הפרוטוקול משמעותי מאוד משום שהוא מאפשר שימוש מהיר, קל וישיר בתבניות דנ"א ליניאריות במערכות סינתזת חלבונים נטולות תאים, אפילו מפרמטרים מקוריים של E.coli. היתרונות העיקריים הם כמות הזמן שנחסך על ידי הימנעות משיבוט, שינויים כימיים של קצוות DNA ליניאריים ותוספי הגנה כמו דנ"א גמא או צ'י. מכיוון שתמציות סינתזה המדווחות על עצמן מפותחות עבור אורגניזמים שונים בעלי עניין, השיטה שלנו מציגה דרך להאיץ את יצירת האב-טיפוס בתמציות אלה באמצעות דנ"א ליניארי.
כדי להתחיל, זן פסים BL21 Rosetta-2 דלתא recBCD מ מינוס 80 מעלות צלזיוס גליצרול על צלחת אגר 2x YTP המכילה 10 מיקרוגרם למיליליטר כלורמפניקול ודגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לחסן מושבה אחת מצלחת האגר לקצת יותר מ-40 מיליליטר של 2x YTP בתוספת 10 מיקרוגרם למיליליטר כלוראמפניקול ולדגירה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס עם רעידות של 200 סל"ד. לאחר מכן, צור תת-תרבות על ידי דילול תרבית הלילה 100 פעמים לארבעה ליטרים של מדיית YTP טרייה 2x המכילה 10 מיקרוגרם למיליליטר כלוראמפניקול.
מחלקים את ארבעת ליטר המדיה לארבעה צלוחיות נפרדות. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס, 200 סל"ד, במשך כשלוש עד ארבע שעות של צמיחה כדי להגיע לצפיפות אופטית של 1.5 עד 2.0. שים את התרבית על קרח, לסובב את התאים ב 5, 000 G במשך 12 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להשליך את supernatant על ידי decanting.
לאחר מכן, להשעות את כדורי התא ב 800 מיליליטר של S30A צונן עם DTT. שוב, לסובב את התאים ב 5, 000 G במשך 12 דקות בארבע מעלות צלזיוס כפי שהוכח בעבר ולהשליך את supernatant על ידי decanting. לאחר החייאת כדוריות תאים ב-160 מיליליטר של S30A מצונן עם DTT, העבירו את התאים לצינורות 50 מיליליטר מקוררים ושקלים מראש.
סובבו את התאים ב-2000 G למשך שמונה דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס ואז השליכו את הסופר-נטנט על ידי פירוק. שוב, סובבו את התאים ב-2000 G למשך ארבע דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן הסירו בזהירות את הסופר-נאטנט הנותר באמצעות פיפטה. לאחר מכן, remeasure את המשקל של הצינור כדי לחשב את המשקל של כדור התא ולשמור על כדורי התא במינוס 80 מעלות צלזיוס.
לאחר נטילת כדורי התא ממינוס 80 מעלות צלזיוס, הפשירו אותם על קרח למשך שעה עד שעתיים והחזירו את כדורי התא ב-0.9 מיליליטר של S30A עם חיץ DTT לגרם ממשקל כדור התא. לאחר מכן, פיפטה לאט כדי להשעות את התאים, הימנעות קצף העליון ככל האפשר. מניחים אליקוטים של מיליליטר אחד של התאים המחודשים לתוך מיקרו-צינוריות של 1.5 מיליליטר ושומרים אותם על קרח או בלוק קר מקורר מראש בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, סוניקטור כל צינור בסוניקטור עם הגדרה של 20% משרעת במשך שלושה מחזורים ולסובב את הליזאט ב 12, 000 G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר איסוף supernatant עם פיפטה, להעביר צינור 50 מיליליטר. לדגום את התא ליזאט ב 37 מעלות צלזיוס ב 200 סל"ד תסיסה במשך 80 דקות.
לאחר סיבוב הליזאט ואיסוף הסופרנאטנט במיקרו-צינוריות 1.5 מיליליטר מקוררות מראש, אליקוט 30 מיקרוליטר בצינורות PCR 8 רצועות מקוררים מראש, תוך שמירה על כל הצינורות על הקרח. יש להקפיא את האליקוטים של ליזאט על קרח יבש ולאחסן בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס. הכינו תערובת אב בהתאם ללשונית הכנת החיץ כמתואר בכתב היד.
לקבלת נפח תגובה של 10.5 מיקרוליטר, יש להוסיף 1.05-מיקרוליטר של ריכוזי מלאי שונים של Mg-גלוטמט ו-9.45 מיקרוליטר של תערובת האב ולערבב בעדינות. מפרקים 10 מיקרוליטרים מהתגובות הנ"ל למיקרו-פלטה תחתונה מרובעת בעלת 384 באר ומכסים אותה באמצעות אטם צלחת דבק. מדוד ביטוי גנים כפלט פלואורסצנטי על ידי רישום נתוני פלואורסצנטיות עם קורא צלחות במרווחי זמן קבועים במשך שמונה שעות דגירה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם רעידות מסלוליות רצופות ב-307 מחזורים לדקה.
לאחר זיהוי ריכוז ה-Mg-גלוטמט שמביא לערך הפלואורסצנטי הגבוה ביותר בנקודת הסיום, המשך לכיול K-גלוטמט. הפעל את הניסוי וזהה את הערך הפלואורסצנטי הגבוה ביותר מבין ריכוזי K-גלוטמט שנבדקו, ובכך זיהה את הרכב החיץ האופטימלי עבור Mg-גלוטמט ו- K-גלוטמט עבור ליזאט זה. לאחר קביעת ערכי Mg-גלוטמט ו- K-גלוטמט, הכן צינורות מלאי של הרכב החיץ האופטימלי בהתאם לנפח האצווה המתקבל.
לאחר חישוב מספר צינורות החיץ הדרושים, aliquot 38 microliters לכל צינור ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס. ראשית, תייג מיקרו-צינורית של 1.5 מיליליטר להכנת תערובת מאסטר אופטימלית. מוסיפים את הנפחים הנכונים של המאגר והליזאט ומערבבים אותם בעדינות.
לאחר מכן, פיפטה דגימות הדנ"א תחילה, לאחר מכן מים ללא נוקלאזות, ולבסוף, תערובת האב האופטימלית. ערבבו בעדינות את התגובה נטולת התאים עם פיפטה רגע לפני הוספתם לקורא הצלחות והימנעו מבועות. לאחר הגדרת התגובות בקורא הלוחות, ריצות קינטיות רשמו נתונים פלואורסצנטיים במרווחי זמן קבועים במשך שמונה שעות דגירה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם רעידות מסלוליות רצופות ב-307 מחזורים לדקה.
לאחר כיול הליזאט, הריכוז האופטימלי של Mg-גלוטמט היה דומה בשמונה מילימולר על פני תמציות הן עבור דנ"א ליניארי והן עבור פלסמיד. עם זאת, הריכוז האופטימלי של K-גלוטמט עבור דנ"א פלסמיד הוא 140 מילימולר, ואילו הריכוז האופטימלי של K-גלוטמט עבור דנ"א ליניארי הוא 20 מילימולר. לאחר שלבי כיול, הושוו רמות של ביטויי GFP בין דנ"א ליניארי ופלסמיד בתמציות מסוג בר, דלתא recB ודלתא recBCD.
ביטוי GFP מדנ"א ליניארי הגיע ל-102% ו-138% מהביטוי מדנ"א פלסמיד בתמציות מזני דלתא recB ודלתא recBCD, בהתאמה. הדברים החשובים ביותר בפרוטוקול הם תזה סוניקציונית של התא ושלבי כיול המאגר בנפרד עבור דנ"א ליניארי ופלסמיד, במיוחד בעת שימוש בפרמטרים המקוריים. טכניקה זו תסייע להאיץ את הבדיקה של עיצובים ביולוגיים במערכות ללא תאים, למשל, סינון של ביוסנסורים, אנזימים ומסלולים, או אב טיפוס של מעגלים גנטיים סינתטיים.
