Este protocolo usa um fluxo de trabalho de edição de genes CRISPR de alto rendimento para dissecar molecularmente micro genes de RNA organizados e agrupados. E para determinar como essas redes de RNA não codificadoras coordenam caminhos de progressão do câncer. Este procedimento de edição de genes CRISPR permite que o investigador gere rapidamente um painel inteiro de linhas celulares carregando combinações únicas de exclusão de cluster micro RNA, evitando a sub clonagem de subtoras de vetores de DNA demoradas.
Este método fornecerá uma compreensão mais clara de como as micro RNAs agrupadas funcionam cooperativamente para regular o crescimento do tumor, a agressividade e a resistência a medicamentos antes de traduzir micro RNAs para a clínica como ferramentas terapêuticas e diagnósticas. Demonstrando o procedimento estará Grace Yi, uma assistente de pesquisa no meu laboratório. Para começar, crie um arquivo de DNA contendo a sequência genômica completa da região de cluster micro RNA de interesse em pelo menos um quilobytes de regiões genômicas circundantes usando um programa de software de anotação de sequência de DNA.
Em seguida, projete quatro RNAs CRISPR exclusivos para cada lócus micro RNA direcionado. Duas RNAs CRISPR projetadas para atingir sequências de DNA complementares imediatamente cinco primos do cluster de grampos micro RNA e dois RNAs CRISPR projetados para atingir sequências de DNA complementar imediatamente três primos do micro RNA hairpin cluster. Use uma ferramenta de edição de recursos no arquivo de DNA criado para marcar a sequência de alvo de DNA para cada RNA CRISPR projetado para ser sintetizado.
Primers PCR projetados e sintetizados flanqueando as regiões de cluster micro RNA alvo para genotipagem de linhas celulares CRISPR. Realize uma curva de concentração de doxiciclina em linhas celulares indutíveis lenti indutíveis recém-geradas para determinar as condições ideais para a indução da proteína Cas9. Placa cinco vezes 10 das quatro células por poço de cada seis placas de poço e crescer a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono, no meio preferido por 24 horas.
Diluir dox no meio preferido com uma curva final de concentração de dox variando de 0 5100, 150, 250 a 500 nanogramas por mililitro. Rotule os poços de cada placa de seis poços de um a seis. Remova o meio e substitua com as concentrações de dox apropriadas.
Cresça de uma a quatro até 24 horas, 48 horas e 72 horas de indução dox e 120 horas após a retirada dox. Colher os poços da placa em cada ponto de tempo. Processe as pelotas celulares e o tampão ripa para isolamento de lise.
Realize a análise da mancha ocidental com 40 microgramas de proteína para medir a indução da proteína Cas9 e determinar a concentração ótima de Cas9. No papel, mapeie as cinco combinações principais e três principais do par de RNA CRISPR que serão transectadas em cada poço de uma placa de 24 poços visando todo o cluster micro RNA, várias combinações de genes micro RNA agrupados, bem como membros individuais de cluster micro RNA. Placa o lenti indutível fundir nove linhas celulares em cinco vezes 10 para as quatro células por poço de uma placa de 24 poços no meio preferido contendo a concentração otimizada dox.
Cresça as células por 24 a 48 horas a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono para induzir a expressão proteica Cas9. Transfeito as células Cas9 indutíveis lenti com um prime de cinco primos e três rnas guia principal. Rotule quatro tubos de micro centrífugas de 1,5 mililitro por lócus micro RNA direcionado.
Em cada tubo, misture uma razão molar de RNA rastreador e RNAs CRISPR exclusivos para formar o complexo RNA guia de dois micromolar. Adicione 2,5 microliters de RNA rastreador, 1,25 microlitres do RNA CRISPR 7,5 posição prime, 1,25 microliters dos três crispr RNA posicionados prime e cinco microliters de 10 tris de 10 milmolares hcl pH 7.5 tampão para um tubo de centrífugo de 1,5 mililitro. Micro centrífuga por 30 segundos a 16.000 vezes G para misturar.
Incubar em temperatura ambiente por cinco minutos. Para cada tubo a 40 microliters de meio soro reduzido para os 10 microliteres de reação complexa RNA guia. Misture suavemente por pipetting para cima e para baixo.
Em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro limpo, misturou dois microliters do reagente transfecção e 48 microliters de meio soro reduzido suavemente por tubulação para cima e para baixo. Incubar em temperatura ambiente por cinco minutos. A cada tubo contendo os 50 microliters da mistura guia de RNA, adicione os 50 microliters do reagente de transfecção diluído.
Pipete a mistura lentamente para cima e para baixo uma vez para misturar. Incubar em temperatura ambiente por 20 minutos. Adicione 400 microliters de meio livre de antibióticos complementados com doxiciclina em cada tubo contendo os 100 microliters da mistura de transfecção guia RNA.
Pipeta suavemente para misturar. Remova o meio das células cas9 induzidas por doxiciclina. Adicione 500 microliters de doxycycline de mídia guia RNA mistura de transformação com base no mapa experimental de placa de 24 poços.
Incubar as células transfeinadas por 48 horas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono. Substitua o meio pelo meio fresco preparado sem doxiciclina. Permita que as células se recuperem por mais 24 a 48 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Colher as células transfeinadas e preparar-se para genotipagem e delírios de células únicas. Separe os 150 microliters de células resuspended em três partes. Congele um terço das células transfeinadas em médio mais 10% DMSO em frascos criográficos para armazenamento a longo prazo.
Transfira um terço das células transfeminadas em um tubo PCR limpo de 0,2 mililitro para genotipagem. Prepare o último terço das células transfeinadas para contagem e diluição em um formato de placa de 96 poços para gerar colônias de células únicas. Usando uma tubulação multi-tubulação de 12 canais e um reservatório de reagente estéril, adicione 100 microliters de células diluídas por poço a duas fileiras da placa para cada diluição.
Permita que de quatro a seis semanas para as células cresçam para cofluência para a expansão de colônias de células únicas. Colete aproximadamente 10 a 15 colônias de células únicas para genotipagem. Identifique pelo menos três linhas independentes de colônia de células únicas para cada lócus micro RNA direcionado.
Mantenha linhas de células simples tipo selvagem como controles. Resuspend foi a pelota celular em quatro microlitradores de cinco tampão de polimerase de DNA X, um microliter de proteinase K, um microliter de RNase A, e água livre de nuclease até um volume total de 20 microlitadores. Piolhos as células do ciclo termo a 56 graus Celsius por 30 minutos e 96 graus Celsius por cinco minutos.
Armazene as células a menos 20 graus Celsius até estar pronta para genotipagem pcr. Execute uma reação de genotipagem PCR usando os primers PCR projetados que flanqueiam o guia RNA cinco principais e três principais guias RNA locais direcionados. Execute a reação do PCR em um termociclador usando o programa mencionado no manuscrito do texto.
Coloque os produtos PCR em um gel de 1% agarose para análise de eletroforese. Extrair DNA dos fragmentos isolados de PCR do tamanho molecular previsto para os genótipos de nocaute. Prepare as amostras para sequenciamento de DNA.
Valide que a reação CRISPR foi bem sucedida e realize o sequenciamento de DNA dos fragmentos de PCR isolados para identificar o local do decote Cas9 e confirmar a exclusão do lócus micro RNA. Foram projetados RNAs CRISPR exclusivos que tinham como alvo toda a região de cluster miR-888 de bases de 35 quilos. Combinações de clusters menores dentro da família miR-743 ou da família miR-891, bem como de supressões de micro RNA.
A análise da eletroforese gel das reações do PCR indicou que o tamanho do fragmento de DNA previsto representando o genótipo de nocaute foi amplificado para cada transfecção CRISPR. Colônias de células únicas foram genótipadas por PCR em sequência verificada. O sequenciamento de DNA desses fragmentos de PCR de nocaute isolado confirmou que os RNAs de cinco prime e três prime guide direcionaram a ligadura de decote Cas9 aproximadamente três nucleotídeos a montante dos locais pam e validaram a perda genômica do lócus micro RNA alvo.
Ensaios de proliferação WST-1 comparando células de nocaute e tipo selvagem do miR-891a confirmam que a superexpressão do micro RNA imita vetor lentiviral que induz o crescimento das células da próstata e, portanto, previu-se que o miR-891 uma perda mostraria efeitos recíprocos. Além do cuidadoso guia de design RNA, é importante gerar rapidamente colônias de células únicas através de cada linha de nocaute micro RNA. É especialmente relevante se as células de nocaute micro RNA tiverem reduzido o crescimento da viabilidade e seriam facilmente superadas em populações mistas com células do tipo selvagem.
Métodos adicionais como PCR quantitativo em tempo real, mancha norte e sequenciamento de RNA devem ser realizados para confirmar que as linhas de células knockout CRISPR não expressam micro RNA maduro para o lócus excluído.
