Questo protocollo utilizza un flusso di lavoro di editing genetico CRISPR ad alto rendimento per sezionare molecolarmente i geni micro RNA organizzati e raggruppati di unità. E per determinare come queste reti di RNA non codificanti coordinano i percorsi di progressione del cancro. Questa procedura di modifica genetica CRISPR consente allo sperimentatore di generare rapidamente un intero pannello di linee cellulari che trasportano combinazioni uniche di delezione di cluster di micro RNA, evitando al contempo la lunga clonazione del vettore DNA.
Questo metodo fornirà una comprensione più chiara di come i micro RNA raggruppati funzionano in modo cooperativo per regolare la crescita tumorale, l'aggressività e la resistenza ai farmaci prima di tradurre i micro RNA nella clinica come strumenti terapeutici e diagnostici. A dimostrare la procedura sarà Grace Yi, un'assistente di ricerca nel mio laboratorio. Per iniziare, creare un file DNA contenente la sequenza genomica completa della regione del cluster di micro RNA di interesse in almeno un kilobyte di regioni genomiche circostanti utilizzando un programma software di annotazione della sequenza di DNA.
Successivamente, progettare quattro RNA CRISPR unici per ogni locus micro RNA mirato. Due RNA CRISPR progettati per colpire immediatamente sequenze di DNA complementari cinque primi del cluster di forcine micro RNA e due RNA CRISPR progettati per colpire immediatamente sequenze di DNA complementari tre primi del cluster di forcine micro RNA. Utilizzare uno strumento di modifica delle caratteristiche nel file DNA creato per contrassegnare la sequenza target del DNA per ogni RNA CRISPR progettato da sintetizzare.
Primer PCR progettati e sintetizzati che fiancheggiano le regioni di cluster di micro RNA mirate per la genotipizzazione di linee cellulari CRISPR. Eseguire una curva di concentrazione di doxiciclina su linee cellulari Cas9 inducibili da lenti di nuova generazione per determinare le condizioni ottimali per l'induzione della proteina Cas9. Piastra cinque volte 10 delle quarte cellule per pozzetto di ogni piastra a sei pozzetti e crescere a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica, nel mezzo preferito per 24 ore.
Diluire dox nel mezzo preferito con una curva di concentrazione finale di dox compresa tra 0 5100, 150, 250 e 500 nanogrammi per millilitro. Etichettare i pozzetti di ogni piastra a sei pozzetti seduti da uno a sei. Rimuovere il mezzo e sostituirlo con le concentrazioni di dox appropriate.
Coltiva le piastre da uno a quattro fino a 24 ore, 48 ore e 72 ore di induzione dox e 120 ore dopo il ritiro dox. Raccogli i pozzetti del piatto in ogni punto temporale. Elaborare i pellet cellulari e il tampone ripa per l'isolamento del lisato.
Eseguire l'analisi western blot con 40 microgrammi di proteine per misurare l'induzione della proteina Cas9 e determinare la concentrazione ottimale di Cas9. Sulla carta, mappare le cinque combinazioni di coppie di RNA CRISPR prime e tre prime che saranno transettate in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti mirata all'intero cluster di micro RNA, varie combinazioni di geni micro RNA raggruppati, nonché singoli membri del cluster di micro RNA. Placcare la linea di nove cellule inducibili a cinque volte 10 alla quarta cella per pozzetto di una piastra da 24 pozzetti nel mezzo preferito contenente la concentrazione di dox ottimizzata.
Coltiva le cellule per 24-48 ore a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per indurre l'espressione della proteina Cas9. Transfettare le cellule Cas9 inducibili lenti con cinque RNA guida primi e tre primi preparati. Etichettare quattro provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri per locus micro RNA mirato.
In ogni provetta, mescolare un rapporto molare di RNA tracciante e RNA CRISPR unici insieme per formare il complesso di RNA guida micromolare. Aggiungere 2,5 microlitri di RNA tracciante, 1,25 microlitri dei cinque RNA CRISPR posizionati in primo piano, 1,25 microlitri dei tre RNA CRISPR posizionati in primo piano e cinque microlitri di tampone tris hcl pH 7,5 da 10 millimolari a una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri. Microcentrifuga per 30 secondi a 16.000 volte G per miscelare.
Incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Ad ogni tubo a 40 microlitri di mezzo sierico ridotto ai 10 microlitri di reazione del complesso RNA guida. Mescolare delicatamente pipettando su e giù.
In una provetta da centrifuga pulita da 1,5 millilitri, mescolare delicatamente due microlitri del reagente di trasfezione e 48 microlitri di mezzo sierico ridotto mediante pipettaggio su e giù. Incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. A ciascuna provetta contenente i 50 microlitri di miscela di RNA guida, aggiungere i 50 microlitri del reagente di trasfezione diluito.
Pipettare lentamente la miscela su e giù una volta per mescolare. Incubare a temperatura ambiente per 20 minuti. Aggiungere 400 microlitri di terreno privo di antibiotici integrato con doxiciclina a ciascuna provetta contenente i 100 microlitri della miscela di trasfezione dell'RNA guida.
Pipettare delicatamente per mescolare. Rimuovere il mezzo dalle cellule Cas9 inducibili dalla doxiciclina indotte dalle lenti. Aggiungere 500 microlitri di mix di trasformazione dell'RNA guida doxiciclina media basato sulla mappa sperimentale della piastra a 24 pozzetti.
Incubare le cellule trasfettate per 48 ore a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%. Sostituire il mezzo con il mezzo preparato fresco senza doxiciclina. Consentire alle cellule di recuperare per altre 24-48 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
Raccogli le cellule trasfettate e preparati per la genotipizzazione e le delusioni a singola cellula. Separare i 150 microlitri di celle risospese in tre parti. Congelare un terzo delle cellule trasfettate in media più 10% DMSO in fiale criogeniche per la conservazione a lungo termine.
Trasferire un terzo delle cellule trasfettate in una provetta PCR pulita da 0,2 millilitri per la genotipizzazione. Preparare l'ultimo terzo delle cellule trasfettate per il conteggio e la diluizione in un formato a piastra a 96 pozzetti per generare colonie a singola cellula. Utilizzando un multi pipetter a 12 canali e un serbatoio di reagente sterile, aggiungere 100 microlitri di celle diluite per pozzetto a due file di piastra per ogni diluizione.
Lasciare da quattro a sei settimane affinché le cellule crescano fino alla cofluenza per l'espansione della colonia a singola cellula. Raccogliere circa 10-15 colonie monocellulari per la genotipizzazione. Identificare almeno tre linee indipendenti di colonie monocellulari knockout per ogni locus micro RNA mirato.
Mantenere le linee a cella singola di tipo wild come controlli. Risospendere il pellet cellulare in quattro microlitri di cinque tampone X DNA polimerasi, un microlitro di proteinasi K, un microlitro di RNasi A e acqua priva di nucleasi fino ad un volume totale di 20 microlitri. Pidocchi le cellule nel termo ciclatore a 56 gradi Celsius per 30 minuti e 96 gradi Celsius per cinque minuti.
Conservare i lisati cellulari a meno 20 gradi Celsius fino al momento della genotipizzazione PCR. Eseguire una reazione di genotipizzazione PCR utilizzando i primer PCR progettati che fiancheggiano i cinque siti mirati all'RNA guida e tre siti mirati all'RNA guida principale. Eseguire la reazione PCR in un termociclatore utilizzando il programma menzionato nel manoscritto testuale.
Caricare i prodotti PCR su un gel di agarosio all'1% per l'analisi dell'elettroforesi. Estrarre il DNA dai frammenti di PCR isolati della dimensione molecolare prevista per i genotipi knockout. Preparare i campioni per il sequenziamento del DNA.
Convalidare che la reazione CRISPR abbia avuto successo ed eseguire il sequenziamento del DNA dei frammenti di PCR isolati per identificare il sito di scissione Cas9 e confermare la delezione del locus del micro RNA. Sono stati progettati RNA CRISPR unici che hanno preso di mira l'intera regione del cluster miR-888 di 35 chili di basi. Combinazioni di cluster più piccole all'interno della famiglia miR-743 o della famiglia miR-891 e delezioni di micro RNA.
L'analisi dell'elettroforesi su gel delle reazioni PCR ha indicato che la dimensione prevista del frammento di DNA che rappresenta il genotipo knockout è stata amplificata per ogni trasfezione CRISPR. Le colonie monocellulari sono state genotipizzate mediante PCR in sequenza verificata. Il sequenziamento del DNA di questi frammenti isolati di knockout PCR ha confermato che i cinque RNA guida primi e tre primi trasfettati hanno diretto la legatura della scissione Cas9 di circa tre nucleotidi a monte dei siti PAM e hanno convalidato la perdita genomica del locus micro RNA mirato.
I saggi di proliferazione di WST-1 che confrontano le cellule knockout di miR-891a e wild type confermano che la sovraespressione del vettore lentivirale mimica micro RNA induce la crescita delle cellule prostatiche e quindi è stato previsto che la perdita di miR-891 avrebbe mostrato effetti reciproci. Oltre a un'attenta progettazione dell'RNA guida, è importante generare rapidamente colonie di singole cellule attraverso ogni linea di knockout del micro RNA. È particolarmente rilevante se le cellule knockout del micro RNA hanno una ridotta crescita di vitalità e sarebbero facilmente superate in popolazioni miste con cellule wild type.
Ulteriori metodi come la PCR quantitativa in tempo reale, il northern blot e il sequenziamento dell'RNA dovrebbero essere eseguiti per confermare che le linee cellulari knockout CRISPR non esprimono micro RNA maturo per il locus eliminato.
