до четвертой ячейки на лунку из 24 лунок пластины в предпочтительной среде, содержащей оптимизированную концентрацию докса.
Выращивайте клетки в течение 24-48 часов при 37 градусах Цельсия, 5% углекислого газа, чтобы индуцировать экспрессию белка Cas9. Трансфектируйте ленти-индуцируемые клетки Cas9 подготовленными пятью первичными и тремя первичными направляющими РНК. Пометьте четыре 1,5-миллилитровые микроцентрифужные трубки на целевой локус микроРНК.
В каждой трубке смешайте один к одному молярное соотношение индикаторной РНК и уникальных РНК CRISPR вместе, чтобы сформировать два микромолярных комплекса направляющих РНК. Добавьте 2,5 микролитра трассирующей РНК, 1,25 микролитра пяти первично позиционированных РНК CRISPR, 1,25 микролитра трех первично позиционированных РНК CRISPR и пять микролитров 10 миллимолярных трис hcl pH 7,5 буфера к 1,5-миллилитровой центрифужной трубке. Микроцентрифуга в течение 30 секунд при 16 000 G для смешивания.
Инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. К каждой трубке при 40 микролитрах восстановленной сывороточной среды до 10 микролитров головной РНК комплексной реакции. Аккуратно перемешайте, пипеткой вверх и вниз.
В чистой 1,5-миллилитровой центрифужной трубке мягко смешивают два микролитра трансфекционного реагента и 48 микролитров восстановленной сывороточной среды путем пипетки вверх и вниз. Инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. К каждой трубке, содержащей 50 микролитров направляющей смеси РНК, добавляют 50 микролитров разбавленного трансфекционного реагента.
Пипетка смеси медленно вверх и вниз один раз, чтобы перемешать. Инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут. Добавьте 400 микролитров свободной от антибиотиков среды, дополненной доксициклином, в каждую трубку, содержащую 100 микролитров направляющей трансфекционной смеси РНК.
Пипетку аккуратно перемешать. Удалите среду из индуцированных доксициклином ленти индуцируемых клеток Cas9. Добавьте 500 микролитров смеси трансформации рудиодоксициклиновой направляющей РНК на основе экспериментальной карты 24 лунок.
Инкубируйте трансфектированные клетки в течение 48 часов при 37 градусах Цельсия в 5% углекислом газе. Замените среду свежей подготовленной средой без доксициклина. Позвольте клеткам восстановиться еще от 24 до 48 часов при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.
Соберите трансфектированные клетки и подготовьтесь к генотипированию и одноклеточному бреду. Разделите 150 микролитров повторно суспендированных клеток на три части. Заморозить треть трансфектированных клеток в среде плюс 10% ДМСО в крио-флаконах для длительного хранения.
Переведите треть трансфектированных клеток в чистую 0,2-миллилитрную ПЦР-трубку для генотипирования. Подготовьте последнюю треть трансфектированных клеток для подсчета и разбавления в формате пластины из 96 лунок для создания колоний одиночных клеток. Используя 12-канальный многопильный пипетку и стерильный резервуар для реагентов, добавьте 100 микролитров разбавленных ячеек на лунку в два ряда пластины для каждого разбавления.
Дайте четыре-шесть недель, чтобы клетки выросли до софлюентности для расширения одноклеточной колонии. Соберите примерно от 10 до 15 одноклеточных колоний для генотипирования. Определите, по крайней мере, три независимые нокаутирующие одноклеточные колониальные линии для каждого целевого микро-локуса РНК.
Сохранение одноячечных линий дикого типа в качестве элементов управления. Resuspend представлял собой клеточную гранулу в четырех микролитрах из пяти X-днк-полимеразного буфера, одного микролитра протеиназы K, одного микролитра РНКазы A и воды без нуклеазы общим объемом до 20 микролитров. Вши клетки в термоциклере при 56 градусах Цельсия в течение 30 минут и 96 градусов Цельсия в течение пяти минут.
Храните лизаты клеток при температуре минус 20 градусов цельсия до готовности к генотипированию ПЦР. Выполните реакцию генотипирования ПЦР с использованием разработанных праймеров ПЦР, которые обрамляют направляющую РНК пять первичных и три первичных направляющих РНК-таргетных сайта. Запустите реакцию ПЦР в термоциклере с помощью программы, упомянутой в текстовой рукописи.
Загрузите продукты ПЦР на гель 1% агарозы для анализа электрофореза. Извлеките ДНК из изолированных фрагментов ПЦР прогнозируемого молекулярного размера для нокаутирующих генотипов. Подготовьте образцы для секвенирования ДНК.
Подтвердить, что реакция CRISPR была успешной, и выполнить секвенирование ДНК изолированных фрагментов ПЦР для идентификации места расщепления Cas9 и подтверждения делеции локуса микро-РНК. Были разработаны уникальные РНК CRISPR, нацеленные на всю 35-килограммовую область кластера miR-888. Меньшие кластерные комбинации в семействе miR-743 или семействе miR-891, а также делеции микроРНК.
Анализ гель-электрофореза реакций ПЦР показал, что прогнозируемый размер фрагмента ДНК, представляющий нокаутирующий генотип, был амплифицирован для каждой трансфекции CRISPR. Одноклеточные колонии генотипировали с помощью ПЦР в проверенной последовательности. Секвенирование ДНК этих изолированных нокаутированных фрагментов ПЦР подтвердило, что трансфектированные пять первичных и три первичных направляющих РНК направляли лигирование расщепления Cas9 примерно на три нуклеотида выше участков PAM и подтвердили геномную потерю целевого микро-РНК-локуса.
Анализы пролиферации WST-1, сравнивающие нокаут miR-891a и клетки дикого типа, подтверждают, что сверхэкспрессия микро-РНК, имитирующего лентивирусный вектор, индуцирует рост клеток предстательной железы, и поэтому было предсказано, что потеря miR-891 покажет взаимные эффекты. Помимо тщательного руководства по проектированию РНК, важно быстро генерировать одноклеточные колонии через каждую линию нокаута микро-РНК. Это особенно актуально, если нокаутирующие клетки микроРНК снижают рост жизнеспособности и будут легко превзойдены в смешанных популяциях с клетками дикого типа.
Дополнительные методы, такие как количественная ПЦР в реальном времени, северное пятно и секвенирование РНК, должны быть выполнены, чтобы подтвердить, что нокаутирующие клеточные линии CRISPR не экспрессируют зрелую микроРНК для удаленного локуса.
