يستخدم هذا البروتوكول سير عمل تحرير الجينات CRISPR عالي الإنتاجية لتشريح جينات الحمض النووي الريبي الدقيقة المركبة والمتجمعة جزيئيا. وتحديد كيفية تنسيق شبكات الحمض النووي الريبي غير المشفرة هذه لمسارات تطور السرطان. يسمح إجراء تحرير الجينات CRISPR هذا للباحث بإنشاء لوحة كاملة من خطوط الخلايا بسرعة تحمل مجموعات فريدة من نوعها لحذف مجموعات الحمض النووي الريبي الصغير مع تجنب الاستنساخ الفرعي لناقلات الحمض النووي التي تستغرق وقتا طويلا.
ستوفر هذه الطريقة فهما أوضح لكيفية عمل الحمض النووي الريبي الصغير المتجمع بشكل تعاوني لتنظيم نمو الورم والعدوانية ومقاومة الأدوية قبل ترجمة الحمض النووي الريبي الصغير إلى العيادة كأدوات علاجية وتشخيصية. ستوضح غريس يي الإجراء ، وهي مساعدة باحثة في مختبري. للبدء ، قم بإنشاء ملف DNA يحتوي على التسلسل الجينومي الكامل لمنطقة مجموعة الحمض النووي الريبي الصغير ذات الأهمية في كيلوبايت واحد على الأقل من المناطق الجينومية المحيطة باستخدام برنامج التعليق التوضيحي لتسلسل الحمض النووي.
بعد ذلك ، قم بتصميم أربعة RNAs CRISPR فريدة من نوعها لكل موضع RNA صغير مستهدف. اثنان من الحمض النووي الريبي كريسبر المصمم لاستهداف تسلسلات الحمض النووي المجانية على الفور خمسة من مجموعة دبوس شعر الحمض النووي الريبي الصغير واثنين من الحمض النووي الريبي المصمم لاستهداف تسلسلات الحمض النووي المجانية على الفور ثلاثة من مجموعة دبوس شعر الحمض النووي الريبي الصغير. استخدم أداة تحرير المعالم في ملف الحمض النووي الذي تم إنشاؤه لتحديد تسلسل الحمض النووي المستهدف لكل حمض نووي RNA CRISPR مصمم ليتم تصنيعه.
تصميم وتوليف الاشعال PCR المحيطة بمناطق مجموعة الحمض النووي الريبي الصغيرة المستهدفة للتنميط الجيني لخطوط خلايا كريسبر. قم بإجراء منحنى تركيز الدوكسيسيكلين على خطوط خلايا Cas9 القابلة للحث على لينتي التي تم إنشاؤها حديثا لتحديد الظروف المثلى لتحريض بروتين Cas9. صفيحة خمسة في 10 من الخلايا الرابعة لكل بئر من كل صفيحة بئر ستة وتنمو عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ من ثاني أكسيد الكربون ، في الوسط المفضل لمدة 24 ساعة.
تمييع دوكس في الوسط المفضل مع منحنى تركيز دوكس النهائي الذي يتراوح بين 0 5100 و 150 و 250 إلى 500 نانوغرام لكل مللي لتر. قم بتسمية آبار كل طبق من ستة آبار جالسة من واحد إلى ستة. قم بإزالة الوسط واستبدله بتركيزات dox المناسبة.
تنمو اللوحات من واحد إلى أربعة حتى 24 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة من تحريض dox و 120 ساعة بعد سحب dox. حصاد آبار اللوحة في كل نقطة زمنية. قم بمعالجة كريات الخلايا والمخزن المؤقت ripa لعزل lysate.
قم بإجراء تحليل اللطخة الغربية باستخدام 40 ميكروغرام من البروتين لقياس تحريض بروتين Cas9 وتحديد تركيز Cas9 الأمثل. على الورق، قم برسم خريطة لمجموعات أزواج الحمض النووي الريبي الخمسة الرئيسية والثلاثة الرئيسية من كريسبر التي سيتم نقلها إلى كل بئر من 24 صفيحة بئر تستهدف مجموعة الحمض النووي الريبي الصغير بأكمله، ومجموعات جينات الحمض النووي الريبي الصغيرة المتجمعة المختلفة، بالإضافة إلى أعضاء مجموعة الحمض النووي الريبي الصغير الفردية. قم بلوحة خط الخلايا التسعة المصبوب القابل للحث lenti في خمسة في 10 إلى الخلايا الرابعة لكل بئر من صفيحة 24 بئرا في الوسط المفضل الذي يحتوي على تركيز dox الأمثل.
تنمو الخلايا لمدة 24 إلى 48 ساعة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون للحث على التعبير عن بروتين Cas9. قم بنقل خلايا Cas9 القابلة للتحريض lenti باستخدام خمسة RNAs رئيسية وثلاثة RNAs رئيسية محضرة. ضع علامة على أربعة أنابيب طرد مركزي صغيرة سعة 1.5 ملليلتر لكل موضع RNA صغير مستهدف.
في كل أنبوب، امزج نسبة مولية واحدة إلى واحدة من الحمض النووي الريبي المقتفي والحمض النووي الريبي الفريد من نوعه CRISPR معا لتشكيل مركب الحمض النووي الريبي الموجه للميكرومولار. أضف 2.5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي المقتفي ، و 1.25 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي CRISPR الخمسة في وضع رئيسي ، و 1.25 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي CRISPR الثلاثة في الموقع الرئيسي ، وخمسة ميكرولترات من 10 ملليمولار tris hcl pH 7.5 المخزن المؤقت إلى أنبوب طرد مركزي 1.5 ملليلتر. جهاز طرد مركزي صغير لمدة 30 ثانية عند 16،000 مرة G للخلط.
حضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. لكل أنبوب في 40 ميكرولتر من وسط المصل المنخفض إلى 10 ميكرولتر من تفاعل الحمض النووي الريبي المعقد الدليلي. اخلطي بلطف عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.
في أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 1.5 ملليلتر ، امزج ميكرولترين من كاشف النقل و 48 ميكرولتر من وسط المصل المنخفض بلطف عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. حضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. إلى كل أنبوب يحتوي على 50 ميكرولتر من مزيج الحمض النووي الريبي الموجه ، أضف 50 ميكرولتر من كاشف النقل المخفف.
ماصة الخليط ببطء لأعلى ولأسفل مرة واحدة للخلط. حضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. أضف 400 ميكرولتر من الوسط الخالي من المضادات الحيوية المكمل بالدوكسيسيكلين إلى كل أنبوب يحتوي على 100 ميكرولتر من مزيج نقل الحمض النووي الريبي الدليلي.
ماصة بلطف للخلط. قم بإزالة الوسط من خلايا Cas9 المستحثة بالدوكسيسيكلين المستحثة بالدوكسيسيكلين. أضف 500 ميكرولتر من مزيج تحويل الحمض النووي الريبي لتوجيه الدوكسيسيكلين الإعلامي استنادا إلى الخريطة التجريبية للوحة البئر 24.
احتضان الخلايا المنقولة لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية في 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. استبدل الوسط بالوسط الطازج المحضر بدون دوكسيسيكلين. اسمح للخلايا بالتعافي لمدة 24 إلى 48 ساعة أخرى عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
حصاد الخلايا المنقولة والاستعداد للتنميط الجيني وأوهام الخلية الواحدة. افصل 150 ميكرولتر من الخلايا المعاد تعليقها إلى ثلاثة أجزاء. قم بتجميد ثلث الخلايا المنقولة في متوسطة بالإضافة إلى 10٪ DMSO في قوارير التبريد للتخزين على المدى الطويل.
انقل ثلث الخلايا المنقولة إلى أنبوب PCR نظيف سعة 0.2 ملليلتر للتنميط الجيني. قم بإعداد الثلث الأخير من الخلايا المنقولة للعد والتخفيف في شكل لوحة بئر 96 لإنشاء مستعمرات خلية واحدة. باستخدام جهاز سحب متعدد القنوات مكون من 12 قناة وخزان كاشف معقم ، أضف 100 ميكرولتر من الخلايا المخففة لكل بئر إلى صفيفين من اللوحة لكل تخفيف.
اسمح للخلايا من أربعة إلى ستة أسابيع بالنمو إلى التزامن مع توسع مستعمرة الخلية الواحدة. جمع ما يقرب من 10 إلى 15 مستعمرة خلية واحدة للتنميط الجيني. حدد على الأقل ثلاثة خطوط مستقلة لمستعمرة الخلية الواحدة لكل موضع RNA صغير مستهدف.
احتفظ بخطوط الخلية المفردة من النوع البري كعناصر تحكم. تم إعادة تعليق بيليه الخلية في أربعة ميكرولترات من خمسة عازل من بوليميراز الحمض النووي X ، وميكرولتر واحد من بروتين K ، وميكرولتر واحد من RNase A ، وماء خال من النوكليز يصل حجمه الإجمالي إلى 20 ميكرولتر. قمل الخلايا في الدراجة الحرارية عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة و 96 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.
قم بتخزين التحلل الخلوي عند 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى يصبح جاهزا للتنميط الجيني PCR. قم بإجراء تفاعل التنميط الجيني PCR باستخدام الاشعال PCR المصمم الذي يحيط بدليل الحمض النووي الريبي خمسة مواقع رئيسية وثلاثة مواقع مستهدفة من الحمض النووي الريبي الرئيسي. قم بتشغيل تفاعل PCR في دورة حرارية باستخدام البرنامج المذكور في مخطوطة النص.
قم بتحميل منتجات PCR على هلام أغاروز 1٪ لتحليل الرحلان الكهربائي. استخراج الحمض النووي من شظايا PCR المعزولة من الحجم الجزيئي المتوقع للأنماط الجينية بالضربة القاضية. إعداد العينات لتسلسل الحمض النووي.
تحقق من نجاح تفاعل كريسبر وقم بإجراء تسلسل الحمض النووي لشظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل المعزولة لتحديد موقع انقسام Cas9 وتأكيد حذف موضع الحمض النووي الريبي الصغير. تم تصميم الحمض النووي الريبي كريسبر الفريد الذي استهدف منطقة مجموعة القواعد miR-888 التي يبلغ وزنها 35 كيلوجراما بالكامل. مجموعات عنقودية أصغر داخل عائلة miR-743 أو عائلة miR-891 بالإضافة إلى عمليات حذف الحمض النووي الريبي الصغير.
أشار تحليل الرحلان الكهربائي الهلامي لتفاعلات PCR إلى أن حجم جزء الحمض النووي المتوقع الذي يمثل النمط الوراثي بالضربة القاضية قد تم تضخيمه لكل عملية نقل كريسبر. تم تحديد النمط الجيني لمستعمرات الخلية الواحدة بواسطة PCR في تسلسل تم التحقق منه. أكد تسلسل الحمض النووي لهذه الشظايا المعزولة من تفاعل البوليميراز المتسلسل بالضربة القاضية أن الحمض النووي الريبي المنقول بخمسة من الحمض النووي الريبي الرئيسي والثالث الرئيسي وجهت ربط الانقسام Cas9 حوالي ثلاثة نيوكليوتيدات في المنبع من مواقع PAM والتحقق من صحة الفقدان الجينومي لموضع الحمض النووي الريبي الصغير المستهدف.
تؤكد اختبارات انتشار WST-1 التي تقارن بين MIR-891a بالضربة القاضية والخلايا البرية أن الإفراط في التعبير عن الحمض النووي الريبي الصغير يحاكي ناقل lentiviral يحفز نمو خلايا البروستاتا ، وبالتالي كان من المتوقع أن تظهر خسارة miR-891 تأثيرات متبادلة. إلى جانب تصميم الحمض النووي الريبي الموجه بعناية ، من المهم إنشاء مستعمرات أحادية الخلية بسرعة من خلال كل خط خروج موجه للحمض النووي الريبي الصغير. ومن المهم بشكل خاص إذا كانت الخلايا القاضية للحمض النووي الريبي الصغير قد قللت من نمو قابلية البقاء ويمكن التغلب عليها بسهولة في المجموعات المختلطة ذات الخلايا البرية.
يجب إجراء طرق إضافية مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي واللطخة الشمالية وتسلسل الحمض النووي الريبي للتأكد من أن خطوط خلايا الضربة القاضية CRISPR لا تعبر عن الحمض النووي الريبي الصغير الناضج للموضع المحذوف.
