אנו מודים לד&quot;ר ג&#39;ניפר Emtage לקריאה ביקורתית של כתב היד, ריאן גיל לקבלת סיוע טכני ולעזור בטיפול דג הזברה וד&quot;ר סטיבן ג Ekker (Mayo Clinic, Rochster, מינסוטה) לחומרים כימיים. העבודה שלנו כבר נתמכה על ידי אוניברסיטת טמפל המכללה למדע והטכנולוגיה והמכון הלאומי לבריאות (R01-HD061749).

1. ייצור של דור F0 ידי Microinjection של מלכודת ג&#39;ין. מצאנו כי עוברים של רקע גנטי שונה להציג טולרנסים שונים להליך זה, עם סוג בר המבוסס על חיית המחמד של החנות וטובינגן - ארוך סנפיר (TLF) להיות הסובלני ביותר בזמן שיש לי זני AB ו טובינגן הישרדות עני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של ה-DNA transposon. הכן GBT-B1 (pDB783, Balciuniene et al. בהכנה) פלסמיד דנ&quot;א באמצעות ערכה סטנדרטית miniprep QIAprep (Qiagen 27106). זה חיוני כדי לכלול את צעד PB לשטוף (שהוא אופציונלי בהליך QIAprep), אחרת את ה-DNA miniprep יהיה מזוהם על ידי RNase, שמובילה להידרדרות של mRNA transposase. לפני הזריקה, לדלל את ה-DNA במי RNase חינם (Ambion AM9937) ל10 ng / μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של ה-mRNA transposase. Linearize pT3TS/Tol2 (pDB600) 13 באמצעות XbaI ולתמלל את ה-DNA לינארית באמצעות T3 מכונת mMessage(Ambion AM1348) בערכת שעתוק במבחנה. יש לנו שונה תגובת שעתוק במבחנה על ידי הוספת 0.5 μl של מעכב RiboLock RNase (ThermoFisher Fermentas EO0381). לאחר שלב טיפול DNase, לטהר mRNA באמצעות ערכת RNeasy MinElute (Qiagen 74204). להעריך את איכות במבחנה mRNA עיבד ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose. לדלל את ה-mRNA במי RNase חינם ל40 ng / μl, וחנות כ2 aliquots μl ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תערובת microinjection. לפני הזריקה, להוסיף 8 μl של ה-DNA transposon המדולל לaliquot 2 μl של mRNA transposase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microinjection. הזרק 3 NL של תערובת ה-DNA / RNA לחלמון של 1 עוברי דג הזברה סלולרי תוך שימוש בטכניקות microinjection סטנדרטיים, במטרה לממשק החלמון / blastomere. איסוף עובר כל 20 דקות כדי להבטיח הזרקה בשלב תא 1. מניסיוננו, אדם מיומן יכול בקלות להזריק 1,000 עוברים ב1-1.5 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הזרקה, להפעיל 5 μl של שמאלעל פתרון הזרקה על 1% agarose ג&#39;ל לבקרת איכות, על מנת להבטיח כי mRNA transposase לא מושפל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול עובר מוזרק. בשעתי אחר הצהריים מאוחרות, להסיר עובר מופרה ולא נורמלי ולהפיץ את העוברים ל60-80 ל100 מ&quot;מ צלחת פטרי. עוברים נורמליים ומתים יוסרו ביום 1 לאחר הפריה (DPF), 2 DPF ו3 DPF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקרנה לביטוי ה-GFP. עוברי מסך ללא פגמים גלויים לקרינת ה-GFP ב3 DPF (איור 3). הקרנה ניתן לעשות זאת גם בסטראו מצויד בקרינה (אנו משתמשים ניקון SMZ1500) או במיקרוסקופ זקוף (אנו משתמשים AxioImager Zeiss עם מטרת 5X Fluar). ביטוי נמוך של GFP מציין הזרקה או השפלה של RNA transposase כושלים בשל זיהום RNase (איור 3 א). בחר כ 30% מהעוברים המבריקים אשר גם לי הביטוי של GFP ברקמות מרובות או באחוז גבוה של תאים של רקמות ספציפיות (השווה Figures 3B ו 3 ג). מהזרקה של 1,000 עוברים, יש לנו בדרך כלל עד 100 גבוהים-GFP-לבטא עוברים התפתחותית נורמלים,. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם עוברי F0 נבחרו באמצעות נהלי גידול דג הזברה רגילים. סביר לצפות כי 20-30% מהעוברים המוזרקים שנבחרו לגידול יגיעו לבגרות. </li></ol> 2. תחזוקה של כטב&quot;מ: mRFP בודק קו. יש לנו שנוצר 14xUAS: קו mRFP סומן על ידי γCry עדשה ספציפית: ה-GFP. מאז כטב&quot;מ כפוף להשתקה באמצעות מתילציה DNA, חשוב לבחור דגים עם רמות נמוכות של השתקה כדי להפיץ את המניות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת כטב&quot;מ בודד: הומוזיגוטים mRFP להזדווגות עם אחד מקווי Gal4 אמין ביותר שלנו מלכודת גן, tpl6 NSF (Balciuniene ואח&#39; בהכנה.). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום למחרת, להעביר את כטב&quot;מ: דגי mRFP אשר נתנו עוברים למכלי סטטית בודד, בעוד העוברים נאספיםוניקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברי מסך של ה-GFP וקרינת RFP בDPF 1 ו -3 DPF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגי Intercross אשר נתנו עוברים עם ביטוי גבוה mRFP להקים את הדור הבא של כטב&quot;מ: קו mRFP. </li></ol> 3. הקרנה של דגי F0. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחצות F0 הפרטני עם כטב&quot;מ הומוזיגוטים: דגי mRFP (איור 4). אנחנו בדרך כלל להזריק GBTs לקווים עם דפוסי wild-type או פיגמנטציה נמר, וכטב&quot;מ הומוזיגוטים שלנו: קו mRFP הוא ברקע פליז. לכן דגי F0 הזריקו-GBT ניתן להבחין בקלות מכטב&quot;מ: דגי mRFP, ומבטל את הצורך ברישום אם F0 שהוקרן היה זכר או נקבה, כמו גם שגיאות אפשריות הנובעות מטעויות בהקלטה ו / או לקביעת מינו של כל דגים. אנשים עם ניסיון מוגבל מאוד, סטודנטים לתואר הראשונים כאלה, ולכן הם מסוגלים להקים ולפרק את הזדווגויות דגים. גישה זו יש חסרון, כי שני רקע גנטי שונהבשימוש, שעלול לסבך את הפרשנות של אובדן פנוטיפים פונקציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום למחרת, להחזיר את כטב&quot;מ פליז: דגי mRFP לטנק שלהם. מניחים את דגי F0 אשר נתנו עוברים למכלי סטטית בודד (אנו משתמשים Hagen Exo Terra Faunarium קטן, אבל כל טנק קטן יכול לשמש למטרה זו) בזמן שעוברים נאספים והוקרנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים נקיים והעברה נאספו לתוך צלחות פטרי חדשות (&lt;100 לכל צלחת) בשעתי אחר הצהריים של יום: 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברי מסך של ה-GFP וקרינת RFP ב1 DPF, 2 DPF ו3 DPF. משוך עוברים חיוביים עבור שניהם ה-GFP ו RFP החוצה, למיין אותם לפי ה-GFP / דפוס ביטוי RFP (אם תבנית יותר מפעם אחת הוא ציין במצמד) ולגדל אותם להקים דור F1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את דגי F0 אשר מיוצרים רק עוברים שליליים (מתוך מספר כולל של 50-100 עוברים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחצות את דגי F0 שהפיק ה-GFP / צאצאי RFP חיובי שוב כדי לקבל את מנה שנייה של תוצאות חיוביות. </li></ol> 4.הקרנה של דגי F1. דגי F1 מוקרנים להקים משפחות F2, כדי לתעד את דפוס ביטוי מלכודת הגן ולהקפיא קבוצות של עוברים לזיהוי מולקולרי של לוקוסי מלכודת גן על ידי 5 גזע &#39;והפוך ה-PCR. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחצות דגי F1 פרטניים עם כטב&quot;מ הומוזיגוטים: דגי mRFP (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, הנח את דג F1 שנתן עוברים למכלי סטטית בודד ואילו העוברים נאספים והוקרנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברי מסך של ה-GFP וקרינת RFP ב1 DPF, 2 DPF ו3 DPF. עוברים נפרדים ולצלם חיוביים עבור שני GFP ו24 RFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשעת 5 DPF, להקפיא קבוצות של RACE 20 GFP / RFP-חיובי ו20 GFP / עוברי RFP-שלילי לזיהוי גנים שעברו מוטציה insertionally ידי PCR ההפוך ו5 &#39;9,10. להעלות את ה-GFP / עוברי RFP חיובי שנותרו להקים דור F2. </li></ol>

<ol>
	<li>Balciunas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer+trapping+in+zebrafish+using+the+Sleeping+Beauty+transposon.">Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon.</a> BMC Genomics. 5 (1), 62 (2004).</li><li>Trinh le, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+gene+trap+to+visualize+and+interrogate+the+function+of+the+vertebrate+proteome.">A versatile gene trap to visualize and interrogate the function of the vertebrate proteome.</a> Genes Dev. 25 (21), 2306-2320 (2011).</li><li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish.">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Dev Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li><li>Emelyanov, A., Parinov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mifepristone-inducible+LexPR+system+to+drive+and+control+gene+expression+in+transgenic+zebrafish.">Mifepristone-inducible LexPR system to drive and control gene expression in transgenic zebrafish.</a> Dev Biol. 320 (1), 113-121 (2008).</li><li>Ellingsen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+enhancer+detection+in+the+zebrafish+genome.">Large-scale enhancer detection in the zebrafish genome.</a> Development. 132 (17), 3799-3811 (2005).</li><li>Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Gal4+genetics+for+permanent+gene+expression+mapping+in+zebrafish.">Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13365-13370 (2009).</li><li>Davison, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+from+Gal4-VP16+transgenic+insertions+for+tissue-specific+cell+labeling+and+ablation+in+zebrafish.">Transactivation from Gal4-VP16 transgenic insertions for tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish.</a> Dev Biol. 304 (2), 811-824 (2007).</li><li>Sivasubbu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-breaking+transposon+mutagenesis+reveals+an+essential+role+for+histone+H2afza+in+zebrafish+larval+development.">Gene-breaking transposon mutagenesis reveals an essential role for histone H2afza in zebrafish larval development.</a> Mech Dev. 123 (7), 513-529 (2006).</li><li>Clark, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+protein+trapping+produces+a+functional+expression+codex+of+the+vertebrate+proteome.">In vivo protein trapping produces a functional expression codex of the vertebrate proteome.</a> Nat Methods. 8 (6), 506-512 (2011).</li><li>Petzold, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+response+genetics+in+the+zebrafish.">Nicotine response genetics in the zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18662-18667 (2009).</li><li>Gaiano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+and+rapid+cloning+of+essential+genes+in+zebrafish.">Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish.</a> Nature. 383 (6603), 829-832 (1996).</li><li>Amsterdam, A., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+strategies+in+zebrafish+for+identifying+genes+involved+in+development+and+disease.">Mutagenesis strategies in zebrafish for identifying genes involved in development and disease.</a> Trends Genet. 22 (9), 473-478 (2006).</li><li>Balciunas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+a+high+cargo-capacity+transposon+for+genetic+applications+in+vertebrates.">Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates.</a> PLoS Genet. 2 (11), e169 (2006).</li><li>Urasaki, A., Morvan, G., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+dissection+of+the+Tol2+transposable+element+identified+the+minimal+cis-sequence+and+a+highly+repetitive+sequence+in+the+subterminal+region+essential+for+transposition.">Functional dissection of the Tol2 transposable element identified the minimal cis-sequence and a highly repetitive sequence in the subterminal region essential for transposition.</a> Genetics. 174 (2), 639-649 (2006).</li><li>Haffter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+genes+with+unique+and+essential+functions+in+the+development+of+the+zebrafish,+Danio+rerio.">The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 1-36 (1996).</li><li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+315+genes+essential+for+early+zebrafish+development.">Identification of 315 genes essential for early zebrafish development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12792-12797 (2004).</li><li>Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+Gal4-UAS+technique+for+targeted+gene+expression+in+the+zebrafish.">Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish.</a> Mech Dev. 80 (2), 153-158 (1999).</li><li>Koster, R. W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+transgene+expression+in+living+zebrafish+embryos.">Tracing transgene expression in living zebrafish embryos.</a> Dev Biol. 233 (2), 329-346 (2001).</li><li>Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+double-strand+breaks+into+the+genome+of+mouse+cells+by+expression+of+a+rare-cutting+endonuclease.">Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease.</a> Mol Cell Biol. 14 (12), 8096-8106 (1994).</li><li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish.">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li><li>Lisby, M., Mortensen, U. H., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+multiple+DNA+double-strand+breaks+at+a+single+Rad52+repair+centre.">Colocalization of multiple DNA double-strand breaks at a single Rad52 repair centre.</a> Nat Cell Biol. 5 (6), 572-577 (2003).</li><li>Bennardo, N., Cheng, A., Huang, N., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative-NHEJ+is+a+mechanistically+distinct+pathway+of+mammalian+chromosome+break+repair.">Alternative-NHEJ is a mechanistically distinct pathway of mammalian chromosome break repair.</a> PLoS Genet. 4 (6), e1000110 (2008).</li><li>Rehn, K., Wong, K. S., Balciunas, D., Sumanas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+enhancer+trap+line+recapitulates+embryonic+aquaporin+1a+expression+pattern+in+vascular+endothelial+cells.">Zebrafish enhancer trap line recapitulates embryonic aquaporin 1a expression pattern in vascular endothelial cells.</a> Int J Dev Biol. 55 (6), 613-618 (2011).</li><li>Petzold, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCORE+imaging:+specimen+in+a+corrected+optical+rotational+enclosure.">SCORE imaging: specimen in a corrected optical rotational enclosure.</a> Zebrafish. 7 (2), 149-154 (2010).</li><li>Akitake, C. M., Macurak, M., Halpern, M. E., Goll, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenerational+analysis+of+transcriptional+silencing+in+zebrafish.">Transgenerational analysis of transcriptional silencing in zebrafish.</a> Dev Biol. 352 (2), 191-201 (2011).</li><li>Boniface, E. J., Lu, J., Victoroff, T., Zhu, M., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FlEx-based+transgenic+reporter+lines+for+visualization+of+Cre+and+Flp+activity+in+live+zebrafish.">FlEx-based transgenic reporter lines for visualization of Cre and Flp activity in live zebrafish.</a> Genesis. 47 (7), 484-491 (2009).</li><li>Skarnes, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+public+gene+trap+resource+for+mouse+functional+genomics.">A public gene trap resource for mouse functional genomics.</a> Nat Genet. 36 (6), 543-544 (2004).</li><li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+delivery+and+gene+expression+in+zebrafish+using+the+Sleeping+Beauty+transposon.">Efficient gene delivery and gene expression in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon.</a> Dev Biol. 263 (2), 191-202 (2003).</li></ol>

מחברים אלה אין לחשוף.

וקטורי מלכודת הגן והמתודולוגיה מתוארים כאן כבר נמצאים בשימוש במספר מעבדות עצמאיות. מניסיוננו, יש שני שלבים קריטיים בתהליך. הצעד הקריטי הראשון הוא להשיג שיעור גבוה של אינטגרציה מלכודת גן בעוברי F0 מוזרק. כישלון בשלב זה לעתים קרובות ניתן לייחס לזיהום RNase של ריאגנטים ההזרקה, במיוחד את ה-DNA miniprep. זה גם מאוד חשוב להזריק עוברים בשלב התא 1 לניסויי מלכודת גן. מניסיוננו, transgenesis בתיווך Tol2 הוא יעיל מאוד, מה שהופך אותו ניתן להשיג קווים מהונדסים גם כאשר הזרקה תאוחר משלב התא 1 או עם ה-DNA באיכות נמוכה יותר. זריקות ירודים הן הרבה יותר בעייתי בעת ביצוע mutagenesis מלכודת גן, שכן רק חלק קטן של אינטגרציות וקטור לגרום לאירועי מלכודת גן יעילים. השלב הקריטי השני הוא לברר אירועי מלכודת גן על ידי חצייה לכטב&quot;מ שלנו: קו mRFP. העדר ביטוי mRFP הואכמעט תמיד מעיד על אירוע מלכודת משפר. עם זאת, לעתים חוסר ביטוי mRFP עשוי להצביע על השתקה של 14x כטב&quot;מ. לכן חשוב לשמור על כטב&quot;מ: קו mRFP במדינה שאינה מושתק על ידי הפצת הדור הבא באמצעות אנשים עם ביטוי הגבוה RFP כאשר חצו לtpl6 NSF. אנחנו יכולים לחזות מה שהופך את מספר שיפורים לוקטורי מלכודת הגן שלנו ופרוטוקול. הראשון הוא להשתמש בכטב&quot;מ פחות חוזר על עצמו במבנה מלכודת הגן. הוכח שכטב&quot;מ 5x מספיק כדי להשיג הפעלה מלאה בניסויי תרבית תאים, וכי רצפי כטב&quot;מ פחות חוזר על עצמו הם פחות רגישים למתילציה והשתקת 6,25. זה יכול להיות גם אפשרי לעצב וקטורי מלכודת גן לmutagenesis המותנה באופן מלא, באנלוגיה לווקטורים בשימוש על ידי קונסורציום מלכודת גן העכבר הבינלאומי ולאחרונה מותאמים לדג זברה 2,26,27. שיפור נוסף יהיה להשתמש t שונהמערכת ransposon, למשל יפהפה נרדמת 28, כדי לייצר כטב&quot;מ: קו כתב mRFP. זה יאפשר הזרקה של מלכודות גן מבוססות Tol2 ישירות לתוך קו הכתב וההקרנה של F0s ידי incrossing. יתר על כן, זה היה מונע את השימוש בשני רקע גנטי שונה, מה שהופך את הפרשנות של אובדן פנוטיפים פונקציה פשוטה יותר. אפילו עם שיפורים אלה, פרוטוקול מלכודת גן הכללי Gal4 הוצג כאן עדיין יהיה ישים באופן מלא.

mutagenesis insertional הוכיח להיות גישה רבת עוצמה כדי לנתח תפקוד גן במערכות מודל שונים מיצורים חד תאיים כמו חיידקים ושמרים ליצורים רב תאיים כגון עכברים וצמחים. כל ה-DNA אקסוגני (וירוס, transposon או פלסמיד) עשוי לשמש mutagen ידי לקטוע מרכיבים חיוניים של גנים כגון אקסונים או יזמים. היעד האפקטיבי של גישות פשוטות כזו הוא קטן ביותר בגנום גדול ומורכב, שכן אקסונים מהווים רק 1-3% מהגנום חוליות טיפוסיים. גודל היעד אפקטיבי קטן ניתן להתגבר על ידי שיעורי אינטגרציה גבוהה מאוד וקטורית, כפי שהודגם על ידי ההצלחה האדירה של mutagenesis insertional רטרווירלי ב11,12 דג הזברה. לעומת זאת, אינטרונים מהווים כ 20-30% מהגנום חוליות. בדג זברה, וקטורי mutagenesis insertional מבוסס transposon אשר למעשה להציג null או מוטציות hypomorphic חמורות על השתלבות אינטרונים כבר בשם &quot;transposo גן השבירהNS &quot;(GBTs) 8-10. לאינטגרצית מלכודת גן יעילה, הם משתמשים transposon Tol2 מינימאלי 13,14. Mutagenicity של GBTs מסתמך על acceptor אחוי המופק מדג ורצפי הסיום / polyadenylation תעתיק. האלמנטים אחראים להמוטגניות GBT נמצאים לצד על ידי אתרי loxP ישירים לכריתה על ידי recombinase Cre. לכן, הזרקה של Cre mRNA מובילה להחזרה יעילה של מוטציות הנגרמות GBT, למרות שכמה רצפי transposon יישארו במוקד האינטגרציה 9,10. וקטורי GBT פורסמו לאחרונה להשתמש mRFP כ9,10 כתב מלכודת הגן, מה שמוביל לשני חסרונות פוטנציאליים. ראשית, זה לא ידוע מה חלק של הגנים דג הזברה באים לידי ביטוי ברמה מספיק גבוהה כדי להיות מזוהה על ידי חלבוני היתוך כתב ניאון ישירים. שנית, קבוצה קטנה בלבד של גנים צפויים להיות להם פונקציות חיוניות. הערכה הוא שיש רק 1,400-2,400 הגנים דרושים developme דג הזברהNT 15,16. רוב מוטציות מלכודת הגן אינן צפויות להציג פנוטיפים גלויים ולכן תהיה בעלת תועלת מוגבלת. כדי להתגבר על שתי המגבלות האלה, יש לנו שונה GBT-R15 9,10 לשימוש עם Gal4-VP16 ככתב מלכודת גן הראשוני (Balciuniene et al. בהכנה). כמו באוגוסט פחות mRFP בGBT-R15, אתר תחילת התרגום הוסר מGal4-VP16. לגילוי ישיר של אירועי מלכודת גנים, הווקטורים שלנו מכילים כתב eGFP תחת שליטתו של 14x Gal4 כטב&quot;מ 17,18. כמה תכונות נוספות מתוכננות לוקטור מלכודת גן bipartite שלנו. כטב&quot;מ: קלטת eGFP הוא מוקף אתרים ישירים FRT (דרגות אפורות באיור 1). הזרקה של FLP recombinase mRNA מובילה לכריתה של כטב&quot;מ: קלטת eGFP, עוזבת את המוטציה מלכודת גן סימן וזכרה לקרינה eGFP. זה לאחר מכן ניתן להשתמש בקווים מהונדסים שיסמנו רקמות ספציפיות או אירועים התפתחותיים על ידי הקרינה ה-GFP. כמו באחריםGBTs, כל קלטת מלכודת גן מוקפת אתרים ישירים loxP (מחומשים פתוחים באיור 1). זה עושה את אירועי מלכודת הגן הפיכים על ידי ביטוי של recombinase Cre, קלות הקמת הוכחת יחסי סיבתיות בין אינטגרציה מלכודת גן ספציפית וציין פנוטיפ (איור 2). לבסוף, את קלטת מלכודת גן מוקפת אתרים הפוכים I-SCEI meganuclease (משולשים שחורים באיור 1). בדרוזופילה, אינטגרציות transposon נהוגות להמיר למחיקות (ליקויים) על ידי כריתה מדויקת של אלמנט P. אין ראיות לכך שכריתה של transposon Tol2 (או כל transposon אחר הפועל בבעלים חוליות כגון יפהפה נרדמת, PiggyBac או AC / DS) יכולה להוביל למחיקות. לפיכך, אנו כללנו אתרי I-SCEI כשיטה פונדקאית פוטנציאלית לגיוס של מחיקות, למרות שאין כל הוכחה שאני-SCEI יכול לגרום למחיקות בדג זברה. יש לציין כי בעוד שמגה I-SCEInuclease ניתן להשתמש כדי להקל על transgenesis בדג זברה, מחשוף ה-DNA על ידי meganuclease I-SCEI משמש ללמוד מנגנוני תיקון DNA, כוללים מועדת לטעויות שאינן הומולוגיים סוף להצטרף, בשמרים ובתאי יונקים 19-22. שילוב של וקטור מלכודת הגן שלנו יכול להוביל לביטוי eGFP ידי שני מנגנונים שונים. הראשון הוא אירוע מלכודת גן אמיתי (איור 1 ג): הווקטור משתלב גן (IMG לInsertionally מוטציה גנטי), תמליל היתוך בין 5 &#39;לפרוטוקול IMG אנדוגני וGal4-VP16 הוא עשה ותורגם ל חלבון היתוך המכיל N-הסופית של החלבון מקודד על ידי IMG וGal4-VP16. חלבון היתוך זה נקשר ל14x כטב&quot;מ ומפעיל שעתוק של eGFP. האירוע השני, פחות הרצוי הוא מלכודת משפר (1D איור): האמרגן המינימלי מול eGFP נופל תחת שליטתו של משפר סמוך לאתר האינטגרציה, מה שמוביל לייצור של eGFP בabהיגיון של ייצור Gal4-VP16. להערכתנו, 30-50% מאירועי ביטוי eGFP הן בשל מלכודת משפר ו50-70% הם תוצאה של מלכודת גן 23 (Balciuniene et al. בהכנה). כדי להבחין בין שני סוגים של אירועים אלה, עשינו 14xUAS: קו מהונדס mRFP (איור 1), לנוחיות בסימן γCry עדשה ספציפית: (. Balciuniene ואח&#39; בהכנה) ה-GFP. אירועי מלכודת הגן מאומתים על ידי שיתוף ביטוי של ה-GFP וRFP (השווה C ו-D באיור 2). במסך הטייס שלנו, התאוששו מעל 40 אירועי מלכודת גן לאחר הקרנת 270 דגי F0 הוזרקו תערובת של דנ&quot;א transposon וmRNA transposase. שתיים מאינטגרציות מלכודת הגן שלנו התרחשו בגנים עם מוטציות כימית המושרה שפורסמו בעבר: NSF וFLR. פנוטיפים של tpl6 מוטציות insertional NSF וtpl24 FLR הם נבדלים באופן שטחי מפנוטיפים של מוטציות כימית המושרה המקבילות. אנחנו גם ציינו כי אירועי מלכודת הגן יופיעו עם נטייה לאינטרונים ליד הקצה &#39;5 של גנים, ובכך להגדיל את ההסתברות של אללים null. אנחנו עדיין צופים מידה מסוימת של השתקת כטב&quot;מ (ססגון) בכל קווי מלכודת הגן שלנו, וכמה לוקוסים הם באופן ברור יותר רגישים ססגון יותר מאחרים. אנחנו לא מאמינים שהשתקת כטב&quot;מ היא בעיה משמעותית עבור התפשטות של קווי מלכודת הגן, כפי שהצלחנו להפיץ את כל קווי מלכודת הגן שלנו בקלות דרך לפחות חמישה דורות על ידי בחירה לביטוי של GFP לבד.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog #</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Miniprep Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>27104</td>
 <td>Optional PB wash step is a must</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>XbaI restriction enzyme</td>
 <td>ThermoFisher</td>
 <td>ER0681</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>mMessage Machine T3</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM1348</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RiboLock RNase Inhibitor</td>
 <td>ThermoFisher</td>
 <td>EO0381</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNeasy MinElute</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>74204</td>
 <td>Can be replaced by phenol extraction 			and precipitation. Do not use LiCl!</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nuclease-free water</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM9937</td>
 <td>Has to be non-DEPC treated</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Borosilicate glass capiliaries for 			microinjection needles</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>1B100F-4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcapiliaries for calibration</td>
 <td>Drummond Scientific </td>
 <td>1-000-0010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microloader tips</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5242 956.003</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Needle puller *</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>P-87</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereomicroscope 			for microinjection * </td>
 <td>Nikon </td>
 <td>SMZ1500</td>
 <td>We also use Wild 5M and Olympus SZ61 			with transmitted light stand</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Picoinjector *</td>
 <td>Harvard Instruments</td>
 <td>Pli-90</td>
 <td>We also use Pli-100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Screening microscope with GFP/RFP 			fluorescence *</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>Zeiss AxioImager</td>
 <td>5X Fluar objective has sufficient 			working distance</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Screening microscope with GFP/RFP 			fluorescence *</td>
 <td>Nikon </td>
 <td>SMZ1500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>* We suggest this equipment only because we successfully use it in our laboratory. In each category, several comparable options from multiple manufacturers are available.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

gene trapping using gal4 in zebrafish

גודל מצמד גדול והתפתחות חיצונית של עוברים שקופים אופטי להפוך את דג הזברה מערכת מודל חוליות יוצאת דופן עבור mutagenesis insertional in vivo באמצעות כתבי ניאון לתייג ביטוי של גנים שעברו מוטציה. מספר מעבדות שנבנו ונבדקו וקטורים משפר וגן המלכודת בדג זברה, באמצעות חלבוני ניאון, מפעילי תעתיק מבוסס LexA Gal4-וככתבי 1-7. היו לי וקטורים אלו שני חסרונות פוטנציאליים: ההחמרה הכי מוצלח (למשל חוסר היכולת להבחין בין אירועים משפר וגן המלכודת) והמוטגניות נמוכה (למשל אינטגרציות לגנים לעתים נדירות המיוצרים אללים null). גן Breaking transposon (GBTs) פותחו כדי לטפל בחסרונות הללו 8-10. יש לנו שונה אחד מוקטורי GBT הראשונים, GBT-R15, לשימוש עם Gal4-VP16 ככתב הראשי של מלכודת גן וכטב&quot;מ הוסיף: eGFP ככתב המשני לגילוי ישיר של אירועי מלכודת הגן.pplication של Gal4-VP16 ככתב מלכודת גן הראשוני מספק שני יתרונות עיקריים. ראשית, היא מגבירה את הרגישות לגנים לידי ביטוי ברמות ביטוי נמוכים. שנית, היא מאפשרת לחוקרים להשתמש בקווי מלכודת גן כמו נהגי Gal4 לביטוי ישיר של transgenes האחר ברקמות ספציפיות מאוד. זה רלוונטי במיוחד לגנים עם פונקציות שאינן חיוניות או מיותר, שבו האינטגרציה מלכודת גן עשויה שלא לגרום לפנוטיפים גלויים. החסרון של שימוש Gal4-VP16 ככתב מלכודת הגן העיקרי הוא שהגנים מקודדים לחלבונים עם רצפי אות N-מסוף אינם ניתנים להשמנה, כמו חלבוני היתוך Gal4-VP16 וכתוצאה מכך צפויים להיות מסוגלת להיכנס לגרעין ולהפעיל שעתוק. חשוב מכך, השימוש בGal4-VP16 לא מראש לבחור עבור חלבונים גרעיניים: אנו התאוששו מוטציות מלכודת גן בגני מקודדי חלבונים המתפקדים בגרעין, ציטופלסמה ואת קרום הפלזמה.

בזריקה מוצלחת, לפחות 80% מהעוברים הוזרקו תערובת mRNA מלכודת גן ה-DNA / Tol2 transposase להציג מידה מסוימת של הקרינה ה-GFP (איור 3). כאשר עוברי GFP החיובי הבהירים (איור 3 ג) נבחרו להקים את בריכת F0, אחד מכל 10 דגי F0 הוקרנו יניבו צאצאי מלכודת גן. בין דגי F0 ממנו אירועי מלכודת הגן הם התאוששו, רוב לשדר אירוע מלכודת גן יחיד, בנוסף לכמה אינטגרציות transposon שאינו מבטאות. עם זאת, יש לנו שהוקמו עד ארבעה קווי מלכודת גן מאדם F0 אחת. דפוסי ביטוי של GFP / RFP בקווי מלכודת גן נעים בין מאוד רקמות ספציפיות (לדוגמא בנורות חוש הריח) לכל מקום בצורה הוגנת. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1.jpg" /> איור 1. Tהוא Gal4 המכיל וקטור מלכודת גן bipartite GBT-B1 והיישומים שלה. א רכיבים של וקטור מלכודת גן Gal4 המכיל: Tol2 5 &#39;וTol2 3&#39;, transposon Tol2 המינימלי מסתיים 13; acceptor אחוי β-אקטין CSA, קרפיון 8; ^ Gal4-VP16, Gal4-VP16 אוגוסט פחות; זף ( א), β-אקטין UTR &#39;3 דג הזברה ופולי () אלמנטים מGBT-R15 9,10. 14XUAS, eGFP וp SV40 () הם מרכיבים של כטב&quot;מים: 17,18 קלטת ביטוי eGFP. החץ מציין הפעלה של כטב&quot;מ: eGFP ידי Gal4-VP16 מיוצר על ידי מלכודת הגן ב 14XUAS:. Transgene mRFP סומן על ידי γCry עדשה ספציפית: קלטת ה-GFP. החץ מציין הפעלה של כטב&quot;מ: mRFP ידי Gal4-VP16 באירוע מלכודת ג &#39;ין טראנס.. קופסות כחולים הן אקסונים. שחבור מצויינים על ידי קו מקווקו. אירוע מלכודת ד Enhancer. אינטגרציה של הווקטור ליד משפר (קופסא חומה) עשויה להציב אמרגן eGFP המינימלי תחת שליטתו של משפר זו (חץ חום<html> ). הדבר יביא לביטוי רקמות הספציפיות של eGFP, אבל מאז Gal4-VP16 לא נעשה, ביטוי mRFP לא יופעל. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2.jpg" /> איור 2. חזרה של אירועי מלכודת הגן באמצעות recombinase Cre. , ב &#39;תרשים של מוטציה מלכודת גן () ואלל מלכודת הגן חזר-Cre (ב&#39;). C, D. שיתוף ביטוי של ה-GFP (C) וRFP (ד &#39;) במערכת העצבים של גן tpl6 NSF שורת מלכודת. E, הזרקת פ של Cre-RNA לעוברי tpl6 NSF מובילה לאובדן של ה-GFP (E) וRFP ביטוי (F). שים לב שאין ירידה של ביטוי ה-GFP בעדשה, כצפוי. r.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig3.jpg" /> איור 3. עוברים מוזרק עם מלכודת גן GBT-B1 (pDB783). . א עוברים הוזרקו pGBT-B1 GFP הקרינה קטנה תצוגה לבד בגוף B (pDB783), ק העוברים הוזרקו mRNA pGBT-B1 וTol2 transposase: קבוצה אקראית של עוברים (ב &#39;) וגבוה expressors שנבחר לגידול (C). <img alt="איור 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4.jpg" /> איור 4. מתווה ניסוי להקמת קווי מלכודת גן Gal4. מבני אדום / ירוק חלקית חופפים מצביעים על שיתוף ביטוי של ה-GFP וRFP, בעוד ירוק לבד מציין פסיפס לאירועי מלכודת גן או מלכודת משפר.

Watch this Scientific Journal Video about Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish at JoVE.com

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

פרוטוקול זה מתאר השיטה של ​​mutagenesis insertional מלכודת הגן באמצעות Gal4-VP16 ככתב הראשי וה-GFP / RFP ככתבים משניים בדג זברה. בערך אחד מעשרה צאצאי מלכודת גן תשואת דגי F0-להביע גבוה שיתוף להביע GFP וRFP. הליך המיון וניתן לשנות בקלות כדי להתאים לגודל של המעבדה מבצעת את מסך mutagenesis insertional.

גן השמנה באמצעות Gal4 בדג הזברה

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

Research

JoVE Journal

Biology

18.1K Views.  Temple University.  פרוטוקול זה מתאר השיטה של ​​mutagenesis insertional מלכודת הגן באמצעות Gal4-VP16 ככתב הראשי וה-GFP / RFP ככתבים משניים בדג זברה. בערך אחד מעשרה צאצאי מלכודת גן תשואת דגי F0-להביע גבוה שיתוף להביע GFP וRFP. הליך המיון וניתן לשנות בקלות כדי להתאים לגודל של המעבדה מ?...

Video: Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjection של עוברי דג הזברה לנתח פונקציה ג&#39;ין

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Gene Expression גלובל ניתוח באמצעות פלטפורמה דג הזברה microarray oligonucleotide

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

שימוש ג&#39;ין Pulser מערכת MXcell electroporation כדי Transfect תאים ראשוניים עם יעילות גבוהה

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

שימוש מונה תא אוטומטי כדי לפשט את הביטוי מחקרים ג&#39;ין: siRNA מציאה הביטוי IL 4-Gene תלויים תאים Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

אינדוקציה ובדיקה של היפוקסיה בתרבות התא

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך הרשתית דג הזברה למבוגרים

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

הבידוד של הריבוזום פוליפפטידים המתהווה כרוכים<em&gt; במבחנה</em&gt; כדי לזהות אתרים השהה של תרגום לאורך ה-mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

באמצעות רצף מעצר SecM ככלי לבודד פוליפפטידים כרוכים הריבוזום

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavaging דג הזברה למבוגר

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

מהירה ויעילה דג הזברה Genotyping באמצעות PCR עם רזולוציה גבוהה ממיסים ניתוח

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...