Le protocole est très important car il permet une utilisation rapide, facile et directe des modèles d’ADN linéaires dans les systèmes de synthèse de protéines acellulaires, même à partir de paramètres E. coli natifs. Les principaux avantages sont le gain de temps en évitant le clonage, les modifications chimiques des extrémités linéaires de l’ADN et les suppléments protecteurs comme l’ADN gamma ou chi. Comme des extraits de synthèse auto-déclarés sont en cours de développement pour différents organismes d’intérêt, notre méthode présente un moyen d’accélérer le prototypage de ces extraits en utilisant l’ADN linéaire.
Pour commencer, séquiez la souche BL21 Rosetta-2 delta recBCD de moins 80 degrés Celsius sur un stock de glycérol 2x YTP contenant 10 microgrammes par millilitre de chloramphénicol et incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Ensuite, inoculer une seule colonie de la plaque de gélose dans un peu plus de 40 millilitres de 2x YTP complété par 10 microgrammes par millilitre de chloramphénicol et incuber pendant une nuit à 37 degrés Celsius avec agitation de 200 tr / min. Ensuite, faites une sous-culture en diluant la culture de nuit 100 fois dans quatre litres de média frais 2x YTP contenant 10 microgrammes par millilitre de chloramphénicol.
Diviser les quatre litres du média en quatre fioles distinctes. Incuber à 37 degrés Celsius, 200 tr / min, pendant environ trois à quatre heures de croissance pour atteindre une densité optique de 1,5 à 2,0. Mettez la culture sur de la glace, faites tourner les cellules à 5 000 G pendant 12 minutes à quatre degrés Celsius, puis jetez le surnageant par décantation.
Ensuite, remettez en suspension les granulés de la cellule dans 800 millilitres de S30A refroidi avec du DTT. Encore une fois, faites tourner les cellules à 5 000 G pendant 12 minutes à quatre degrés Celsius comme démontré précédemment et jetez le surnageant par décantation. Après avoir remis en suspension les granulés de cellules dans 160 millilitres de S30A refroidi avec du DTT, transférer les cellules dans des tubes de 50 millilitres refroidis et prépesés.
Faites tourner les cellules à 2000 G pendant huit minutes à quatre degrés Celsius, puis jetez le surnageant par décantation. Encore une fois, faites tourner les cellules à 2000 G pendant quatre minutes à quatre degrés Celsius, puis retirez soigneusement le surnageant restant à l’aide d’une pipette. Ensuite, remesurez le poids du tube pour calculer le poids de la pastille de cellule et maintenez les pastilles de la cellule à moins 80 degrés Celsius.
Après avoir prélevé les granulés de la cellule à moins 80 degrés Celsius, décongelez-les sur de la glace pendant une à deux heures et remettez en suspension les granulés de la cellule dans 0,9 millilitre de S30A avec un tampon DTT par gramme de poids de la pastille de cellule. Ensuite, pipeter lentement pour remettre les cellules en suspension, en évitant autant que possible la mousse supérieure. Placez des aliquotes d’un millilitre des cellules en suspension dans des microtubes de 1,5 millilitre et conservez-les sur de la glace ou un bloc froid pré-réfrigéré à quatre degrés Celsius.
Ensuite, sonicez chaque tube dans un sonicateur avec une configuration de 20% d’amplitude pendant trois cycles et faites tourner le lysat à 12 000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir recueilli le surnageant à l’aide d’une pipette, transférer dans un tube de 50 millilitres. Incuber le lysat cellulaire à 37 degrés Celsius à 200 RPM agitation pendant 80 minutes.
Après avoir filé le lysat et recueilli le surnageant dans des microtubes pré-refroidis de 1,5 millilitre, aliquote 30 microlitres dans des tubes PCR à 8 bandes pré-refroidis, tout en gardant tous les tubes sur la glace. Congeler les aliquotes de lysat sur de la glace sèche et les conserver à moins 80 degrés Celsius. Préparez un mélange maître conformément à l’onglet de préparation du tampon tel que décrit dans le manuscrit.
Pour un volume de réaction de 10,5 microlitres, ajouter 1,05 microlitre de différentes concentrations de Mg-glutamate et 9,45 microlitres du mélange principal et mélanger doucement. Pipeter 10 microlitres des réactions ci-dessus dans une microplaque à fond carré de 384 puits et la couvrir à l’aide d’un joint adhésif. Mesurer l’expression des gènes sous forme de sortie de fluorescence en enregistrant les données de fluorescence avec un lecteur de plaque à intervalles réguliers pendant huit heures d’incubation à 30 degrés Celsius avec agitation orbitale continue à 307 cycles par minute.
Après avoir identifié la concentration de Mg-glutamate qui donne la valeur de fluorescence la plus élevée au point final, procédez à l’étalonnage du K-glutamate. Exécutez l’expérience et identifiez la valeur de fluorescence la plus élevée parmi les concentrations de K-glutamate testées, identifiant ainsi la composition tampon optimale pour le Mg-glutamate et le K-glutamate pour ce lysat. Une fois les valeurs de Mg-glutamate et de K-glutamate établies, préparer des tubes mères de la composition tampon optimisée en fonction du volume de lot obtenu.
Après avoir calculé le nombre de tubes tampons nécessaires, aliquote 38 microlitres par tube et stocker à moins 80 degrés Celsius. Tout d’abord, étiquetez un microtube de 1,5 millilitre pour la préparation optimale du mélange principal. Ajouter les volumes corrects du tampon et du lysat et mélangez-les doucement.
Ensuite, pipeter d’abord les échantillons d’ADN, suivis d’eau sans nucléase et, enfin, du mélange maître optimal. Mélangez doucement la réaction acellulaire avec une pipette juste avant de l’ajouter au lecteur de plaques et évitez les bulles. Après avoir configuré les réactions dans le lecteur de plaques, les exécutions cinétiques ont enregistré des données de fluorescence à intervalles réguliers pendant huit heures d’incubation à 30 degrés Celsius avec agitation orbitale continue à 307 cycles par minute.
Après calibration du lysat, la concentration optimale de Mg-glutamate était similaire à huit millimolaires dans les extraits pour l’ADN linéaire et plasmidique. Cependant, la concentration optimale de K-glutamate pour l’ADN plasmidique est de 140 millimolaires, tandis que la concentration optimale de K-glutamate pour l’ADN linéaire est de 20 millimolaires. Après les étapes d’étalonnage, les niveaux d’expression de GFP ont été comparés entre l’ADN linéaire et plasmidique dans les extraits de type sauvage, delta recB et delta recBCD.
L’expression de la GFP à partir de l’ADN linéaire a atteint respectivement 102% et 138% de l’expression de l’ADN plasmidique dans les extraits de souches delta recB et delta recBCD. Les choses les plus importantes dans le protocole sont la lyse de sonication de la cellule et les étapes d’étalonnage du tampon séparément pour l’ADN linéaire et plasmidique, en particulier lors de l’utilisation des paramètres natifs. Cette technique permettrait d’accélérer les tests de conceptions biologiques dans des systèmes acellulaires, par exemple, le criblage de biocapteurs, d’enzymes et de voies, ou le prototypage de circuits génétiques synthétiques.
