ריצוף גנום שלם, WGS, יכול לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום עמידות מיקרוביאלית באמצעות חקירת גנום וזיהוי מנגנונים מולקולריים העומדים בבסיס פנוטיפ העמידות האנטי-מיקרוביאלית. ריצוף הגנום העולמי משפר את חקר הדנ"א, דנ"א חיידקי בקנה מידה גדול, ומקל על אפיון מעמיק של מיקרובים בריצה אחת הכוללת גרסאות פתוגניות הקשורות זו לזו. ריצוף הדור הבא מספק זיהוי ואפיון מהירים של מיקרואורגניזמים ופרופיל העמידות האנטי-מיקרוביאלית שלהם בהתחשב בכלי לאבחון, טיפול, מעקב ומעקב אחר מקורות של פתוגנים בהקשר הקליני.
מתודולוגיות ריצוף מהדור הבא יכולות למלא תפקיד מכריע במעקב ומעקב אחר מקורות של פתוגנים לא רק בהקשר הקליני אלא גם בסביבה הסביבתית וחשוב מכך בבטיחות המזון. נכון לעכשיו, זו לא טכניקה שגרתית. ואכן, קצת מההליך כולו יקל על ההבנה עד כמה הם מבצעים את הניסוי בהצלחה.
מי שתדגים את הנוהל תהיה ג'וליסה אנסיו-איבארה, טכנאית הגנומיקה של קבוצת העבודה שלנו. לאחר חילוץ וכימות DNA חיידקי להוסיף 2.5 microliters של מאגר תגמנטציה. שני מיקרוליטרים של קלט G D N A בצינור 0.2 מיליליטר ומערבבים על ידי פיפטינג.
מוסיפים מיקרוליטר אחד של מאגר הגברה ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב. ואז לסובב את הצינור ב 280 G במשך דקה אחת. מניחים את הדגימות בתרמוציקלר בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, ולאחר מכן מחזיקים בטמפרטורה של 10 מעלות צלזיוס.
מוסיפים מיקרוליטר אחד של חיץ מנטרל לצינורות הדגימה ומערבבים בעדינות על ידי פיפטציה. סובבו את הצינור ודגרו במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסף 1.7 מיקרוליטר של כל מתאם אינדקס ושלושה מיקרוליטרים של אינדקס PCR מאסטר תערובת.
לאחר ערבוב הרכיבים, סובבו כלפי מטה ב-280 גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. מניחים את הדגימות בתרמוציקלר ומבצעים תגובת PCR שנייה כמתואר בכתב היד. עכשיו לערבב את פתרון החרוז המגנטי המסחרי על ידי מערבולת.
בהתאם להנחיות היצרן. העבירו את דגימת G D N A המתויגת או האינדקס לצינור חדש של חמישה מיליליטר והוסיפו 0.6 מיקרוליטרים של חרוזים מגנטיים עבור כל מיקרוליטר של הנפח הסופי של דגימת G D N A. מערבבים את הרכיבים בעדינות על ידי צנרת ודוגרים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
הניחו את צינורות הדגימה על מתלה מגנטי למשך שתי דקות עד שהסופרנטנט יתנקה. השליכו בזהירות את החרוזים מבלי להפריע לחרוזים. לאחר מכן להוסיף 200 microliters של מוכן טרי 80% אתנול ללא ערבוב.
דוגרים במשך 30 שניות עד שהאלואיט מתנקה ומסירים בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לחרוזים. חזור על הליך זה ויבש באוויר את החרוזים במשך 10 דקות. כעת הוסיפו 15 מיקרוליטרים של 10 מילימולר טריס בופר לחרוזים מעורבבים בעדינות על ידי פיפטינג ודגרה במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר.
הניחו את צינורות הדגימה על המדף המגנטי למשך שתי דקות כדי לאפשר לסופר-נטנט להתנקות. לאחר מכן, העבירו בזהירות 14 מיקרוליטרים של הסופרנטנט מצינור הדגימה לצינור חדש של 0.2 מיליליטר וניקו את הספרייה. הפשיר את מחסנית הריאגנט בהתאם להוראות היצרן.
משוך חמישה מיקרוליטרים של הספרייה המנורמלת לתוך צינור נמוך של 1.5 מיליליטר ודלל את הספרייה המאוגדת בארבעה ננומולרים בנפח המתאים של RSB. לאחר מכן הוסיפו חמישה מיקרוליטרים כל אחד מהספרייה המאוגדת ו-0.2 נתרן הידרוקסיד רגיל בצינור חדש נמוך, 1.5 מיליליטר. כדי לפרק את הספרייה המאוגדת לגדילים בודדים, ערבבו את הצינור על ידי מערבולת.
יש לסובב במשך דקה אחת ולדגור במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. כעת הוסיפו 10 מיקרוליטרים של ספריית המאגר המפורק 990 מיקרוליטרים של חיץ הכלאה מקורר מראש וערבבו בעדינות על ידי פיפטה. מניחים את הצינור על קרח עד לביצוע הדילול הסופי לטעינת הרצף.
יוצקים ומכינים ספריית בקרה בריכוז של ארבעה ננומולרים על ידי ערבוב שני מיקרוליטרים של ספריית הבקרה ושלושה מיקרוליטרים של מים נטולי נוקלאז. לאחר מכן מוסיפים חמישה מיקרוליטרים כל אחד מספריית הבקרה ומוכנים טריים 0.2 נתרן הידרוקסיד רגיל. נטרול ספריית הבקרה לגדילים בודדים כפי שהודגם קודם לכן.
ערבבו בעדינות 10 מיקרוליטרים של ספריית בקרה שעברה דנטורציה ו-990 מיקרוליטרים של חיץ הכלאה מקורר מראש על ידי פיפטציה, והניחו אותו על קרח עד לסיום הדילול הסופי לטעינת רצף. בכריכה נמוכה חדשה, שפופרת של 1.5 מיליליטר, יש לשלב 594 מיקרוליטרים של ספריית המאגר המפורק ושישה מיקרוליטרים של ספריית הבקרה המנוטרלת. מערבבים כראוי ומדללים את תערובת הספרייה הסופית לריכוז העמסה סופי של 1.2 טוחנת פקו בנפח של 600 מיקרוליטר באמצעות חיץ הכלאה מקורר מראש.
לפני טעינת תערובת הספרייה הסופית על מחסנית הריאגנט, בצע טיפול תרמי נוסף כדי להשיג העמסה יעילה לתוך תא הזרימה. מדגרים את תערובת הספרייה הסופית במשך שתי דקות בטמפרטורה של 96 מעלות צלזיוס. הפוך את הצינור כדי לערבב ולהניח את הצינור על קרח במשך חמש דקות.
טען 500 מיקרוליטרים של תערובת הספרייה הסופית לתוך מאגר העיצוב על מחסנית מגיב. לאחר הפעלת הרצף טען את מחסנית הריאגנט, את תא הזרימה והגדר את ריצת הרצף. לניתוח נתונים, התחבר לשרת נתוני הרצף והורד את קבצי FASTQ.
הערך את האיכות הראשונית של נתוני רצף גולמיים באמצעות תוכנת צד שלישי. הסר רצפי מתאמים שרידים, בסיסים באיכות נמוכה וקריאות קצרות מנתוני הרצף הגולמיים. הרכיבו את נתוני הריצוף של בדיקת האיכות לרמת contig או פיגומים באמצעות תוכנת צד שלישי.
בצע ביאור גנום על-ידי שליחת קובץ Phaster המכיל את הגנום המורכב לשרת RAST. העלה את קובץ Phaster למרכז לאפידמיולוגיה של הגנום ולפלטפורמות האינטרנט של קלרמונט כדי לזהות תכונות אפידמיולוגיות. ARGS, VAGS ופלסמידים.
העלה את קובץ Phaster לשרת Phaster כדי לזהות רצפי נבואה. ביאור הגנום גילה 5, 633 תכונות מקודדות מתוכן 5, 524 הן גנים לציפוי חלבונים ו-109 הן רצפים הקשורים ל-RNA. זן Escherichia coli החזוי שייך לקבוצה פילו B 1 ולרצף מסוג 40.
דטרמיננטה של עמידות מיקרוביאלית, הגן M D F A המקודד עבור משאבת שטף רב-תרופתית רחבת טווח זוהתה. כמו כן זוהו גנים המקודדים לאנטרוטוקסין יציב חום חלבון עמידות בסרום ומערכת הפרשה מסוג 3 יחד עם חלבוני האפקטים המופרשים שלו. רצפי הקידוד מקובצים לאוספים של חלבונים הקשורים תפקודית הנקראים תת-מערכות, במיוחד אלה הממלאים תפקידים פונקציונליים בפחמימות, חלבונים, חומצות אמינו ומטבוליזם נגזרת והובלת ממברנות.
שיטות מעבדה טובות הן בסיסיות באמצעות כל הפרוטוקול. עם זאת, יש לנקוט בזהירות מיוחדת בעת עיבוד דגימות מרובות במהלך הכנת ספריית הדנ"א החתכיתית כדי למנוע זיהום צולב.
