תודה למיכאלה אולם, לריסה Bispo וגוסטבו Tavares לקבלת סיוע טכני.

מוצרי מזון שנאכלים טרי או מבושל קל הם של רוב הדאגה לבריאות אדם. דוגמאות כוללות ירקות סלט, פירות, צדפות וסרטנים. אוסף 1. לדוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף דגימות בתנאים שלמזער זיהום, ומאוחסן בשקיות נפרדות, נקיות במהלך הובלה. לאחר שנאסף, יש לאחסן דגימות ב 4 מעלות צלזיוס ומעובדות בתוך 24 שעות. </li></ol> 2. מועשרת תרבות הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פירות וירקות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כ -10 גרם של חומר בשקית ניילון עמידה. אם עיבוד חומר גדול יותר, להתרכז בעור של הפרי או ירק. להוסיף 90 מיליליטר 0.1 M חיץ נתרן פוספט, pH 7.0 ותהליך בבלנדר ההנעה למשך 30 שניות. לחלופין, החומר יכול להיות נסער באופן ידני אם בלנדר ההנעה אינו זמין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הנוזל לתוך שני צינורות 50 מיליליטר פלקון. צנטריפוגה צינורות ב 4000 XG במשך 7 דקות לחיידקים גלולה. </l<html> i&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את supernatant ולהשעות את חיידקי pelleted ב 30 מיליליטר של מרק סטרילי וריא Bertani (LB). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על O ייקר / N, מחזיק צינור אחד של 25 מעלות צלזיוס ואחרת על 37 מעלות צלזיוס. צריכה להיות מזועזעות תרבויות ב 200 תנודות לדקה (OPM). תרבויות חנות ב 4 מעלות צלזיוס עד נדרשות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פירות ים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הבטן (צדפות) או מערכת עיכול (סרטנים) באמצעות מלקחיים ופינצטה סטרילי ומקום לתוך צינור 1.5 מיליליטר סטרילי המכיל 200 μl של 0.1 חיץ פוספט M נתרן, pH 7.0. מרוך המדגם ליצור homogenate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 5 מיליליטר של מרק LB לשני 5 מיליליטר צינורות סטרילי, ולחסן כל עם homogenate פירות הים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על O ייקר / N, מחזיקה צינור אחד של 25 מעלות צלזיוס ומעלות צלזיוס 37 אחרים. צריכה להיות מזועזעות תרבויות ב 200 OPM. תרבויות חנות ב 4 מעלות צלזיוס עד נדרשות. </li></ol></li></ol> 3. תרבויות הקרנה לIntegrons = &quot;Jove_content&quot;&gt; הערה: פרוטוקולי PCR רגילים נמצאים בשימוש במתודולוגיה זו, באמצעות מאגרים מסופקים עם האנזים, וMgCl 2 ריכוז סופי של 2.5 מ&quot;מ. במידת הצורך, לורנץ (2011) 24 התוו שיטות אופטימיזציה ופתרון בעיות PCR בנושא קודם של כתב עת זה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת DNA מבושל: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר תרבות המועשרת 100 μl לתוך צינור PCR 0.5 מיליליטר סטרילי. מחממים את המדגם 99 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, שימוש באמבט מים או גוש חום. הצמד מקרר על קרח למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microcentrifuge 14,000 XG במשך 5 דקות עד גלולה פסולת תא. חזור לקרח. אפשר להקפיא דגימות DNA ב -20 ° C עד נדרשות, אבל חייב להיות מופשרים על קרח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקרנה לintegrons הכיתה 1 באמצעות PCR: הערה: תרבויות מעורבות מO הדגירה / N מוקרנות על integrons הכיתה 1 באמצעות פרוטוקול HS463a / HS464 PCR (טבלת 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את כל חומרים כימיים PCR על קרח, הרחק מכל סו פוטנציאל<html> rces של זיהום DNA. איפור mastermix PCR 48 μl לדגימה, לרבות בקרות שליליות (טבלה 2). לוותר 48 μl של תמהיל אב PCR לכל צינור, באמצעות טיפים מחסום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μl של DNA המופשר לצינורות PCR בודדים באמצעות טיפים מחסום. הפעל תכנית מתאימה בthermocycler PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך את התוצאות של ההגברה, electrophorese 7 μl של מוצר ה- PCR על ג&#39;ל agarose 2% שפך ולהפעיל במאגר TBE (90 מ&quot;מ טריס-borate, 2 מ&quot;מ EDTA). כולל סמן משקל מולקולרי, כגון סולם 100 נ&quot;ב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההודעה כתם ג&#39;ל עם כתם DNA, ולדמיין באמצעות transilluminator UV. בדוק שלא חלה הגברה בבקרה השלילית. להקה חזקה בסביבות 470 נ&quot;ב לכל מדגם מסוים מצביעה על כך שהתרבות המעורבת מכילה חיידקים הנושאים integron כיתת 1. מושבות טהורות עכשיו תהיינה מבודדות מכל תרבות מעורבת שחזרה PCR חיובי. </li></ol></li></ol>&gt; 4. הקרנת יחידה המושבות לIntegrons Class 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דילולים סידוריים וצלחות התפשטות: הערה: כדי לבודד מושבות אחת מהתרבויות המעורבות PCR החיובי, התרבות המעורבת היא בדילול סדרתי של פי 10 בחיץ פוספט נתרן, ולאחר מכן מצופה להתאושש מושבות אחת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של תרבות המעורבת עד 9 מיליליטר של חיץ פוספט 0.1 M נתרן, pH 7.0 ומערבבים על ידי היפוך. הוסף 1 מיליליטר של הדילול ל9 מיליליטר נוסף של חיץ פוספט, וחזור עד דילול סדרתי של 10 -8 הוא הגיע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התפשטות 10 -4 עד 10 -8 דילולים על אגר LB 100 μl, בשני עותקים. דגירה הצלחות O / N באותה הטמפרטורה המשמשת לתרבות המעורבת הראשונית. אז יכולות להיות מאוחסנות צלחות על 4 מעלות צלזיוס עד נדרשים, אולם עדיף לעבד את המושבות אחת למדי מייד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחירה יחידה מושבה והכנת DNA מבושלת: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק מושבות אחת מהצלחות דילול סדרתי, selecting סוגי מושבה שונים רבים ככל האפשר, תוך שימוש בקריטריונים כגון גודל מושבה, צורה וצבע. השתמש קיסמי סטרילי כדי לבחור מושבות אחת מצלחת ההתפשטות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגעת בקיסם למושבה, ולאחר מכן להעביר לתוך צינור PCR המכיל מים סטריליים 100 μl. אם מספר גדול של מושבות הם שיוקרנו, אז יכולות להיות מוכנות מושבות במגש microtiter. ספין הקיסם בין האצבעות כדי לסלק חלק מהתאים אל תוך המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש באותו הקיסם, לחסן צלחת LB עם פס של המושבה. מספר גדול של מושבות ניתן לאחסן על צלחות שכותרתו אם כל פס ארוך על 1 סנטימטר. חזור על שלבי 1 עד 3 עד שבחרת מספר מתאים של מבודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה O צלחות LB / N, באותה הטמפרטורה כמו שמשמש לתרבות המועשרת הראשונית. אז יכולות להיות מאוחסנות תרבויות על 4 מעלות צלזיוס עד נדרשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכנת דנ&quot;א מהשעיות חיידקים, בצע את השלבים כמו outlined בסעיף 3.1. להקרנה של lysates התרבות הטהור, לבצע HS463a / HS464 PCR כפי שתואר בסעיף 3.2. מבודד שתחזור PCR חיובי ישמש להכנת דנ&quot;א גנומי (סעיף 5), ולניתוחים נוספים. </li></ol></li></ol> 5. מושבות האחת הגנום הפקת DNA של Integron חיובי שימוש ביד הכאת 25 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 5 מיליליטר של מרק LB עם מדגם של התרבות הטהורה מבודדת בסעיף 4.2. דגירה O / N, רועדת באותה הטמפרטורה ששימשה לתרבות המועשרת הראשונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים גלולה ב 4000 XG במשך 7 דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant. Resuspend תאי pelleted ב 1 מיליליטר פתרון CLS-TC בצינור הכנה מהירה lysing מטריקס E. שימוש במכונת מכות חרוז, לעבד את המדגם על 5.5 מ &#39;/ שנייה למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור צנטריפוגה ב 14,000 XG במשך 5 דקות ולהתאושש 700 μl של supernatant לתוך צינור 1.5 מיליליטר סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 700 μl של מטריצה ​​מחייבת דילול 1: 5 עם 6 גואן Midinium thiocyanate ומערבבים על RT במשך 5 דקות. צנטריפוגה ב 14,000 XG דקות 1, supernatant פסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 800 לשטוף μl אתנול מלח (70% אתנול, 0.1 נתרן אצטט M) ומערבולת עד גלולה היא resuspended באופן מלא. שטוף במשך 5 דקות ב RT, צנטריפוגות ב 14,000 XG דקות 1 ולהשליך supernatant. להבטיח את כל supernatant הוסר, באמצעות micropipette במידת צורך, ולאחר מכן לאפשר לאוויר יבש במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend מטריצת גלולה ב200 μl TE (10 מ&quot;מ טריס HCl, 1 המ&quot;מ EDTA, pH 7.6) על ידי pipetting למעלה ולמטה. לדגור על RT במשך 3 דקות. צנטריפוגה ב 14,000 XG במשך 3 דקות והעברה 160 μl של ה- DNA eluted לתוך צינור סטרילי. הפעל aliquot של מיצוי DNA הגנומי על 2% w / ג&#39;ל agarose נ &#39;כדי לבדוק את התשואה ויושרה של מיצוי DNA. הדנ&quot;א הגנומי המטוהר מאוחסן ב -20 ° C והפשרה על קרח בעת צורך לבדיקת PCR. </li></ol> 6. PCRs אבחון ורצפי DNA הערה:הדנ&quot;א הגנומי מוכן בסעיף 5 ישמש לכל PCRs האבחון, וכדי לאשר את הבדיקה החיובית לintegrons 1 הכיתה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר הדנ&quot;א הגנומי על קרח, בקצרה מערבולת דגימת DNA וספין דופק ב14,000 XG במשך 20 שניות. חזור על PCR לגן integron-אינטגראז כיתת 1 באמצעות HS463a / HS464 (טבלה 1), המאשר כי לבודד הוא חיובי עבור amplicon 471 נ&quot;ב (סעיף 3.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי של תרבויות חיוביות לרמת מין מושגת על ידי ניתוח של גן rRNA המקטע הקטן (16S rDNA). להגביר את גן 16S באמצעות f27 פריימרים / r1492 (טבלת 1). בדקו את מוצרי ה- PCR באמצעות אלקטרופורזה. כל היעדים בקטריאלי צריכים ליצור amplicon 16S של כ 1,450 נקודות בסיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף amplicon גן 16S rRNA כדי לקבוע את זהות מינים, אבל כן יש סיכוי להיות PCRs החיובי מרובה מצעד 6.2, ורבים מאלה תוצאות חיוביות יהיו זהים מיני חיידקים, אנו להבחין מינים שונים ראשון usinעיכול הגבלת גרם של מוצר 16S PCR. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכל aliquot של 16S PCR עם אנזים ההגבלה 1 Hinf. כל אנזים שמכיר אתרי מחשוף 4 נ&quot;ב יעשו, אבל 1 Hinf מייצר מגוון טוב ממטרות 16S, והוא אנזים אמין, זול. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת הגבלת 30 μl לעכל mastermix (טבלה 2) בצינור סטרילי ולהוסיף 20 μl של מוצר 16S PCR-purfied האו&quot;ם. דגירה בO אמבט המים 37 מעלות צלזיוס / N. בדוק את התקציר על 2% agarose ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציון דפוסי העיכול מיוצרים על ידי 1 Hinf. מבודד עם אותו פרופיל הגבלת 16S עשויים להיות אותו המין. במקום רצף כל מוצר 16S PCR, רצף לכל היותר שלושה נציגים של כל דפוס הגבלה Hinf 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את מוצרי 16S PCR באמצעות ערכה מסחרית. ניתן להשתמש בערכת exonuclease חד גדילים, אך מבוססת עמודה או שיטות ממטרים גם לעבוד היטב כדי להסיר unincפריימרים orporated וDNAs חד גדילים. רצף amplicons 16S באמצעות R910 פריימר (טבלת 1), הגדרת התגובות כמו שצוינה על ידי מתקן הרצף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ברצף ה- DNA וכתוצאה מכך לחקור את בסיס הנתונים DNA צמח השדה עם פונקצית blastn <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi" target="_blank">(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).</a> זהות נוקלאוטיד יותר מ 97% נלקחת בדרך כלל כזהות מינים. </li></ol> 7. מיפוי ואפיון של מערכי Integrons והקלטת הערה: Class integrons 1 נובע ממערכות אקולוגיות הנשלט אדם צפוי להיות integrons הנפוץ ביותר בכל דוגמאות שלך. יש כל integrons אלה מקור יחיד אחרונים, ויש לי רצף ה- DNA השמור ביותר 5 לכן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבחין בין מעמד integrons 1 נובע ממקורות אנושיים ואלה המתרחשים באופן טבעי בדגימות סביבתיות על ידי ביצועPCR עם פריימר להגדיר intI1F165 / intI1R476 10 (טבלה 1). הערה: Class integrons 1 מחיידקים קליניים או commensal יפיק מוצר נ&quot;ב ~ 300, ואילו ברמה סביבתית 1 integrons לא יניב כל מוצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפיין את integrons הקליני על ידי הגברת מערך הקלטת עם סט פריימר HS458 / HS459. זה PCR יהיה להגביר את האזור בין intI1 וקטע המשומר &#39;3 בתחנה הסופית של רוב מערכי קלטת. מכיוון שהמספר והזהות של קלטות הוא משתנה, בגודל של מוצר ה- PCR גם להשתנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר amplicons ורצף ה- DNA באמצעות כל אחד מצבעי יסוד ההגברה. השתמש רצפים לחקור מאגרי DNA באמצעות פונקצית blastn <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi" target="_blank">(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שיום של קלטות מעקב מינוח תקני 9, מאז תצהירי נתונים רבים לקלטת גן integronים להשתמש בשמות עולים בקנה אחד או דו-משמעיים. תן תשומת לב מיוחדת לקלטות גן רומן, שכן אלה עלולים לקודד פנוטיפים חדשים, כוללים גנים המעניקים יכולת העברה מוגברת, פתוגניות או אלימות 8,21. הערה: פרה-קלינית צורות של integron כיתת 1 עדיין להסתובב בסביבה טבעית. בפרט, אלה שצמודים לTn 402 transposons הפעיל הם המעניין ביותר 26. מערכי הקלטת של integrons אלה לא להגביר עם סט פריימר HS458 / HS459, אבל יכולים להיות מוגבר עם סט פריימר MRG284 / MRG285 (טבלת 1), שהניבו amplicons של גודל המשתנה תלוי על תוכן קלטת. צריכים להיות מטוהרים מוצרי ה- PCR ו- DNA רצף כפי שמתואר ב7.2. </li></ol>

<ol>
	<li>Bush, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tackling+antibiotic+resistance.">Tackling antibiotic resistance.</a> Nature Rev. Microbiol. 9, 894-896 (2011).</li><li>Davies, J., Davies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+evolution+of+antibiotic+resistance.">Origins and evolution of antibiotic resistance.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (3), 417-433 (2010).</li><li>Costa, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+is+ancient.">Antibiotic resistance is ancient.</a> Nature. 477 (7365), 457-461 (2011).</li><li>Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+consequences+of+antibiotic+use+for+the+resistome,+mobilome+and+microbial+pangenome.">Evolutionary consequences of antibiotic use for the resistome, mobilome and microbial pangenome.</a> Front. Microbiol. 4, 4 (2013).</li><li>Gillings, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+class+1+integrons+and+the+rise+of+antibiotic+resistance.">The evolution of class 1 integrons and the rise of antibiotic resistance.</a> J. Bacteriol. 190 (14), 5095-5100 (2008).</li><li>Brassard, S., Lapointe, J., Roy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+relative+strength+of+tandem+promoters+for+the+antibiotic-resistance+genes+of+several+integrons.">Diversity and relative strength of tandem promoters for the antibiotic-resistance genes of several integrons.</a> Gene. 142 (1), 49-54 (1994).</li><li>Partridge, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+the+attI1+site+of+class+1+integrons.">Definition of the attI1 site of class 1 integrons.</a> Microbiol. 146 (11), 2855-2864 (2000).</li><li>Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrons:+Past,+Present,+and+Future.">Integrons: Past, Present, and Future.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 78 (2), 257-277 (2014).</li><li>Partridge, S. R., Tsafnat, G., Coiera, E., Iredell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+cassettes+and+cassette+arrays+in+mobile+resistance+integrons.">Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons.</a> FEMS Microbiol. Rev. 33 (4), 757-784 (2009).</li><li>Gillings, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+class+1+integron-integrase+gene+as+a+proxy+for+anthropogenic+pollution.">Using the class 1 integron-integrase gene as a proxy for anthropogenic pollution.</a> ISME J. In press, (2014).</li><li>Gaze, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impacts+of+anthropogenic+activity+on+the+ecology+of+class+1+integrons+and+integron-associated+genes+in+the+environment.">Impacts of anthropogenic activity on the ecology of class 1 integrons and integron-associated genes in the environment.</a> ISME J. 5, 1253-1261 (2011).</li><li>Gerzova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microbiota+composition+and+presence+of+selected+antibiotic+resistance+genes+in+carriage+water+of+ornamental+fish.">Characterization of microbiota composition and presence of selected antibiotic resistance genes in carriage water of ornamental fish.</a> PLoS ONE. 9, e103865 (2014).</li><li>Power, M., Emery, S., Gillings, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Into+the+wild:+dissemination+of+antibiotic+resistance+determinants+via+a+species+recovery+program.">Into the wild: dissemination of antibiotic resistance determinants via a species recovery program.</a> PLoS ONE. 8, e63017 (2013).</li><li>Stokes, H. W., Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+flow,+mobile+genetic+elements+and+the+recruitment+of+antibiotic+resistance+genes+into+Gram-negative+pathogens.">Gene flow, mobile genetic elements and the recruitment of antibiotic resistance genes into Gram-negative pathogens.</a> FEMS Microbiol. Rev. 35 (5), 790-819 (2011).</li><li>Moura, A., Oliveira, C., Henriques, I., Smalla, K., Correia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+diversity+of+conjugative+plasmids+in+integron-carrying+bacteria+from+wastewater+environments.">Broad diversity of conjugative plasmids in integron-carrying bacteria from wastewater environments.</a> FEMS Microbiol. Lett. 330 (2), 157-164 (2012).</li><li>Schl&#252;ter, A., Krause, L., Szczepanowski, R., Goesmann, A., P&#252;hler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+diversity+and+composition+of+a+plasmid+metagenome+from+a+wastewater+treatment+plant.">Genetic diversity and composition of a plasmid metagenome from a wastewater treatment plant.</a> J. Biotech. 136 (1-2), 65-76 (2008).</li><li>Taylor, N. G. H., Verner-Jeffreys, D. W., Baker-Austin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquatic+systems:+maintaining,+mixing+and+mobilising+antimicrobial+resistance.">Aquatic systems: maintaining, mixing and mobilising antimicrobial resistance.</a> TREE. 26 (6), 278-284 (2011).</li><li>Stalder, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+qualitative+impact+of+hospital+effluent+on+dissemination+of+the+integron+pool.">Quantitative and qualitative impact of hospital effluent on dissemination of the integron pool.</a> ISME J. 8, 768-777 (2014).</li><li>Allen, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Call+of+the+wild:+antibiotic+resistance+genes+in+natural+environments.">Call of the wild: antibiotic resistance genes in natural environments.</a> Nature Rev. Microbiol. 8, 251-259 (2010).</li><li>Wellington, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+natural+environment+in+the+emergence+of+antibiotic+resistance+in+Gram-negative+bacteria.">The role of the natural environment in the emergence of antibiotic resistance in Gram-negative bacteria.</a> Lancet Infect. Dis. 13 (2), 155-165 (2013).</li><li>Gillings, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobilization+of+a+Tn402-like+class+1+integron+with+a+novel+cassette+array+via+flanking+miniature+inverted-repeat+transposable+element-like+structures.">Mobilization of a Tn402-like class 1 integron with a novel cassette array via flanking miniature inverted-repeat transposable element-like structures.</a> Appl. Env. Microbiol. 75 (18), 6002-6004 (2009).</li><li>Graham, D. W., Collignon, P., Davies, J., Larsson, D. J., Snape, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Underappreciated+role+of+regionally+poor+water+quality+on+globally+increasing+antibiotic+resistance.">Underappreciated role of regionally poor water quality on globally increasing antibiotic resistance.</a> Env. Sci. Technol. 48 (20), 11746-11747 (2014).</li><li>Perry, J. A., Westman, E. L., Wright, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibiotic+resistome:+what's+new.">The antibiotic resistome: what's new.</a> Curr. Opinion Microbiol. 21, 45-50 (2014).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J. Vis. Exp. 63, e3998-e3998 (2011).</li><li>Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Extraction+of+PCR-Competent+DNA+from+Recalcitrant+Environmental+Samples.">Rapid Extraction of PCR-Competent DNA from Recalcitrant Environmental Samples.</a> Env. Microbiol. 1096, 17-23 (2014).</li><li>Sajjad, A., Holley, M. P., Labbate, M., Stokes, H., Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+class+1+integron+with+a+complete+Tn402-like+transposition+module.">Preclinical class 1 integron with a complete Tn402-like transposition module.</a> Appl. Env. Microbiol. 77 (1), 335-337 (2011).</li><li>Wright, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+in+the+environment:+A+link+to+the+clinic.">Antibiotic resistance in the environment: A link to the clinic.</a> Curr. Opinion Microbiol. 13 (5), 589-594 (2010).</li><li>Stokes, H., Nesbo, C., Holley, M., Bahl, M., Gillings, M., Boucher, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Class+1+integrons+predating+the+association+with+Tn402.-like+transposition+genes+are+present+in+a+sediment+microbial+community.">Class 1 integrons predating the association with Tn402.-like transposition genes are present in a sediment microbial community.</a> Journal of Bacteriology. 188, 5722-5730 (2006).</li><li>Lane, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. , 115-175 (1991).</li><li>Holmes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination+activity+of+a+distinctive+integron-gene+cassette+system+associated+with+stutzeri.+populations+in+soil.">Recombination activity of a distinctive integron-gene cassette system associated with stutzeri. populations in soil.</a> Journal of Bacteriology. 185, 918-928 (2003).</li></ol>

המחברים אין רלוונטי לגילוי.

זיהוי של integrons וקלטות הגן הקשור הוא פוטנציאל צעד מפתח בניבוי הופעתה של פתוגנים אופורטוניסטיים חדשים, מעקב מסלולים לפתוגנים לשרשרת מזון האנושי, וזיהוי התנגדות חדשה וארסי גורמים מכתיבים 8,21,26. מטרת מאמר זה הייתה לתאר גישה יעילה לסינון דגימות לintegrons 1 הכיתה, אפיון מ...

גילוי האנטיביוטיקה היה אחד ההישגים המדעיים הגדולים ביותר של המאה ה -20. עם זאת, השימוש וניצול לרעה של אנטיביוטיקה הוביל להתפתחות המהירה של חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה, ואלה עכשיו מהווים איום רציני לבריאות ציבור במאה ה -21. העלייה של זני חיידקים עמידים למרבית אפשרויות הטיפול מעלה את האפשרות שאנו נכנסים לעידן שבו תרופות נגד חיידקים כבר לא יעילות 1,2. המכונות הגנטיות שמקנות עמידות לאנטיביוטיקה היא מערכת עתיקה, מקדימים בני אדם ולחצי בחירה אנטיביוטיים על ידי מיליוני שנות 3. אלמנטים גנטיים ניידים, כגון פלסמידים, transposons, איים הגנומי, אלמנטי conjugative אינטגרטיבית וintegrons יכולים להפיץ את הגנים אנטיביוטיקה התנגדות (ARG) הן בתוך ובין מיני חיידקים 4. מבין אלה, integrons שיחק תפקיד מרכזי בהתפשטות ARG, למרותעובדה שהם מסתמכים על פלסמידים וtransposons לגיוס והכנסה לתוך הגנום של חיידקי 5. Integrons ללכוד קלטות גן באמצעות integron-אינטגראז, ולאחר מכן להביע קלטות באמצעות integron מקודד אמרגן 6,7 (איור 1). Integron גן קלטות אלמנטים ניידים קטנים בהיקף של מסגרות יחידה פתוחה קריאה (ORF) שמוצרים יכולים להעניק עמידות לאנטיביוטיקה או חומרי חיטוי 8. integrons Class 1 הוא integrons התאושש הנפוץ ביותר מבידודים קליניים 5, שבו הם רכשו ביחד יותר מ -130 קלטות גן עמידות לאנטיביוטיקה שונות 9. התפשטות integrons 1 הכיתה לחיידקים פתוגניים commensal וקשורים אנושיים מייצרת זרמי פסולת אנושיים המכילים מספר גדול של אלמנטים הגנטיים אלה 10. 10 19 חיידקים מוערכים המכילים כיתת 1 integrons משתחררים דרך ביוב בוצה כל i שנהn בריטניה 11. לכן זה לא מפתיע שintegrons כיתת 1 המקנות התנגדויות אנטיביוטיקה עכשיו שיראו בחיידקים של ציפור בר, דגים, וחיות ברות האחר 12-14 ילידים. שחרור integrons בחזרה לסביבה מהווה איום משמעותי על בריאות הציבור, מאז רכישת קלטות גן חדשות וארגון מחדש מורכב עם אלמנטים ניידים אחרים ממשיכה להתרחש, במיוחד בצמחים לטיפול בשפכים ובגופי מים אחרים 15-18. הסביבה הטבעית ואז הופכת קרקע פורה לגיוס גורמי התנגדות חדשים ופתוגנים אופורטוניסטיים 19,20. חיידקים המכיל integron רומן וargs החדש יכולים מעגל בחזרה לקהילה האנושית דרך מים ומזון מזוהמים 21,22. מעקב של args הסביבתי הוא אסטרטגיה מפתח להבנה ולניהול עמידות לאנטיביוטיקה בעתיד 23. בפרט, יש לשים לב למזון שאכלו גלם אוקל מבושל, שכן אלה להציג את האיום הגדול ביותר להעברה של אלמנטים ניידים חדשים ופתוגנים. בפרוטוקול זה, גישה יעילה לאיתור, זיהוי ואפיון כיתת 1 integrons וקלטות הגן הקשור במוצרי מזון מתוארים (איור 2). באמצעות שילוב של תגובת שרשרת culturing ופולימראז (PCR), integrons ניתן לאתר במהירות בקהילות חיידקים מורכבות ומבודדות בודדים. שיטות לזיהוי המינים של חיידקים וקונפורמציה והזהות של קלטות הגן-קשור integron מקבלות. השיטה מתאימה למגוון רחב של מזונות צמחיים ובעלי חיים, ודוגמאות של תהליכי עבודה טיפוסיים ניתנות לכל אחד מסוגי המזון.

<table><tbody><tr><td>GoTaq Colourless Mastermix</td><td>Promega</td><td>M7132</td><td>Used in all PCRs</td></tr><tr><td>RNAse (Ribonuclease A from bovine pancreas)</td><td>Sigma</td><td>R6513-10MG</td><td>Used in all PCRs</td></tr><tr><td>HinFI restriction enzyme</td><td>Promega</td><td>R6201</td><td>Used to digest 16S rDNA PCR poducts. Enzyme comes with optimal buffer and BSA</td></tr><tr><td>100 bp ladder</td><td>GE Healthcare</td><td>27400701</td><td>Used as a size standard on all agarose gels</td></tr><tr><td>GelRed DNA stain</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material</td></tr><tr><td>Guanidinium thiocyanate</td><td>Life Technologies</td><td>AM9422</td><td>CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material</td></tr><tr><td>CLS-TC Solution</td><td>MP Biomedicals</td><td>6540409</td><td>Resuspension solution used at the begining of the genomic DNA extraction</td></tr><tr><td>Lysing Matrix E FastPrep tubes</td><td>MP Biomedicals</td><td>116914500</td><td>Tube required for mechanical disruption of bacterial cell walls. This code is used for packs of 500 tubes, smaller quantities are available.</td></tr><tr><td>Binding matrix</td><td>MP Biomedicals</td><td>116540408</td><td>Diluted 1:5 with 6 M guanidinium thiocyanate and used in the genomic DNA extraction method.</td></tr><tr><td>Fast Prep machine</td><td>MP Biomedicals</td><td>Number of options available</td><td>MP Biomedicals has a number of FastPrep machines available to purchase. Visit &lt;a href=&quot;http://www.mpbio.com&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;http://www.mpbio.com&lt;/a&gt; for more information</td></tr></tbody></table>

screening foodstuffs for class 1 integrons and gene cassettes

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major factor in the spread of diverse resistance mechanisms. Amongst the DNA elements facilitating lateral transfer, the class 1 integrons have largely been responsible for spreading antibiotic resistance determinants amongst Gram negative pathogens. In total, these integrons have acquired and disseminated over 130 different antibiotic resistance genes. With continued antibiotic use, class 1 integrons have become ubiquitous in commensals and pathogens of humans and their domesticated animals. As a consequence, they can now be found in all human waste streams, where they continue to acquire new genes, and have the potential to cycle back into humans via the food chain. This protocol details a streamlined approach for detecting class 1 integrons and their associated resistance gene cassettes in foodstuffs, using culturing and PCR. Using this protocol, researchers should be able to: collect and prepare samples to make enriched cultures and screen for class 1 integrons; isolate single bacterial colonies to identify integron-positive isolates; identify bacterial species that contain class 1 integrons; and characterize these integrons and their associated gene cassettes.

<html> הקרנה של תרבויות מעורבות ומבודדים חיידקים לintI1 סט פריימר HS463a / HS464 PCR יכול לשמש כדי לזהות את נוכחותו של הגן ברמת 1 integron-אינטגראז, intI1 (איור 1). סט פריימר זה עובד היטב עבור איתור intI1 בתרבויות מעורבות, וגם משמש כדי מוש...

Watch this Scientific Journal Video about Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes at JoVE.com

Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes

This protocol describes the detection of class 1 integrons and their associated gene cassettes in foodstuffs.

הקרנת מזון לכיתה Integrons 1 וג&#39;ין קלטות

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major ...

screening-foodstuffs-for-class-1-integrons-and-gene-cassettes

Research

JoVE Journal

Environment

9.0K Views.  Macquarie University. This protocol describes the detection of class 1 integrons and their associated gene cassettes in foodstuffs. 

Video: Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as plasmid replication, plasmid stability, plasmid incompatibility, and plasmid copy number variance. This method uses the site-specific integrase from the Streptomyces phage (&Phi;) C312,3. The &Phi;C31 integrase catalyzes a direct recombination between two specific DNA sites: attB and attP (34 and 39 bp, respectively)4. This recombination is stable and does not revert5. A "landing pad" (LP) sequence consisting of a spectinomycin- resistance gene, aadA (SpR), and the E. coli &szlig;-glucuronidase gene (uidA) flanked by attP sites has been integrated into the chromosomes of Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi, and Agrobacterium tumefaciens in an intergenic region, the ampC locus, and the tetA locus, respectively. S. meliloti is used in this protocol. Mobilizable donor vectors containing attB sites flanking a stuffer red fluorescent protein (rfp) gene and an antibiotic resistance gene have also been constructed. In this example the gentamicin resistant plasmid pJH110 is used. The rfp gene6 may be replaced with a desired construct using SphI and PstI. Alternatively a synthetic construct flanked by attB sites may be sub-cloned into a mobilizable vector such as pK19mob7. The expression of the &Phi;C31 integrase gene (cloned from pHS628) is driven by the lac promoter, on a mobilizable broad host range plasmid pRK78139.
A tetraparental mating protocol is used to transfer the donor cassette into the LP strain thereby replacing the markers in the LP sequence with the donor cassette. These cells are trans-integrants. Trans-integrants are formed with a typical efficiency of 0.5%. Trans-integrants are typically found within the first 500-1,000 colonies screened by antibiotic sensitivity or blue-white screening using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid (X-gluc). This protocol contains the mating and selection procedures for creating and isolating trans-integrants.

A quick and efficient method to integrate foreign DNA of interest into pre-made acceptor strains, termed landing pad strains, is described. The method allows site-specific integration of a DNA cassette into the engineered landing pad locus of a given strain, through conjugation and expression of the &#934;C31 integrase.

אתר ספציפי הנדסה כרומוזום בקטריאלי: ΦC31 מתווכת integrase קלטת Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as ...

Bioengineering

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol for transferring gene deletion mutations from one Escherichia coli strain to another by using generalized transduction with the bacteriophage P1. This method requires that the mutation be selectable (e.g., based on gene disruptions using antibiotic cassette insertions). Such antibiotic cassettes can be mobilized from a donor strain and introduced into a recipient strain of interest to quickly and easily generate a gene deletion mutant. The antibiotic cassette can be designed to include flippase recognition sites that allow the excision of the cassette by a site-specific recombinase to produce a clean knock-out with only a ~100-base-pair-long scar sequence in the genome. We demonstrate the protocol by knocking out the tamA gene encoding an assembly factor involved in autotransporter biogenesis and test the effect of this knock-out on the biogenesis and function of two trimeric autotransporter adhesins. Though gene deletion by P1 transduction has its limitations, the ease and speed of its implementation make it an attractive alternative to other methods of gene deletion.

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Here we present a protocol for the use of pre-existing antibiotic resistance-cassette deletion constructs as a basis for making deletion mutants in other E. coli strains. Such deletion mutations can be mobilized and inserted into the corresponding locus of a recipient strain using P1 bacteriophage transduction.

הפקת ג'ין מחיקות ב- Escherichia coli מאת P1 התמרה חושית עם קלטות עמידות לאנטיביוטיקה ניתן לניתוח

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

Genetics

Site-Directed &#966;C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria

Functional genomic analysis and related strategies for genetic control of malaria rely on validated and reproducible methods to accurately modify the genome of Anopheles mosquitoes. Amongst these methods, the &#966;C31 system allows precise and stable site-directed integration of transgenes, or the substitution of integrated transgenic cassettes via recombinase-mediated cassette exchange (RMCE). This method relies on the action of the Streptomyces &#966;C31 bacteriophage integrase to catalyze recombination between two specific attachment sites designated attP (derived from the phage) and attB (derived from the host bacterium). The system uses one or two attP sites that have been integrated previously into the mosquito genome and attB site(s) in the donor template DNA. Here we illustrate how to stably modify the genome of attP-bearing Anopheles docking lines using two plasmids: an attB-tagged donor carrying the integration or exchange template and a helper plasmid encoding the &#966;C31 integrase. We report two representative results of &#966;C31-mediated site-directed modification: the single integration of a transgenic cassette in An. stephensi and RMCE in An. gambiae mosquitoes. &#966;C31-mediated genome manipulation offers the advantage of reproducible transgene expression from validated, fitness neutral genomic sites, allowing comparative qualitative and quantitative analyses of phenotypes. The site-directed nature of the integration also substantially simplifies the validation of the single insertion site and the mating scheme to obtain a stable transgenic line. These and other characteristics make the &#966;C31 system an essential component of the genetic toolkit for the transgenic manipulation of malaria mosquitoes and other insect vectors.

The protocol describes how to achieve site-directed modifications in the genome of Anopheles malaria mosquitoes using the &#966;C31 system. Modifications described include both the integration and the exchange of transgenic cassettes in the genome of attP-bearing docking lines.

אתר φC31-בתיווך אינטגרציה וחילופי קלטות בוקטורים אנופלס של מלריה

Functional genomic analysis and related strategies for genetic control of malaria rely on validated and reproducible methods to accurately modify the ...

Detection of Horizontal Gene Transfer Mediated by Natural Conjugative Plasmids in E. coli

Conjugation represents one of the main mechanisms facilitating horizontal gene transfer in Gram-negative bacteria. This work describes methods for the study of the mobilization of naturally occurring conjugative plasmids, using two naturally-occurring plasmids as an example. These protocols rely on the differential presence of selectable markers in donor, recipient, and conjugative plasmid. Specifically, the methods described include 1) the identification of natural conjugative plasmids, 2) the quantification of conjugation rates in solid culture, and 3) the diagnostic detection of the antibiotic resistance genes and plasmid replicon types in transconjugant recipients by polymerase chain reaction (PCR). The protocols described here have been developed in the context of studying the evolutionary ecology of horizontal gene transfer, to screen for the presence of conjugative plasmids carrying antibiotic-resistance genes in bacteria found in the environment. The efficient transfer of conjugative plasmids observed in these experiments in culture highlights the biological relevance of conjugation as a mechanism promoting horizontal gene transfer in general and the spread of antibiotic resistance in particular.

Detection of Horizontal Gene Transfer Mediated by Natural Conjugative Plasmids in E. coli

Conjugation mediates horizontal gene transfer by mobilizing plasmid DNA across two different cells, facilitating the spread of beneficial genes. This work describes a widely-used method for the efficient detection of conjugative plasmid transfer, based on the use of differential markers in the conjugative plasmid, donor, and recipient to detect transconjugation.

איתור העברת גנים אופקית בתיווך פלסמידים מצומדים טבעיים באי-קולי

Conjugation represents one of the main mechanisms facilitating horizontal gene transfer in Gram-negative bacteria. This work describes methods for the ...

Screening and Isolation of C-Glycoside-Cleaving Intestinal Bacteria

C-glycosides are commonly found in medicinal plants and exhibit extensive structural diversity along with various bioactivities, including antibacterial, anti-inflammatory, antiviral, antioxidant, and antineoplastic activities. In C-glycosides, the anomeric carbon of the sugar moiety is directly connected to an aglycone through carbon-carbon bonding. Compared with O-glycosides, C-glycosides are structurally stable and resistant to acids and enzymes. Consequently, they are typically unbreakable, resulting in poor absorbability and low bioavailability. Interestingly, some intestinal bacteria can cleave C-C glycosidic bonds, providing a specific and environmentally friendly biological approach to degrade C-glycosides. In this study, a set of standard operating procedures (SOPs) was developed for screening intestinal bacteria capable of cleaving C-C glycosidic bonds based on the biotransformation model of natural compounds. The SOPs include the preparation and enrichment of intestinal bacteria, activity-oriented screening, and activity validation in a low-carbon source medium. This methodology provides a foundational reference for researchers aiming to isolate and study these specialized functional bacteria.

This study establishes a set of standard operating procedures (SOPs) for efficiently screening and isolating intestinal bacteria capable of cleaving C-glycosides.

סינון ובידוד של חיידקי מעיים החותכים C-גליקוזיד

C-glycosides are commonly found in medicinal plants and exhibit extensive structural diversity along with various bioactivities, including antibacterial, ...

Biochemistry

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

פלטפורמה תפוקה גבוהה להקרנה של סלמונלה spp /שיגלה spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Immunology and Infection

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by secreting metabolites. These metabolites have the potential to modulate the physiology and differentiation of their microbial neighbors and are likely important factors in the establishment and maintenance of complex microbial communities. We have developed a fluorescence-based coculture screen to identify such chemically mediated microbial interactions. The screen involves combining a fluorescent transcriptional reporter strain with environmental microbes on solid media and allowing the colonies to grow in coculture. The fluorescent transcriptional reporter is designed so that the chosen bacterial strain fluoresces when it is expressing a particular phenotype of interest (i.e. biofilm formation, sporulation, virulence factor production, etc.) Screening is performed under growth conditions where this phenotype is not expressed (and therefore the reporter strain is typically nonfluorescent). When an environmental microbe secretes a metabolite that activates this phenotype, it diffuses through the agar and activates the fluorescent reporter construct. This allows the inducing-metabolite-producing microbe to be detected: they are the nonfluorescent colonies most proximal to the fluorescent colonies. Thus, this screen allows the identification of environmental microbes that produce diffusible metabolites that activate a particular physiological response in a reporter strain. This publication discusses how to: a) select appropriate coculture screening conditions, b) prepare the reporter and environmental microbes for screening, c) perform the coculture screen, d) isolate putative inducing organisms, and e) confirm their activity in a secondary screen. We developed this method to screen for soil organisms that activate biofilm matrix-production in Bacillus subtilis; however, we also discuss considerations for applying this approach to other genetically tractable bacteria.

Bacteria produce secreted compounds that have the potential to affect the physiology of their microbial neighbors. Here we describe a coculture screen that allows detection of such chemically mediated interspecies interactions by mixing soil microbes with fluorescent transcriptional reporter strains of Bacillus subtilis on solid media.

שימוש Coculture לזהות אינטראקציות interspecies המתווכת כימית

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Biology

ביטוי גנים בעותק יחיד לאפיון מערכות אפלוקס רב-תרופתיות

Characterizing Multidrug Efflux Systems in Acinetobacter baumannii Using an Efflux&#45;Deficient Bacterial Strain and a Single&#45;Copy Gene Expression System

Acinetobacter baumannii is recognized as a challenging Gram-negative pathogen due to its widespread resistance to antibiotics. It is crucial to comprehend the mechanisms behind this resistance to design new and effective therapeutic options. Unfortunately, our ability to investigate these mechanisms in A. baumannii is hindered by the paucity of suitable genetic manipulation tools. Here, we describe methods for utilizing a chromosomal mini-Tn7-based system to achieve single-copy gene expression in an A. baumannii strain that lacks functional RND-type efflux mechanisms. Single-copy insertion and inducible efflux pump expression are quite advantageous, as the presence of RND efflux operons on high-copy number plasmids is often poorly tolerated by bacterial cells. Moreover, incorporating recombinant mini-Tn7 expression vectors into the chromosome of a surrogate A. baumannii host with increased efflux sensitivity helps circumvent interference from other efflux pumps. This system is valuable not only for investigating uncharacterized bacterial efflux pumps but also for assessing the effectiveness of potential inhibitors targeting these pumps.

זרקור על המחבר: קידום מחקר עמידות לאנטיביוטיקה באמצעות זן חיידקי חסר אפלוקס ומערכת ביטוי גנים בעותק יחיד

We describe a facile procedure for the single-copy chromosomal complementation of an efflux pump gene using a mini-Tn7-based expression system into an engineered efflux-deficient strain of Acinetobacter baumannii. This precise genetic tool allows for controlled gene expression, which is key for the characterization of efflux pumps in multidrug resistant pathogens.

אפיון מערכות אפלוקס רב-תרופתי ב-Acinetobacter baumannii באמצעות זן חיידקי חסר אפלוקס ומערכת ביטוי גנים חד-פעמית

Acinetobacter baumannii is recognized as a challenging Gram-negative pathogen due to its widespread resistance to antibiotics. It is crucial to comprehend ...

הקרנת מזון לכיתה Integrons 1 וג'ין קלטות

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

אתר ספציפי הנדסה כרומוזום בקטריאלי: ΦC31 מתווכת integrase קלטת Exchange (IMCE)

הפקת ג'ין מחיקות ב- Escherichia coli מאת P1 התמרה חושית עם קלטות עמידות לאנטיביוטיקה ניתן לניתוח

אתר φC31-בתיווך אינטגרציה וחילופי קלטות בוקטורים אנופלס של מלריה

איתור העברת גנים אופקית בתיווך פלסמידים מצומדים טבעיים באי-קולי

סינון ובידוד של חיידקי מעיים החותכים C-גליקוזיד

פלטפורמה תפוקה גבוהה להקרנה של סלמונלה spp /שיגלה spp.

שימוש Coculture לזהות אינטראקציות interspecies המתווכת כימית

אפיון מערכות אפלוקס רב-תרופתי ב-Acinetobacter baumannii באמצעות זן חיידקי חסר אפלוקס ומערכת ביטוי גנים חד-פעמית

אפיון מערכות אפלוקס רב-תרופתי ב-Acinetobacter baumannii באמצעות זן חיידקי חסר אפלוקס ומערכת ביטוי גנים חד-פעמית

אפיון מערכות אפלוקס רב-תרופתי ב-Acinetobacter baumannii באמצעות זן חיידקי חסר אפלוקס ומערכת ביטוי גנים חד-פעמית