הפרוטוקול מקטין באופן משמעותי את מספר העתקת הדנ"א המיטוכונדריאלי בביצה. זה עשוי להועיל לשיבוט תוך-מיני. שיטה זו מפחיתה את מספרי העתקי הדנ"א המיטוכונדריאלי בביציות בקר ביותר מ-90%, מה שעשוי להפחית את שכיחות ההטרופלזמה המיטוכונדרית בעוברים משובטים.
לורה אדמס, דוקטורנטית מהמעבדה שלי, תדגים את ההליך. כדי להתחיל, באמצעות פיפטה, לאסוף את הביציות הבוגרות שנבחרו מטיפת HSOF, ולהניח אותן לתוך צינור 1.5 מיליליטר המכיל 50 מיקרוליטרים של תמיסת HSOF CB. צנטריפוגה את הביציות ב 15, 000 פעמים G במשך 12 דקות.
בזמן שהביציות עוברות צנטריפוגות, הכינו את צלחת הביזקציה. לשם כך, התחל על ידי יצירת תבנית על המכסה של צלחת פטרי 60 מילימטר באמצעות 20 מיקרוליטרים לכל טיפה, ולכסות את הטיפות באופן מלא בשמן מינרלי. באמצעות טוש דק עם קצה, סמנו את הקווים שמתחת לצלחת.
מכסים את המנה במכסה אטום עד להשלמת הצנטריפוגה כדי למנוע שינויים באוסמולאריות של מיקרו-טיפות. ברגע שהצנטריפוגה הושלמה, השתמשו בפיפטה של 200 מיקרוליטר כדי לאסוף את הביציות בתוך התמיסה, והעבירו אותן לחלק ריק של לוחית חיפוש חדשה עם ארבע, 400 טיפות HSOF מיקרוליטריות, לפני שטיפת הביציות באמצעות טיפות HSOF. הפעל את שלב החימום ל-38.5 מעלות צלזיוס.
השתמש בפיפטה בפה כדי להעביר את הביציות הצנטריפוגיות מטיפת HSOF לטיפה השמאלית העליונה T2 של צלחת הביזקציה. לאחר מכן לשטוף את הביציות דרך שלוש הטיפות הבאות בשורה העליונה. להפקיד את הביציות באחת מטיפות הפרונאז, תוך הבטחה שאין כמעט מגע ביניהן.
התבונן בביציות עד שיש דפורמציה ברורה של zonae pellucidae. ברגע שביצית בודדת zona pellucida התעוותה, העבירו את הביצית הזו לטיפה T2 השכנה. יש לחזור על הפעולה כאשר ביציות נוספות מתעוותות, עד שכל הביציות הוסרו מהפרונאז והונחו בטיפת T2.
התבונן בביציות עד שנותרה רק שכבה דקה של פלוצ'ידה. לשטוף את הביציות דרך שלוש הטיפות הבאות בתוך השורה, ולאחר מכן להפקיד אותם בקווים אנכיים בתוך טיפות CBT20. התחילו עם פחות ביציות בקווים האנכיים, והגדילו את מספר הביציות בכל טיפה ככל שכישורי הביסטיקה מתקדמים.
התמקדו בטיפת ה-CBT20 הראשונה, השמאלית ביותר, המכילה ביציות, והשתמשו בפיפטה בפה כדי לסובב את הביציות כך שהחלק הצפוף במיטוכונדריה של כל ביצית פונה לכיוון זרוע המיקרוסקופ או הרחק ממנה. הנח את קצה המיקרובלייד משמאל לביצית העליונה ביותר, בקו אחד עם החלל ישירות מעל החלק הצפוף במיטוכונדריה. תוך שמירה על קצה הלהב באותו מקום, הנמיכו בזהירות את הלהב כדי לחתוך עד הסוף דרך הביצית.
ודא כי האופלסט הצפוף במיטוכונדריה והאופלסט המוקטן של המיטוכונדריה הם בערך באותו גודל, והלהב חוצה את הקטע הברור ביותר של הביצית הצנטריפוגית. בעת הרמת הלהב, ודא כי אותו קו נשמר, וכי קצה הלהב נשאר באותו מקום, ולאחר מכן להרים בעדינות את הקצה מן הצלחת. חזור על שלבי בייסקציה עבור כל הביציות בתוך טיפת הביזקציה הראשונה.
אם ביציות נמצאות בטיפות נוספות, מכוונות וחותכות את הביציות הנותרות. באמצעות פיפטה בפה, אספו אופלסטים מופחתי מיטוכונדריה מהטיפה הראשונה של הביסקציה. מקם אותם בטיפת T20 השמאלית הממוקמת בשורה התחתונה של הצלחת.
יש לחזור על הפעולה עבור כל טיפות הביסציה הנותרות. באמצעות פיפטה בפה, לאסוף מיטוכונדריה צפופה ooplasts מן טיפת bisection הראשון. מקם אותם בטיפת T20 הימנית הממוקמת בשורה התחתונה של הצלחת.
יש לחזור על הפעולה עבור כל טיפות הביסציה הנותרות. שלפו את המנה T10 עם ארבע בארות מהחממה. באמצעות פיפטה בפה, העבירו את כל האופלסטים המופחתים במיטוכונדריה אל ה-MR המסומן היטב, והעבירו את האופלסטים הצפופים למיטוכונדריה אל הבאר המסומנת M.Place את צלחת ארבעת הבארות בחזרה לתוך האינקובטור הנשלט על ידי פחמן דו-חמצני.
אפשרו לאופלסטים לנוח לפחות 30 דקות לפני כימות ה-mtDNA. עבור ביזקציה מוצלחת, לדגימות מביציות שלמות ואופלסטים צפופי מיטוכונדריה יש ערכי CT דומים. לדגימות מאופלסטים מופחתי מיטוכונדריה יש ערכי CT גבוהים יותר בהשוואה לדגימות משתי הקבוצות האחרות.
עבור ביזקציה לא מוצלחת, הביזקציה אינה מפחיתה את תכולת ה-mtDNA ביעילות באופלסטים המופחתים במיטוכונדריה. בעקבות ייצור עקומה סטנדרטית ושימוש בנוסחאות מספר ההעתקה של mtDNA שסופקו, הושגה הפחתה ממוצעת של mtDNA בביציות של 93.88% באמצעות פרוטוקול זה. הכוונה נכונה של כל ביצית בטיפת הביסקציה, חיתוך מדויק של כל ביצית, ומיון מדויק של האופלסטים, הם כולם צעדים קריטיים שיש לנקוט על מנת להשיג תוצאות מוצלחות.
ניתן למזג שני אופלסטים עם תא סומטי אחד. לאחר מכן ניתן להפעיל את השלשות שהתמזגו כימית ולתרבת אותן כעוברים משוחזרים.
