البروتوكول مهم جدا لأنه يتيح الاستخدام السريع والسهل والمباشر لقوالب الحمض النووي الخطي في أنظمة تخليق البروتين الخالية من الخلايا ، حتى من معلمات E.coli الأصلية. المزايا الرئيسية هي مقدار الوقت الذي تم توفيره عن طريق تجنب الاستنساخ ، والتعديلات الكيميائية لنهايات الحمض النووي الخطي والمكملات الغذائية الواقية مثل غاما أو تشي الحمض النووي. نظرا لأنه يتم تطوير مستخلصات توليف ذاتية الإبلاغ لمختلف الكائنات الحية ذات الأهمية ، فإن طريقتنا تقدم طريقة لتسريع النماذج الأولية في تلك المستخلصات باستخدام الحمض النووي الخطي.
للبدء ، سلالة خط BL21 Rosetta-2 delta recBCD من مخزون الجلسرين 80 درجة مئوية تحت الصفر إلى صفيحة أجار 2x YTP التي تحتوي على 10 ميكروغرام لكل ملليلتر كلورامفينيكول وتحضن بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية. ثم ، قم بتلقيح مستعمرة واحدة من صفيحة الأجار إلى ما يزيد قليلا عن 40 ملليلتر من 2x YTP مع استكمال 10 ميكروغرام لكل ملليلتر كلورامفينيكول واحتضان بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز 200 دورة في الدقيقة. بعد ذلك ، قم بعمل ثقافة فرعية عن طريق تخفيف الثقافة بين عشية وضحاها 100 مرة إلى أربعة لترات من وسائط YTP الطازجة 2x التي تحتوي على 10 ميكروغرام لكل ملليلتر كلورامفينيكول.
قسم اللترات الأربعة من الوسائط إلى أربعة قوارير منفصلة. احتضان عند 37 درجة مئوية ، 200 دورة في الدقيقة ، لمدة ثلاث إلى أربع ساعات من النمو للوصول إلى كثافة بصرية من 1.5 إلى 2.0. ضع المزرعة على الجليد ، وقم بتدوير الخلايا عند 5000 جم لمدة 12 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، ثم تخلص من السوبرناتانت عن طريق الصب.
ثم ، أعد تعليق كريات الخلايا في 800 ملليلتر من S30A المبرد باستخدام DTT. مرة أخرى ، قم بتدوير الخلايا عند 5000 G لمدة 12 دقيقة عند أربع درجات مئوية كما هو موضح سابقا وتخلص من supernatant عن طريق الصب. بعد إعادة تعليق كريات الخلايا في 160 ملليلتر من S30A المبردة مع DTT ، انقل الخلايا إلى أنابيب 50 ملليلتر مبردة وموزنة مسبقا.
قم بتدوير الخلايا عند 2000 G لمدة ثماني دقائق عند أربع درجات مئوية ثم تخلص من supernatant عن طريق الصب. مرة أخرى ، قم بتدوير الخلايا عند 2000 G لمدة أربع دقائق عند أربع درجات مئوية ، ثم قم بإزالة السوبر نات المتبقي بعناية باستخدام ماصة. ثم ، أعد قياس وزن الأنبوب لحساب وزن حبيبة الخلية والحفاظ على كريات الخلية عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.
بعد أخذ كريات الخلايا من 80 درجة مئوية تحت الصفر ، قم بإذابتها على الجليد لمدة ساعة إلى ساعتين وأعد تعليق كريات الخلية في 0.9 ملليلتر من S30A مع مخزن مؤقت DTT لكل غرام من وزن حبيبات الخلية. ثم ، ماصة ببطء لإعادة تعليق الخلايا ، وتجنب الزبد العلوي قدر الإمكان. ضع أليكوت واحد ملليلتر من الخلايا المعاد تعليقها في أنابيب دقيقة سعة 1.5 ملليلتر واحتفظ بها على الجليد أو كتلة باردة مبردة مسبقا عند أربع درجات مئوية.
بعد ذلك ، قم بسونيك كل أنبوب في سونيكتور مع إعداد سعة 20٪ لثلاث دورات وقم بتدوير الليزات عند 12،000 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد جمع supernatant مع ماصة ، ونقل إلى أنبوب 50 ملليلتر. احتضان الخلية محللة عند 37 درجة مئوية عند إثارة 200 دورة في الدقيقة لمدة 80 دقيقة.
بعد تدوير الليزات وجمع السوبر ناتانت في أنابيب دقيقة مبردة مسبقا 1.5 ملليلتر ، أليكوت 30 ميكرولتر في أنابيب PCR 8-strip المبردة مسبقا ، مع الحفاظ على جميع الأنابيب على الجليد. قم بتجميد أليكوتس الليزات على الثلج الجاف وتخزينها عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر. قم بإعداد مزيج رئيسي وفقا لعلامة تبويب إعداد المخزن المؤقت كما هو موضح في المخطوطة.
للحصول على حجم تفاعل يبلغ 10.5 ميكرولتر ، أضف 1.05 ميكرولتر من تركيزات مخزون Mg-glutamate المختلفة و 9.45 ميكرولتر من المزيج الرئيسي واخلطه بلطف. ماصة 10 ميكرولترات من التفاعلات المذكورة أعلاه في صفيحة صغيرة مربعة القاع 384 بئر وتغطيتها باستخدام ختم لوحة لاصقة. قم بقياس التعبير الجيني كناتج تألق عن طريق تسجيل بيانات التألق باستخدام قارئ صفائح على فترات منتظمة لمدة ثماني ساعات من الحضانة عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز مداري مستمر عند 307 دورة في الدقيقة.
بعد تحديد تركيز Mg-glutamate الذي ينتج عنه أعلى قيمة فلورية عند نقطة النهاية ، انتقل إلى معايرة K-glutamate. قم بإجراء التجربة وتحديد أعلى قيمة فلورية من بين تركيزات K-glutamate التي تم اختبارها ، وبالتالي تحديد التركيب العازل الأمثل ل Mg-glutamate و K-glutamate لهذا المحللات. بمجرد إنشاء قيم Mg-glutamate و K-glutamate ، قم بإعداد أنابيب المخزون لتكوين المخزن المؤقت الأمثل وفقا لحجم الدفعة التي تم الحصول عليها.
بعد حساب عدد الأنابيب العازلة اللازمة ، قم بتخزين 38 ميكرولتر لكل أنبوب وتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. أولا ، قم بتسمية أنبوب ميكروبوبي سعة 1.5 ملليلتر لإعداد المزيج الرئيسي الأمثل. أضف وحدات التخزين الصحيحة من المخزن المؤقت وتحلل واخلطها بلطف.
ثم ، ماصة عينات الحمض النووي أولا ، تليها المياه الخالية من النوكليز ، وأخيرا ، المزيج الرئيسي الأمثل. امزج التفاعل الخالي من الخلايا بلطف مع ماصة قبل إضافتها إلى قارئ الألواح مباشرة وتجنب أي فقاعات. بعد إعداد التفاعلات في قارئ الصفائح ، سجلت عمليات التشغيل الحركية بيانات التألق على فترات منتظمة لمدة ثماني ساعات من الحضانة عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز مداري مستمر عند 307 دورة في الدقيقة.
بعد معايرة الليزات ، كان التركيز الأمثل ل Mg-glutamate مشابها عند ثمانية ملليمولير عبر مقتطفات لكل من الحمض النووي الخطي والبلازميدي. ومع ذلك ، فإن تركيز K-glutamate الأمثل للحمض النووي البلازميد هو 140 ملليمول ، في حين أن تركيز K-glutamate الأمثل للحمض النووي الخطي هو 20 ملليمولار. بعد خطوات المعايرة ، تمت مقارنة مستويات تعبيرات GFP بين الحمض النووي الخطي والبلازميد في مستخلصات النوع البري ، و delta recB ، و delta recBCD.
وصل تعبير GFP من الحمض النووي الخطي إلى 102٪ و 138٪ من التعبير من الحمض النووي البلازميدي في مقتطفات من سلالات دلتا recB ودلتا recBCD ، على التوالي. أهم الأشياء في البروتوكول هي التحلل الصوتي للخلية وخطوات معايرة المخزن المؤقت بشكل منفصل للحمض النووي الخطي والبلازميد ، خاصة عند استخدام المعلمات الأصلية. ومن شأن هذه التقنية أن تساعد في تسريع اختبار التصاميم البيولوجية في الأنظمة الخالية من الخلايا، على سبيل المثال، فحص أجهزة الاستشعار الحيوية والإنزيمات والمسارات، أو النماذج الأولية للدوائر الجينية الاصطناعية.
