אנו מודים לד&quot;ר ג&#39;ניפר Emtage לקריאה ביקורתית של כתב היד, ריאן גיל לקבלת סיוע טכני ולעזור בטיפול דג הזברה וד&quot;ר סטיבן ג Ekker (Mayo Clinic, Rochster, מינסוטה) לחומרים כימיים. העבודה שלנו כבר נתמכה על ידי אוניברסיטת טמפל המכללה למדע והטכנולוגיה והמכון הלאומי לבריאות (R01-HD061749).

1. ייצור של דור F0 ידי Microinjection של מלכודת ג&#39;ין. מצאנו כי עוברים של רקע גנטי שונה להציג טולרנסים שונים להליך זה, עם סוג בר המבוסס על חיית המחמד של החנות וטובינגן - ארוך סנפיר (TLF) להיות הסובלני ביותר בזמן שיש לי זני AB ו טובינגן הישרדות עני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של ה-DNA transposon. הכן GBT-B1 (pDB783, Balciuniene et al. בהכנה) פלסמיד דנ&quot;א באמצעות ערכה סטנדרטית miniprep QIAprep (Qiagen 27106). זה חיוני כדי לכלול את צעד PB לשטוף (שהוא אופציונלי בהליך QIAprep), אחרת את ה-DNA miniprep יהיה מזוהם על ידי RNase, שמובילה להידרדרות של mRNA transposase. לפני הזריקה, לדלל את ה-DNA במי RNase חינם (Ambion AM9937) ל10 ng / μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של ה-mRNA transposase. Linearize pT3TS/Tol2 (pDB600) 13 באמצעות XbaI ולתמלל את ה-DNA לינארית באמצעות T3 מכונת mMessage(Ambion AM1348) בערכת שעתוק במבחנה. יש לנו שונה תגובת שעתוק במבחנה על ידי הוספת 0.5 μl של מעכב RiboLock RNase (ThermoFisher Fermentas EO0381). לאחר שלב טיפול DNase, לטהר mRNA באמצעות ערכת RNeasy MinElute (Qiagen 74204). להעריך את איכות במבחנה mRNA עיבד ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose. לדלל את ה-mRNA במי RNase חינם ל40 ng / μl, וחנות כ2 aliquots μl ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תערובת microinjection. לפני הזריקה, להוסיף 8 μl של ה-DNA transposon המדולל לaliquot 2 μl של mRNA transposase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microinjection. הזרק 3 NL של תערובת ה-DNA / RNA לחלמון של 1 עוברי דג הזברה סלולרי תוך שימוש בטכניקות microinjection סטנדרטיים, במטרה לממשק החלמון / blastomere. איסוף עובר כל 20 דקות כדי להבטיח הזרקה בשלב תא 1. מניסיוננו, אדם מיומן יכול בקלות להזריק 1,000 עוברים ב1-1.5 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הזרקה, להפעיל 5 μl של שמאלעל פתרון הזרקה על 1% agarose ג&#39;ל לבקרת איכות, על מנת להבטיח כי mRNA transposase לא מושפל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול עובר מוזרק. בשעתי אחר הצהריים מאוחרות, להסיר עובר מופרה ולא נורמלי ולהפיץ את העוברים ל60-80 ל100 מ&quot;מ צלחת פטרי. עוברים נורמליים ומתים יוסרו ביום 1 לאחר הפריה (DPF), 2 DPF ו3 DPF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקרנה לביטוי ה-GFP. עוברי מסך ללא פגמים גלויים לקרינת ה-GFP ב3 DPF (איור 3). הקרנה ניתן לעשות זאת גם בסטראו מצויד בקרינה (אנו משתמשים ניקון SMZ1500) או במיקרוסקופ זקוף (אנו משתמשים AxioImager Zeiss עם מטרת 5X Fluar). ביטוי נמוך של GFP מציין הזרקה או השפלה של RNA transposase כושלים בשל זיהום RNase (איור 3 א). בחר כ 30% מהעוברים המבריקים אשר גם לי הביטוי של GFP ברקמות מרובות או באחוז גבוה של תאים של רקמות ספציפיות (השווה Figures 3B ו 3 ג). מהזרקה של 1,000 עוברים, יש לנו בדרך כלל עד 100 גבוהים-GFP-לבטא עוברים התפתחותית נורמלים,. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם עוברי F0 נבחרו באמצעות נהלי גידול דג הזברה רגילים. סביר לצפות כי 20-30% מהעוברים המוזרקים שנבחרו לגידול יגיעו לבגרות. </li></ol> 2. תחזוקה של כטב&quot;מ: mRFP בודק קו. יש לנו שנוצר 14xUAS: קו mRFP סומן על ידי γCry עדשה ספציפית: ה-GFP. מאז כטב&quot;מ כפוף להשתקה באמצעות מתילציה DNA, חשוב לבחור דגים עם רמות נמוכות של השתקה כדי להפיץ את המניות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת כטב&quot;מ בודד: הומוזיגוטים mRFP להזדווגות עם אחד מקווי Gal4 אמין ביותר שלנו מלכודת גן, tpl6 NSF (Balciuniene ואח&#39; בהכנה.). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום למחרת, להעביר את כטב&quot;מ: דגי mRFP אשר נתנו עוברים למכלי סטטית בודד, בעוד העוברים נאספיםוניקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברי מסך של ה-GFP וקרינת RFP בDPF 1 ו -3 DPF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגי Intercross אשר נתנו עוברים עם ביטוי גבוה mRFP להקים את הדור הבא של כטב&quot;מ: קו mRFP. </li></ol> 3. הקרנה של דגי F0. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחצות F0 הפרטני עם כטב&quot;מ הומוזיגוטים: דגי mRFP (איור 4). אנחנו בדרך כלל להזריק GBTs לקווים עם דפוסי wild-type או פיגמנטציה נמר, וכטב&quot;מ הומוזיגוטים שלנו: קו mRFP הוא ברקע פליז. לכן דגי F0 הזריקו-GBT ניתן להבחין בקלות מכטב&quot;מ: דגי mRFP, ומבטל את הצורך ברישום אם F0 שהוקרן היה זכר או נקבה, כמו גם שגיאות אפשריות הנובעות מטעויות בהקלטה ו / או לקביעת מינו של כל דגים. אנשים עם ניסיון מוגבל מאוד, סטודנטים לתואר הראשונים כאלה, ולכן הם מסוגלים להקים ולפרק את הזדווגויות דגים. גישה זו יש חסרון, כי שני רקע גנטי שונהבשימוש, שעלול לסבך את הפרשנות של אובדן פנוטיפים פונקציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום למחרת, להחזיר את כטב&quot;מ פליז: דגי mRFP לטנק שלהם. מניחים את דגי F0 אשר נתנו עוברים למכלי סטטית בודד (אנו משתמשים Hagen Exo Terra Faunarium קטן, אבל כל טנק קטן יכול לשמש למטרה זו) בזמן שעוברים נאספים והוקרנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים נקיים והעברה נאספו לתוך צלחות פטרי חדשות (&lt;100 לכל צלחת) בשעתי אחר הצהריים של יום: 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברי מסך של ה-GFP וקרינת RFP ב1 DPF, 2 DPF ו3 DPF. משוך עוברים חיוביים עבור שניהם ה-GFP ו RFP החוצה, למיין אותם לפי ה-GFP / דפוס ביטוי RFP (אם תבנית יותר מפעם אחת הוא ציין במצמד) ולגדל אותם להקים דור F1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את דגי F0 אשר מיוצרים רק עוברים שליליים (מתוך מספר כולל של 50-100 עוברים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחצות את דגי F0 שהפיק ה-GFP / צאצאי RFP חיובי שוב כדי לקבל את מנה שנייה של תוצאות חיוביות. </li></ol> 4.הקרנה של דגי F1. דגי F1 מוקרנים להקים משפחות F2, כדי לתעד את דפוס ביטוי מלכודת הגן ולהקפיא קבוצות של עוברים לזיהוי מולקולרי של לוקוסי מלכודת גן על ידי 5 גזע &#39;והפוך ה-PCR. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחצות דגי F1 פרטניים עם כטב&quot;מ הומוזיגוטים: דגי mRFP (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, הנח את דג F1 שנתן עוברים למכלי סטטית בודד ואילו העוברים נאספים והוקרנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברי מסך של ה-GFP וקרינת RFP ב1 DPF, 2 DPF ו3 DPF. עוברים נפרדים ולצלם חיוביים עבור שני GFP ו24 RFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשעת 5 DPF, להקפיא קבוצות של RACE 20 GFP / RFP-חיובי ו20 GFP / עוברי RFP-שלילי לזיהוי גנים שעברו מוטציה insertionally ידי PCR ההפוך ו5 &#39;9,10. להעלות את ה-GFP / עוברי RFP חיובי שנותרו להקים דור F2. </li></ol>

<ol>
	<li>Balciunas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer+trapping+in+zebrafish+using+the+Sleeping+Beauty+transposon.">Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon.</a> BMC Genomics. 5 (1), 62 (2004).</li><li>Trinh le, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+gene+trap+to+visualize+and+interrogate+the+function+of+the+vertebrate+proteome.">A versatile gene trap to visualize and interrogate the function of the vertebrate proteome.</a> Genes Dev. 25 (21), 2306-2320 (2011).</li><li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish.">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Dev Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li><li>Emelyanov, A., Parinov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mifepristone-inducible+LexPR+system+to+drive+and+control+gene+expression+in+transgenic+zebrafish.">Mifepristone-inducible LexPR system to drive and control gene expression in transgenic zebrafish.</a> Dev Biol. 320 (1), 113-121 (2008).</li><li>Ellingsen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+enhancer+detection+in+the+zebrafish+genome.">Large-scale enhancer detection in the zebrafish genome.</a> Development. 132 (17), 3799-3811 (2005).</li><li>Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Gal4+genetics+for+permanent+gene+expression+mapping+in+zebrafish.">Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13365-13370 (2009).</li><li>Davison, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+from+Gal4-VP16+transgenic+insertions+for+tissue-specific+cell+labeling+and+ablation+in+zebrafish.">Transactivation from Gal4-VP16 transgenic insertions for tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish.</a> Dev Biol. 304 (2), 811-824 (2007).</li><li>Sivasubbu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-breaking+transposon+mutagenesis+reveals+an+essential+role+for+histone+H2afza+in+zebrafish+larval+development.">Gene-breaking transposon mutagenesis reveals an essential role for histone H2afza in zebrafish larval development.</a> Mech Dev. 123 (7), 513-529 (2006).</li><li>Clark, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+protein+trapping+produces+a+functional+expression+codex+of+the+vertebrate+proteome.">In vivo protein trapping produces a functional expression codex of the vertebrate proteome.</a> Nat Methods. 8 (6), 506-512 (2011).</li><li>Petzold, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+response+genetics+in+the+zebrafish.">Nicotine response genetics in the zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18662-18667 (2009).</li><li>Gaiano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+and+rapid+cloning+of+essential+genes+in+zebrafish.">Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish.</a> Nature. 383 (6603), 829-832 (1996).</li><li>Amsterdam, A., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+strategies+in+zebrafish+for+identifying+genes+involved+in+development+and+disease.">Mutagenesis strategies in zebrafish for identifying genes involved in development and disease.</a> Trends Genet. 22 (9), 473-478 (2006).</li><li>Balciunas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+a+high+cargo-capacity+transposon+for+genetic+applications+in+vertebrates.">Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates.</a> PLoS Genet. 2 (11), e169 (2006).</li><li>Urasaki, A., Morvan, G., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+dissection+of+the+Tol2+transposable+element+identified+the+minimal+cis-sequence+and+a+highly+repetitive+sequence+in+the+subterminal+region+essential+for+transposition.">Functional dissection of the Tol2 transposable element identified the minimal cis-sequence and a highly repetitive sequence in the subterminal region essential for transposition.</a> Genetics. 174 (2), 639-649 (2006).</li><li>Haffter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+genes+with+unique+and+essential+functions+in+the+development+of+the+zebrafish,+Danio+rerio.">The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 1-36 (1996).</li><li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+315+genes+essential+for+early+zebrafish+development.">Identification of 315 genes essential for early zebrafish development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12792-12797 (2004).</li><li>Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+Gal4-UAS+technique+for+targeted+gene+expression+in+the+zebrafish.">Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish.</a> Mech Dev. 80 (2), 153-158 (1999).</li><li>Koster, R. W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+transgene+expression+in+living+zebrafish+embryos.">Tracing transgene expression in living zebrafish embryos.</a> Dev Biol. 233 (2), 329-346 (2001).</li><li>Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+double-strand+breaks+into+the+genome+of+mouse+cells+by+expression+of+a+rare-cutting+endonuclease.">Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease.</a> Mol Cell Biol. 14 (12), 8096-8106 (1994).</li><li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish.">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li><li>Lisby, M., Mortensen, U. H., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+multiple+DNA+double-strand+breaks+at+a+single+Rad52+repair+centre.">Colocalization of multiple DNA double-strand breaks at a single Rad52 repair centre.</a> Nat Cell Biol. 5 (6), 572-577 (2003).</li><li>Bennardo, N., Cheng, A., Huang, N., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative-NHEJ+is+a+mechanistically+distinct+pathway+of+mammalian+chromosome+break+repair.">Alternative-NHEJ is a mechanistically distinct pathway of mammalian chromosome break repair.</a> PLoS Genet. 4 (6), e1000110 (2008).</li><li>Rehn, K., Wong, K. S., Balciunas, D., Sumanas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+enhancer+trap+line+recapitulates+embryonic+aquaporin+1a+expression+pattern+in+vascular+endothelial+cells.">Zebrafish enhancer trap line recapitulates embryonic aquaporin 1a expression pattern in vascular endothelial cells.</a> Int J Dev Biol. 55 (6), 613-618 (2011).</li><li>Petzold, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCORE+imaging:+specimen+in+a+corrected+optical+rotational+enclosure.">SCORE imaging: specimen in a corrected optical rotational enclosure.</a> Zebrafish. 7 (2), 149-154 (2010).</li><li>Akitake, C. M., Macurak, M., Halpern, M. E., Goll, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenerational+analysis+of+transcriptional+silencing+in+zebrafish.">Transgenerational analysis of transcriptional silencing in zebrafish.</a> Dev Biol. 352 (2), 191-201 (2011).</li><li>Boniface, E. J., Lu, J., Victoroff, T., Zhu, M., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FlEx-based+transgenic+reporter+lines+for+visualization+of+Cre+and+Flp+activity+in+live+zebrafish.">FlEx-based transgenic reporter lines for visualization of Cre and Flp activity in live zebrafish.</a> Genesis. 47 (7), 484-491 (2009).</li><li>Skarnes, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+public+gene+trap+resource+for+mouse+functional+genomics.">A public gene trap resource for mouse functional genomics.</a> Nat Genet. 36 (6), 543-544 (2004).</li><li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+delivery+and+gene+expression+in+zebrafish+using+the+Sleeping+Beauty+transposon.">Efficient gene delivery and gene expression in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon.</a> Dev Biol. 263 (2), 191-202 (2003).</li></ol>

מחברים אלה אין לחשוף.

וקטורי מלכודת הגן והמתודולוגיה מתוארים כאן כבר נמצאים בשימוש במספר מעבדות עצמאיות. מניסיוננו, יש שני שלבים קריטיים בתהליך. הצעד הקריטי הראשון הוא להשיג שיעור גבוה של אינטגרציה מלכודת גן בעוברי F0 מוזרק. כישלון בשלב זה לעתים קרובות ניתן לייחס לזיהום RNase של ריאגנטים ההזרקה, במיוחד את ה-DNA miniprep. זה גם מאוד חשוב להזריק עוברים בשלב התא 1 לניסויי מלכודת גן. מניסיוננו, transgenesis בתיווך Tol2 הוא יעיל מאוד, מה שהופך אותו ניתן להשיג קווים מהונדסים גם כאשר הזרקה תאוחר משלב התא 1 או עם ה-DNA באיכות נמוכה יותר. זריקות ירודים הן הרבה יותר בעייתי בעת ביצוע mutagenesis מלכודת גן, שכן רק חלק קטן של אינטגרציות וקטור לגרום לאירועי מלכודת גן יעילים. השלב הקריטי השני הוא לברר אירועי מלכודת גן על ידי חצייה לכטב&quot;מ שלנו: קו mRFP. העדר ביטוי mRFP הואכמעט תמיד מעיד על אירוע מלכודת משפר. עם זאת, לעתים חוסר ביטוי mRFP עשוי להצביע על השתקה של 14x כטב&quot;מ. לכן חשוב לשמור על כטב&quot;מ: קו mRFP במדינה שאינה מושתק על ידי הפצת הדור הבא באמצעות אנשים עם ביטוי הגבוה RFP כאשר חצו לtpl6 NSF. אנחנו יכולים לחזות מה שהופך את מספר שיפורים לוקטורי מלכודת הגן שלנו ופרוטוקול. הראשון הוא להשתמש בכטב&quot;מ פחות חוזר על עצמו במבנה מלכודת הגן. הוכח שכטב&quot;מ 5x מספיק כדי להשיג הפעלה מלאה בניסויי תרבית תאים, וכי רצפי כטב&quot;מ פחות חוזר על עצמו הם פחות רגישים למתילציה והשתקת 6,25. זה יכול להיות גם אפשרי לעצב וקטורי מלכודת גן לmutagenesis המותנה באופן מלא, באנלוגיה לווקטורים בשימוש על ידי קונסורציום מלכודת גן העכבר הבינלאומי ולאחרונה מותאמים לדג זברה 2,26,27. שיפור נוסף יהיה להשתמש t שונהמערכת ransposon, למשל יפהפה נרדמת 28, כדי לייצר כטב&quot;מ: קו כתב mRFP. זה יאפשר הזרקה של מלכודות גן מבוססות Tol2 ישירות לתוך קו הכתב וההקרנה של F0s ידי incrossing. יתר על כן, זה היה מונע את השימוש בשני רקע גנטי שונה, מה שהופך את הפרשנות של אובדן פנוטיפים פונקציה פשוטה יותר. אפילו עם שיפורים אלה, פרוטוקול מלכודת גן הכללי Gal4 הוצג כאן עדיין יהיה ישים באופן מלא.

mutagenesis insertional הוכיח להיות גישה רבת עוצמה כדי לנתח תפקוד גן במערכות מודל שונים מיצורים חד תאיים כמו חיידקים ושמרים ליצורים רב תאיים כגון עכברים וצמחים. כל ה-DNA אקסוגני (וירוס, transposon או פלסמיד) עשוי לשמש mutagen ידי לקטוע מרכיבים חיוניים של גנים כגון אקסונים או יזמים. היעד האפקטיבי של גישות פשוטות כזו הוא קטן ביותר בגנום גדול ומורכב, שכן אקסונים מהווים רק 1-3% מהגנום חוליות טיפוסיים. גודל היעד אפקטיבי קטן ניתן להתגבר על ידי שיעורי אינטגרציה גבוהה מאוד וקטורית, כפי שהודגם על ידי ההצלחה האדירה של mutagenesis insertional רטרווירלי ב11,12 דג הזברה. לעומת זאת, אינטרונים מהווים כ 20-30% מהגנום חוליות. בדג זברה, וקטורי mutagenesis insertional מבוסס transposon אשר למעשה להציג null או מוטציות hypomorphic חמורות על השתלבות אינטרונים כבר בשם &quot;transposo גן השבירהNS &quot;(GBTs) 8-10. לאינטגרצית מלכודת גן יעילה, הם משתמשים transposon Tol2 מינימאלי 13,14. Mutagenicity של GBTs מסתמך על acceptor אחוי המופק מדג ורצפי הסיום / polyadenylation תעתיק. האלמנטים אחראים להמוטגניות GBT נמצאים לצד על ידי אתרי loxP ישירים לכריתה על ידי recombinase Cre. לכן, הזרקה של Cre mRNA מובילה להחזרה יעילה של מוטציות הנגרמות GBT, למרות שכמה רצפי transposon יישארו במוקד האינטגרציה 9,10. וקטורי GBT פורסמו לאחרונה להשתמש mRFP כ9,10 כתב מלכודת הגן, מה שמוביל לשני חסרונות פוטנציאליים. ראשית, זה לא ידוע מה חלק של הגנים דג הזברה באים לידי ביטוי ברמה מספיק גבוהה כדי להיות מזוהה על ידי חלבוני היתוך כתב ניאון ישירים. שנית, קבוצה קטנה בלבד של גנים צפויים להיות להם פונקציות חיוניות. הערכה הוא שיש רק 1,400-2,400 הגנים דרושים developme דג הזברהNT 15,16. רוב מוטציות מלכודת הגן אינן צפויות להציג פנוטיפים גלויים ולכן תהיה בעלת תועלת מוגבלת. כדי להתגבר על שתי המגבלות האלה, יש לנו שונה GBT-R15 9,10 לשימוש עם Gal4-VP16 ככתב מלכודת גן הראשוני (Balciuniene et al. בהכנה). כמו באוגוסט פחות mRFP בGBT-R15, אתר תחילת התרגום הוסר מGal4-VP16. לגילוי ישיר של אירועי מלכודת גנים, הווקטורים שלנו מכילים כתב eGFP תחת שליטתו של 14x Gal4 כטב&quot;מ 17,18. כמה תכונות נוספות מתוכננות לוקטור מלכודת גן bipartite שלנו. כטב&quot;מ: קלטת eGFP הוא מוקף אתרים ישירים FRT (דרגות אפורות באיור 1). הזרקה של FLP recombinase mRNA מובילה לכריתה של כטב&quot;מ: קלטת eGFP, עוזבת את המוטציה מלכודת גן סימן וזכרה לקרינה eGFP. זה לאחר מכן ניתן להשתמש בקווים מהונדסים שיסמנו רקמות ספציפיות או אירועים התפתחותיים על ידי הקרינה ה-GFP. כמו באחריםGBTs, כל קלטת מלכודת גן מוקפת אתרים ישירים loxP (מחומשים פתוחים באיור 1). זה עושה את אירועי מלכודת הגן הפיכים על ידי ביטוי של recombinase Cre, קלות הקמת הוכחת יחסי סיבתיות בין אינטגרציה מלכודת גן ספציפית וציין פנוטיפ (איור 2). לבסוף, את קלטת מלכודת גן מוקפת אתרים הפוכים I-SCEI meganuclease (משולשים שחורים באיור 1). בדרוזופילה, אינטגרציות transposon נהוגות להמיר למחיקות (ליקויים) על ידי כריתה מדויקת של אלמנט P. אין ראיות לכך שכריתה של transposon Tol2 (או כל transposon אחר הפועל בבעלים חוליות כגון יפהפה נרדמת, PiggyBac או AC / DS) יכולה להוביל למחיקות. לפיכך, אנו כללנו אתרי I-SCEI כשיטה פונדקאית פוטנציאלית לגיוס של מחיקות, למרות שאין כל הוכחה שאני-SCEI יכול לגרום למחיקות בדג זברה. יש לציין כי בעוד שמגה I-SCEInuclease ניתן להשתמש כדי להקל על transgenesis בדג זברה, מחשוף ה-DNA על ידי meganuclease I-SCEI משמש ללמוד מנגנוני תיקון DNA, כוללים מועדת לטעויות שאינן הומולוגיים סוף להצטרף, בשמרים ובתאי יונקים 19-22. שילוב של וקטור מלכודת הגן שלנו יכול להוביל לביטוי eGFP ידי שני מנגנונים שונים. הראשון הוא אירוע מלכודת גן אמיתי (איור 1 ג): הווקטור משתלב גן (IMG לInsertionally מוטציה גנטי), תמליל היתוך בין 5 &#39;לפרוטוקול IMG אנדוגני וGal4-VP16 הוא עשה ותורגם ל חלבון היתוך המכיל N-הסופית של החלבון מקודד על ידי IMG וGal4-VP16. חלבון היתוך זה נקשר ל14x כטב&quot;מ ומפעיל שעתוק של eGFP. האירוע השני, פחות הרצוי הוא מלכודת משפר (1D איור): האמרגן המינימלי מול eGFP נופל תחת שליטתו של משפר סמוך לאתר האינטגרציה, מה שמוביל לייצור של eGFP בabהיגיון של ייצור Gal4-VP16. להערכתנו, 30-50% מאירועי ביטוי eGFP הן בשל מלכודת משפר ו50-70% הם תוצאה של מלכודת גן 23 (Balciuniene et al. בהכנה). כדי להבחין בין שני סוגים של אירועים אלה, עשינו 14xUAS: קו מהונדס mRFP (איור 1), לנוחיות בסימן γCry עדשה ספציפית: (. Balciuniene ואח&#39; בהכנה) ה-GFP. אירועי מלכודת הגן מאומתים על ידי שיתוף ביטוי של ה-GFP וRFP (השווה C ו-D באיור 2). במסך הטייס שלנו, התאוששו מעל 40 אירועי מלכודת גן לאחר הקרנת 270 דגי F0 הוזרקו תערובת של דנ&quot;א transposon וmRNA transposase. שתיים מאינטגרציות מלכודת הגן שלנו התרחשו בגנים עם מוטציות כימית המושרה שפורסמו בעבר: NSF וFLR. פנוטיפים של tpl6 מוטציות insertional NSF וtpl24 FLR הם נבדלים באופן שטחי מפנוטיפים של מוטציות כימית המושרה המקבילות. אנחנו גם ציינו כי אירועי מלכודת הגן יופיעו עם נטייה לאינטרונים ליד הקצה &#39;5 של גנים, ובכך להגדיל את ההסתברות של אללים null. אנחנו עדיין צופים מידה מסוימת של השתקת כטב&quot;מ (ססגון) בכל קווי מלכודת הגן שלנו, וכמה לוקוסים הם באופן ברור יותר רגישים ססגון יותר מאחרים. אנחנו לא מאמינים שהשתקת כטב&quot;מ היא בעיה משמעותית עבור התפשטות של קווי מלכודת הגן, כפי שהצלחנו להפיץ את כל קווי מלכודת הגן שלנו בקלות דרך לפחות חמישה דורות על ידי בחירה לביטוי של GFP לבד.

<table><tbody><tr><td>Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Optional PB wash step is a must</td></tr><tr><td>XbaI restriction enzyme</td><td>ThermoFisher</td><td>ER0681</td><td></td></tr><tr><td>mMessage Machine T3</td><td>Ambion</td><td>AM1348</td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNase Inhibitor</td><td>ThermoFisher</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinElute</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>Can be replaced by phenol extraction and precipitation. Do not use LiCl!</td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>Has to be non-DEPC treated</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capiliaries for microinjection needles</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Microcapiliaries for calibration</td><td>Drummond Scientific</td><td>1-000-0010</td><td></td></tr><tr><td>Microloader tips</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr><tr><td>Needle puller *</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope for microinjection * </td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td>We also use Wild 5M and Olympus SZ61 with transmitted light stand</td></tr><tr><td>Picoinjector *</td><td>Harvard Instruments</td><td>Pli-90</td><td>We also use Pli-100</td></tr><tr><td>Screening microscope with GFP/RFP fluorescence *</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss AxioImager</td><td>5X Fluar objective has sufficient working distance</td></tr><tr><td>Screening microscope with GFP/RFP fluorescence *</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">* We suggest this equipment only because we successfully use it in our laboratory. In each category, several comparable options from multiple manufacturers are available.</td></tr></tbody></table>

gene trapping using gal4 in zebrafish

גודל מצמד גדול והתפתחות חיצונית של עוברים שקופים אופטי להפוך את דג הזברה מערכת מודל חוליות יוצאת דופן עבור mutagenesis insertional in vivo באמצעות כתבי ניאון לתייג ביטוי של גנים שעברו מוטציה. מספר מעבדות שנבנו ונבדקו וקטורים משפר וגן המלכודת בדג זברה, באמצעות חלבוני ניאון, מפעילי תעתיק מבוסס LexA Gal4-וככתבי 1-7. היו לי וקטורים אלו שני חסרונות פוטנציאליים: ההחמרה הכי מוצלח (למשל חוסר היכולת להבחין בין אירועים משפר וגן המלכודת) והמוטגניות נמוכה (למשל אינטגרציות לגנים לעתים נדירות המיוצרים אללים null). גן Breaking transposon (GBTs) פותחו כדי לטפל בחסרונות הללו 8-10. יש לנו שונה אחד מוקטורי GBT הראשונים, GBT-R15, לשימוש עם Gal4-VP16 ככתב הראשי של מלכודת גן וכטב&quot;מ הוסיף: eGFP ככתב המשני לגילוי ישיר של אירועי מלכודת הגן.pplication של Gal4-VP16 ככתב מלכודת גן הראשוני מספק שני יתרונות עיקריים. ראשית, היא מגבירה את הרגישות לגנים לידי ביטוי ברמות ביטוי נמוכים. שנית, היא מאפשרת לחוקרים להשתמש בקווי מלכודת גן כמו נהגי Gal4 לביטוי ישיר של transgenes האחר ברקמות ספציפיות מאוד. זה רלוונטי במיוחד לגנים עם פונקציות שאינן חיוניות או מיותר, שבו האינטגרציה מלכודת גן עשויה שלא לגרום לפנוטיפים גלויים. החסרון של שימוש Gal4-VP16 ככתב מלכודת הגן העיקרי הוא שהגנים מקודדים לחלבונים עם רצפי אות N-מסוף אינם ניתנים להשמנה, כמו חלבוני היתוך Gal4-VP16 וכתוצאה מכך צפויים להיות מסוגלת להיכנס לגרעין ולהפעיל שעתוק. חשוב מכך, השימוש בGal4-VP16 לא מראש לבחור עבור חלבונים גרעיניים: אנו התאוששו מוטציות מלכודת גן בגני מקודדי חלבונים המתפקדים בגרעין, ציטופלסמה ואת קרום הפלזמה.

בזריקה מוצלחת, לפחות 80% מהעוברים הוזרקו תערובת mRNA מלכודת גן ה-DNA / Tol2 transposase להציג מידה מסוימת של הקרינה ה-GFP (איור 3). כאשר עוברי GFP החיובי הבהירים (איור 3 ג) נבחרו להקים את בריכת F0, אחד מכל 10 דגי F0 הוקרנו יניבו צאצאי מלכודת גן. בין דגי F0 ממנו אירועי מלכודת הגן הם התאוששו, רוב לשדר אירוע מלכודת גן יחיד, בנוסף לכמה אינטגרציות transposon שאינו מבטאות. עם זאת, יש לנו שהוקמו עד ארבעה קווי מלכודת גן מאדם F0 אחת. דפוסי ביטוי של GFP / RFP בקווי מלכודת גן נעים בין מאוד רקמות ספציפיות (לדוגמא בנורות חוש הריח) לכל מקום בצורה הוגנת. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1.jpg" /> איור 1. Tהוא Gal4 המכיל וקטור מלכודת גן bipartite GBT-B1 והיישומים שלה. א רכיבים של וקטור מלכודת גן Gal4 המכיל: Tol2 5 &#39;וTol2 3&#39;, transposon Tol2 המינימלי מסתיים 13; acceptor אחוי β-אקטין CSA, קרפיון 8; ^ Gal4-VP16, Gal4-VP16 אוגוסט פחות; זף ( א), β-אקטין UTR &#39;3 דג הזברה ופולי () אלמנטים מGBT-R15 9,10. 14XUAS, eGFP וp SV40 () הם מרכיבים של כטב&quot;מים: 17,18 קלטת ביטוי eGFP. החץ מציין הפעלה של כטב&quot;מ: eGFP ידי Gal4-VP16 מיוצר על ידי מלכודת הגן ב 14XUAS:. Transgene mRFP סומן על ידי γCry עדשה ספציפית: קלטת ה-GFP. החץ מציין הפעלה של כטב&quot;מ: mRFP ידי Gal4-VP16 באירוע מלכודת ג &#39;ין טראנס.. קופסות כחולים הן אקסונים. שחבור מצויינים על ידי קו מקווקו. אירוע מלכודת ד Enhancer. אינטגרציה של הווקטור ליד משפר (קופסא חומה) עשויה להציב אמרגן eGFP המינימלי תחת שליטתו של משפר זו (חץ חום<html> ). הדבר יביא לביטוי רקמות הספציפיות של eGFP, אבל מאז Gal4-VP16 לא נעשה, ביטוי mRFP לא יופעל. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2.jpg" /> איור 2. חזרה של אירועי מלכודת הגן באמצעות recombinase Cre. , ב &#39;תרשים של מוטציה מלכודת גן () ואלל מלכודת הגן חזר-Cre (ב&#39;). C, D. שיתוף ביטוי של ה-GFP (C) וRFP (ד &#39;) במערכת העצבים של גן tpl6 NSF שורת מלכודת. E, הזרקת פ של Cre-RNA לעוברי tpl6 NSF מובילה לאובדן של ה-GFP (E) וRFP ביטוי (F). שים לב שאין ירידה של ביטוי ה-GFP בעדשה, כצפוי. r.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig3.jpg" /> איור 3. עוברים מוזרק עם מלכודת גן GBT-B1 (pDB783). . א עוברים הוזרקו pGBT-B1 GFP הקרינה קטנה תצוגה לבד בגוף B (pDB783), ק העוברים הוזרקו mRNA pGBT-B1 וTol2 transposase: קבוצה אקראית של עוברים (ב &#39;) וגבוה expressors שנבחר לגידול (C). <img alt="איור 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4.jpg" /> איור 4. מתווה ניסוי להקמת קווי מלכודת גן Gal4. מבני אדום / ירוק חלקית חופפים מצביעים על שיתוף ביטוי של ה-GFP וRFP, בעוד ירוק לבד מציין פסיפס לאירועי מלכודת גן או מלכודת משפר.

Watch this Scientific Journal Video about Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish at JoVE.com

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

פרוטוקול זה מתאר השיטה של ​​mutagenesis insertional מלכודת הגן באמצעות Gal4-VP16 ככתב הראשי וה-GFP / RFP ככתבים משניים בדג זברה. בערך אחד מעשרה צאצאי מלכודת גן תשואת דגי F0-להביע גבוה שיתוף להביע GFP וRFP. הליך המיון וניתן לשנות בקלות כדי להתאים לגודל של המעבדה מבצעת את מסך mutagenesis insertional.

גן השמנה באמצעות Gal4 בדג הזברה

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

Research

JoVE Journal

Biology

18.2K Views.  Temple University.  פרוטוקול זה מתאר השיטה של ​​mutagenesis insertional מלכודת הגן באמצעות Gal4-VP16 ככתב הראשי וה-GFP / RFP ככתבים משניים בדג זברה. בערך אחד מעשרה צאצאי מלכודת גן תשואת דגי F0-להביע גבוה שיתוף להביע GFP וRFP. הליך המיון וניתן לשנות בקלות כדי להתאים לגודל של המעבדה מ?...

Video: Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Studying the earliest events of preneoplastic cell progression and innate immune cell interaction is pivotal to understand and treat cancer. Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformations and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells in zebrafish larvae.

הדמיה חיה של אינטראקציות תא של מערכת חיסון המולדת וPreneoplastic שימוש מערכת ביטוי / כטב&quot;מ העין מתנהלת Gal4 בעור הזחל דג הזברה

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Developmental Biology

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

מעקב תאים דג הזברה GFP מהונדס שימוש במערכת photoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short generation time, are easy to handle, display a high reproductive rate, low cost, and are easily amenable to genetic manipulations by microinjection of DNA in embryos. Recent advances in gene editing tools are enabling precise introduction of mutations and transgenes in zebrafish. Disease modeling in zebrafish often leads to larval phenotypes and early death which can be challenging to interpret if genotypes are unknown. This early identification of genotypes is also needed in experiments requiring sample pooling, such as in gene expression or mass spectrometry studies. However, extensive genotypic screening is limited by traditional methods, which in most labs are performed only on adult zebrafish or in postmortem larvae. We addressed this problem by adapting a method for the isolation of PCR-ready genomic DNA from live zebrafish larvae that can be achieved as early as 72 h post-fertilization (hpf). This time and cost-effective technique, improved from a previously published genotyping protocol, allows the identification of genotypes from microscopic fin biopsies. The fins quickly regenerate as the larvae develop. Researchers are then able to select and raise the desired genotypes to adulthood by utilizing this high-throughput PCR-based genotyping procedure.

Zebrafish have been used as reliable genetic model organisms in biomedical research, especially with the advent of gene-editing technologies. When larval phenotypes are expected, DNA extraction and genotype identification can be challenging. Here, we describe an efficient genotyping procedure for zebrafish larvae, by tail clipping, as early as 72-h post-fertilization.

מיצוי DNA תפוקה גבוהה, Genotyping של הזחלים דג זברה 3dpf על-ידי המסיכה פין

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

Genetics

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

מיקוד Bulb נוירונים חוש הריח שימוש משולב In vivo Electroporation ו Gal4 מבוסס Enhancer מלכודת קווי דג הזברה

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Neuroscience

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, including eye degeneration, albinism, sleep loss, hyperphagia, and sensory processing. Species of cavefish from around the world display a convergent evolution of morphological and behavioral traits due to shared environmental pressures between different cave systems. Diverse cave species have been studied in the laboratory setting. The Mexican tetra, Astyanax mexicanus, with sighted and blind forms, has provided unique insights into biological and molecular processes underlying the evolution of complex traits and is well-poised as an emerging model system. While candidate genes regulating the evolution of diverse biological processes have been identified in A. mexicanus, the ability to validate a role for individual genes has been limited. The application of transgenesis and gene-editing technology has the potential to overcome this significant impediment and to investigate the mechanisms underlying the evolution of complex traits. Here, we describe a different methodology for manipulating gene expression in A. mexicanus. Approaches include the use of morpholinos, Tol2 transgenesis, and gene-editing systems, commonly used in zebrafish and other fish models, to manipulate gene function in A. mexicanus. These protocols include detailed descriptions of timed breeding procedures, the collection of fertilized eggs, injections, and the selection of genetically modified animals. These methodological approaches will allow for the investigation of the genetic and neural mechanisms underlying the evolution of diverse traits in A. mexicanus.&#160;

We describe approaches for the manipulation of genes in the evolutionary model system Astyanax mexicanus. Three different techniques are described: Tol2-mediated transgenesis, targeted manipulation of the genome using CRISPR/Cas9, and knockdown of expression using morpholinos. These tools should facilitate the direct investigation of genes underlying the variation between surface- and cave-dwelling forms.

מניפולציה של פונקציית ג'ין Cavefish מקסיקני

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

ויזואליזציה של הפעילות החשמלית הסלולר עוברי מוקדם דג זברה, גידולים

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

<meta charset="utf8"></head><body>תיוג חלבון פלואורסצנטי בזחלי דג זברה באמצעות CRISPR/Cas9 Knock-In

Fluorescence Labeling to Visualize Low-Expressed Proteins in Zebrafish

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in vivo imaging due to its transparency during the early developmental stage. Here, we provide a detailed protocol for performing high-efficiency fluorescence gene KI, rapid screening for KI founders, and low-abundance protein tracing in zebrafish larvae, which will lay a critical foundation for subsequent physio-pathological studies in zebrafish. The current protocol includes complete steps for the sgRNA design for the gene of interest, sgRNA in vitro transcription, Cas9 mRNA in vitro transcription, in vivo sgRNA screen for the one with the highest efficiency, donor plasmid design and construction, microinjection in zebrafish larvae, KI founder screen and zebrafish live imaging. Critical steps, troubleshooting tips, quality control methods, and advantages and applications of this protocol are included and discussed. This protocol assures quick and accurate results at a low cost and has been validated by multiple trials.

<meta charset="utf8"></head><body>תיוג פלואורסצנטי להמחשת חלבונים בעלי ביטוי נמוך בדג הזברה

Here, we present a protocol to label proteins with a fluorescence protein tag in zebrafish larvae, a newly developed and modified in vivo system especially useful for visualizing low-abundance proteins in zebrafish.

תיוג פלואורסצנטי להמחשת חלבונים בעלי ביטוי נמוך בדג הזברה

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in ...

גן השמנה באמצעות Gal4 בדג הזברה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הדמיה חיה של אינטראקציות תא של מערכת חיסון המולדת וPreneoplastic שימוש מערכת ביטוי / כטב"מ העין מתנהלת Gal4 בעור הזחל דג הזברה

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

מעקב תאים דג הזברה GFP מהונדס שימוש במערכת photoconvertible PSmOrange

מיצוי DNA תפוקה גבוהה, Genotyping של הזחלים דג זברה 3dpf על-ידי המסיכה פין

מיקוד Bulb נוירונים חוש הריח שימוש משולב In vivo Electroporation ו Gal4 מבוסס Enhancer מלכודת קווי דג הזברה

מניפולציה של פונקציית ג'ין Cavefish מקסיקני

Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה.

ויזואליזציה של הפעילות החשמלית הסלולר עוברי מוקדם דג זברה, גידולים

תיוג פלואורסצנטי להמחשת חלבונים בעלי ביטוי נמוך בדג הזברה

תיוג פלואורסצנטי להמחשת חלבונים בעלי ביטוי נמוך בדג הזברה