Das Protokoll ist sehr wichtig, da es eine schnelle, einfache und direkte Verwendung von linearen DNA-Vorlagen in zellfreien Proteinsynthesesystemen ermöglicht, sogar aus nativen E.coli-Parametern. Die Hauptvorteile sind die Zeitersparnis durch die Vermeidung von Klonen, chemischen Modifikationen linearer DNA-Enden und schützender Nahrungsergänzungsmittel wie Gamma- oder Chi-DNA. Da selbstberichtende Syntheseextrakte für verschiedene Organismen von Interesse entwickelt werden, bietet unsere Methode eine Möglichkeit, das Prototyping in diesen Extrakten durch die Verwendung linearer DNA zu beschleunigen.
Um zu beginnen, BL21 Rosetta-2 delta recBCD von minus 80 Grad Celsius Glycerin-Brühe auf eine 2x YTP-Agarplatte zu streifen, die 10 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol enthält, und über Nacht bei 37 Grad Celsius zu inkubieren. Dann inokulieren Sie eine einzelne Kolonie von der Agarplatte in etwas mehr als 40 Milliliter 2x YTP, ergänzt mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol, und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 200 U/min Schütteln. Als nächstes machen Sie eine Subkultur, indem Sie die Nachtkultur 100 Mal in vier Liter frische 2x YTP-Medien mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol verdünnen.
Teilen Sie die vier Liter des Mediums in vier separate Kolben. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius, 200 U/min, für etwa drei bis vier Stunden Wachstum, um eine optische Dichte von 1,5 bis 2,0 zu erreichen. Die Kultur auf Eis legen, die Zellen bei 5.000 G für 12 Minuten bei vier Grad Celsius herunterdrehen und dann den Überstand durch Dekantieren verwerfen.
Dann resuspendieren Sie die Zellpellets in 800 Milliliter gekühltem S30A mit DTT. Auch hier werden die Zellen bei 5.000 G für 12 Minuten bei vier Grad Celsius wie zuvor demonstriert heruntergedreht und der Überstand durch Dekantieren verworfen. Nach der Resuspendierung von Zellpellets in 160 Milliliter gekühltem S30A mit DTT werden die Zellen in gekühlte und vorgewogene 50-Milliliter-Röhrchen überführt.
Die Zellen bei 2000 G für acht Minuten bei vier Grad Celsius herunterdrehen und dann den Überstand durch Dekantieren verwerfen. Auch hier drehen Sie die Zellen bei 2000 G für vier Minuten bei vier Grad Celsius herunter und entfernen Sie dann den verbleibenden Überstand vorsichtig mit einer Pipette. Messen Sie dann das Gewicht des Röhrchens erneut, um das Gewicht des Zellpellets zu berechnen, und halten Sie die Zellpellets bei minus 80 Grad Celsius.
Nachdem Sie die Zellpellets ab minus 80 Grad Celsius entnommen haben, tauen Sie sie ein bis zwei Stunden auf Eis auf und resuspendieren Sie die Zellpellets in 0,9 Milliliter S30A mit DTT-Puffer pro Gramm des Zellpelletgewichts. Dann pipetten Sie langsam, um die Zellen zu resuspendieren, und vermeiden Sie den oberen Schaum so weit wie möglich. Ein-Milliliter-Aliquots der resuspendierten Zellen in 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen geben und auf Eis oder einem vorgekühlten kalten Block bei vier Grad Celsius aufbewahren.
Als nächstes beschallen Sie jedes Röhrchen in einem Ultraschallgerät mit einer Einstellung von 20% Amplitude für drei Zyklen und drehen Sie das Lysat bei 12.000 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius herunter. Nach dem Sammeln des Überstands mit einer Pipette in ein 50-Milliliter-Röhrchen überführen. Inkubieren Sie das Zelllysat bei 37 Grad Celsius bei 200 U/min Rühren für 80 Minuten.
Nach dem Abschleudern des Lysats und dem Sammeln des Überstands in vorgekühlten 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen aliquot 30 Mikroliter in vorgekühlten PCR-8-Streifen-Röhrchen, während alle Röhrchen auf Eis gehalten werden. Die Lysataliquots auf Trockeneis einfrieren und bei minus 80 Grad Celsius lagern. Bereiten Sie eine Mastermischung gemäß der Registerkarte Puffervorbereitung vor, wie im Manuskript beschrieben.
Bei einem Reaktionsvolumen von 10,5 Mikrolitern 1,05 Mikroliter verschiedener Mg-Glutamat-Stammkonzentrationen und 9,45 Mikroliter der Mastermischung zugeben und vorsichtig mischen. Pipettieren Sie 10 Mikroliter der oben genannten Reaktionen in eine 384-Well-Quadratboden-Mikroplatte und bedecken Sie sie mit einer Klebeplattendichtung. Messen Sie die Genexpression als Fluoreszenzausgabe, indem Sie Fluoreszenzdaten mit einem Plattenleser in regelmäßigen Abständen für acht Stunden Inkubation bei 30 Grad Celsius mit kontinuierlichem Orbitalschütteln bei 307 Zyklen pro Minute aufzeichnen.
Nachdem Sie die Mg-Glutamat-Konzentration identifiziert haben, die am Endpunkt zu dem höchsten Fluoreszenzwert führt, fahren Sie mit der K-Glutamat-Kalibrierung fort. Führen Sie das Experiment durch und identifizieren Sie den höchsten Fluoreszenzwert aus den getesteten K-Glutamat-Konzentrationen, wodurch die optimale Pufferzusammensetzung für Mg-Glutamat und K-Glutamat für dieses Lysat ermittelt wird. Sobald die Mg-Glutamat- und K-Glutamat-Werte ermittelt sind, werden die Lagerröhrchen der optimierten Pufferzusammensetzung entsprechend dem erhaltenen Chargenvolumen vorbereitet.
Nach Berechnung der Anzahl der benötigten Pufferrohre aliquot 38 Mikroliter pro Röhrchen aliquotieren und bei minus 80 Grad Celsius lagern. Markieren Sie zunächst ein 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen für die optimale Master-Mix-Zubereitung. Fügen Sie die richtigen Mengen des Puffers hinzu und lysieren Sie sie und mischen Sie sie vorsichtig.
Dann pipetten Sie zuerst die DNA-Proben, gefolgt von nukleasefreiem Wasser und schließlich dem optimalen Mastermix. Mischen Sie die zellfreie Reaktion vorsichtig mit einer Pipette, kurz bevor Sie sie in den Plattenleser geben, und vermeiden Sie Blasen. Nach dem Einrichten der Reaktionen im Plattenleser zeichneten kinetische Läufe in regelmäßigen Abständen Fluoreszenzdaten für acht Stunden Inkubation bei 30 Grad Celsius mit kontinuierlichem Orbitalschütteln bei 307 Zyklen pro Minute auf.
Nach der Kalibrierung des Lysats war die optimale Konzentration von Mg-Glutamat bei acht Millimolar über Extrakte sowohl für lineare als auch für Plasmid-DNA ähnlich. Die optimale K-Glutamatkonzentration für Plasmid-DNA beträgt jedoch 140 Millimolar, während die optimale K-Glutamatkonzentration für lineare DNA 20 Millimol beträgt. Nach den Kalibrierungsschritten wurden die Konzentrationen der GFP-Expressionen zwischen linearer und Plasmid-DNA in den Wildtyp-, Delta-recB- und Delta-recBCD-Extrakten verglichen.
Die GFP-Expression aus linearer DNA erreichte 102% bzw. 138% der Expression aus Plasmid-DNA in Extrakten aus delta recB- bzw. delta recBCD-Stämmen. Die wichtigsten Punkte im Protokoll sind die Ultraschalllyse der Zelle und die getrennten Pufferkalibrierungsschritte für lineare und Plasmid-DNA, insbesondere bei Verwendung der nativen Parameter. Diese Technik würde dazu beitragen, das Testen biologischer Designs in zellfreien Systemen zu beschleunigen, zum Beispiel das Screening von Biosensoren, Enzymen und Signalwegen oder das Prototyping synthetischer genetischer Schaltkreise.
