Протокол очень важен, потому что он позволяет быстро, легко и напрямую использовать линейные шаблоны ДНК в бесклеточных системах синтеза белка, даже из нативных параметров E.coli. Основными преимуществами являются количество времени, сэкономленное за счет избегания клонирования, химических модификаций линейных концов ДНК и защитных добавок, таких как гамма или ДНК ци. Поскольку экстракты синтеза самоотчета разрабатываются для различных организмов, представляющих интерес, наш метод представляет собой способ ускорения прототипирования в этих экстрактах с использованием линейной ДНК.
Для начала процедите BL21 Rosetta-2 delta recBCD от запаса глицерина минус 80 градусов по Цельсию на 2-кратную агаровую пластину YTP, которая содержит 10 микрограммов на миллилитр хлорамфеникола и инкубирует в течение ночи при 37 градусах Цельсия. Затем привите одну колонию из агаровой пластины в чуть более 40 миллилитров 2x YTP, дополненных 10 микрограммами на миллилитр хлорамфеникола, и инкубируйте в течение ночи при 37 градусах Цельсия с встряхиванием 200 об/мин. Далее делают субкультуру, разбавляя культуру на ночь 100 раз в четыре литра свежих 2x YTP среды, содержащей 10 микрограммов на миллилитр хлорамфеникола.
Разделите четыре литра среды на четыре отдельные колбы. Инкубируйте при 37 градусах Цельсия, 200 оборотов в минуту, в течение примерно трех-четырех часов роста, чтобы достичь оптической плотности от 1,5 до 2,0. Положите культуру на лед, раскрутите клетки при 5000 г в течение 12 минут при четырех градусах Цельсия, а затем выбросьте супернатант путем декантирования.
Затем повторно суспендируйте гранулы ячейки в 800 миллилитрах охлажденного S30A с DTT. Опять же, раскрутите ячейки на 5000 G в течение 12 минут при четырех градусах Цельсия, как было продемонстрировано ранее, и выбросьте супернатант путем декантирования. После повторного использования клеточных гранул в 160 миллилитрах охлажденного S30A с DTT переместите ячейки в охлажденные и предварительно взвешенные 50-миллилитровые трубки.
Раскрутите ячейки при 2000 G в течение восьми минут при четырех градусах Цельсия, а затем выбросьте супернатант путем декантирования. Опять же, раскрутите клетки при 2000 G в течение четырех минут при четырех градусах Цельсия, а затем осторожно удалите оставшийся супернатант с помощью пипетки. Затем повторно измерьте вес трубки, чтобы рассчитать вес ячейки гранулы и сохранить гранулы ячейки на уровне минус 80 градусов цельсия.
После взятия гранул ячейки от минус 80 градусов Цельсия разморозьте их на льду в течение одного-двух часов и повторно суспендируйте гранулы ячейки в 0,9 миллилитра S30A с буфером DTT на грамм веса ячейки гранулы. Затем пипетка медленно восстанавливает клетки, избегая верхней пены как можно больше. Поместите одномилитровые аликвоты ресуспендированных клеток в 1,5-миллилитровые микротрубки и держите их на льду или предварительно охлажденной холодной глыбе при четырех градусах Цельсия.
Затем обработайте ультразвуком каждую трубку в ультразвуковом аппарате с установкой амплитуды 20% в течение трех циклов и вращайте лизат при 12 000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. После сбора супернатанта пипеткой переложить в 50-миллилитровую трубку. Инкубируйте лизат клеток при 37 градусах Цельсия при перемешивании 200 об/мин в течение 80 минут.
После вращения лизата и сбора супернатанта в предварительно охлажденные 1,5-миллилитровые микротрубки, аликвот 30 микролитров в предварительно охлажденных 8-полосных трубках ПЦР, сохраняя при этом все трубки на льду. Вспышка замораживает аликвоты лизата на сухом льду и хранится при минус 80 градусах Цельсия. Подготовьте мастер-микс в соответствии с вкладкой подготовки буфера, как описано в рукописи.
Для реакционного объема 10,5 микролитров добавьте 1,05 микролитра различных концентраций Mg-глутамата и 9,45 микролитра мастер-смеси и аккуратно перемешайте. Пипетка 10 микролитров вышеуказанных реакций превращается в 384-луночную квадратную нижнюю микропластину и покрывает ее с помощью уплотнения клейкой пластины. Измерьте экспрессию генов в виде флуоресцентного выхода, записывая данные флуоресценции с помощью пластинчатого считывателя через регулярные промежутки времени в течение восьми часов инкубации при 30 градусах Цельсия с непрерывным встряхиванием орбиты со скоростью 307 циклов в минуту.
После определения концентрации Mg-глутамата, которая приводит к наибольшему значению флуоресценции в конечной точке, приступайте к калибровке K-глутамата. Запустите эксперимент и определите самое высокое значение флуоресценции из числа протестированных концентраций K-глутамата, тем самым определив оптимальный буферный состав для Mg-глутамата и K-глутамата для этого лизата. После того, как значения Mg-глутамата и K-глутамата установлены, подготовьте бульочные трубки оптимизированного буферного состава в соответствии с полученным объемом партии.
После расчета необходимого количества буферных трубок, аликвот 38 микролитров на трубку и хранит при минус 80 градусах Цельсия. Во-первых, пометьте 1,5-миллилитровую микропробирку для оптимального приготовления мастер-микса. Добавьте правильные объемы буфера и лизате и аккуратно перемешайте их.
Затем пипетка сначала образцы ДНК, затем вода без нуклеазы и, наконец, оптимальная мастер-смесь. Осторожно перемешайте бесклеточную реакцию с пипеткой непосредственно перед добавлением в считыватель пластин и избегайте пузырьков. После настройки реакций в пластинчатом считывателе кинетические прогоны записывали данные флуоресценции через равные промежутки времени в течение восьми часов инкубации при 30 градусах Цельсия с непрерывным встряхиванием орбиты со скоростью 307 циклов в минуту.
После калибровки лизата оптимальная концентрация Mg-глутамата была одинаковой при восьми миллимолярах между экстрактами как для линейной, так и для плазмидной ДНК. Однако оптимальная концентрация K-глутамата для плазмидной ДНК составляет 140 миллимоляров, тогда как оптимальная концентрация K-глутамата для линейной ДНК составляет 20 миллимоляров. После этапов калибровки сравнивали уровни экспрессии GFP между линейной и плазмидной ДНК в экстрактах дикого типа, дельта recB и дельта recBCD.
Экспрессия GFP из линейной ДНК достигла 102% и 138% экспрессии из плазмидной ДНК в экстрактах из штаммов delta recB и delta recBCD соответственно. Наиболее важными вещами в протоколе являются лизис ультразвуком клетки и этапы калибровки буфера отдельно для линейной и плазмидной ДНК, особенно при использовании нативных параметров. Этот метод поможет ускорить тестирование биологических конструкций в бесклеточных системах, например, скрининг биосенсоров, ферментов и путей или прототипирование синтетических генетических схем.
