이 프로토콜은 천연 E.coli 매개 변수에서도 무세포 단백질 합성 시스템에서 선형 DNA 템플릿을 빠르고 쉽고 직접 사용할 수 있기 때문에 매우 중요합니다. 주요 장점은 복제, 선형 DNA 말단의 화학적 변형 및 감마 또는 카이 DNA와 같은 보호 보충제를 피함으로써 절약되는 시간입니다. 관심있는 다양한 유기체에 대한 자체보고 합성 추출물이 개발됨에 따라 당사의 방법은 선형 DNA를 사용하여 해당 추출물의 프로토 타이핑 속도를 높이는 방법을 제시합니다.
시작하려면 BL21 Rosetta-2 델타 recBCD를 섭씨 영하 80도에서 클로람페니콜 밀리리터당 10마이크로그램을 포함하는 2x YTP 한천 플레이트에 연속 스트릭 스팅하고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 그런 다음 한천 플레이트에서 단일 콜로니를 밀리리터당 10마이크로그램의 클로람페니콜이 보충된 40밀리리터 이상의 2x YTP에 접종하고 섭씨 37도에서 200RPM 진탕으로 밤새 배양합니다. 다음으로, 하룻밤 배양액을 100배 희석하여 클로람페니콜 밀리리터당 10마이크로그램을 포함하는 4리터의 신선한 2x YTP 배지로 계대배양을 만듭니다.
4 리터의 미디어를 4 개의 개별 플라스크로 나눕니다. 섭씨 37도, 200RPM에서 약 3-4시간 동안 배양하여 1.5-2.0의 광학 밀도에 도달합니다. 배양 물을 얼음에 놓고 섭씨 4도에서 12 분 동안 5, 000 G에서 세포를 스핀 다운 한 다음 디캔팅하여 상청액을 버립니다.
그런 다음 DTT로 냉각된 S30A 800ml에 셀 펠릿을 재현탁합니다. 다시, 세포를 이전에 입증된 바와 같이 섭씨 4도에서 12분 동안 5, 000 G에서 스핀다운하고 디캔팅하여 상청액을 버린다. DTT를 사용하여 냉각된 S30A 160ml에 세포 펠릿을 재현탁한 후 세포를 냉각되고 미리 계량된 50밀리리터 튜브로 옮깁니다.
세포를 섭씨 4도에서 8분 동안 2000G에서 스핀다운한 다음 디캔팅하여 상청액을 버립니다. 다시, 세포를 섭씨 4도에서 4분 동안 2000G에서 스핀다운한 다음, 피펫을 사용하여 나머지 상청액을 조심스럽게 제거한다. 그런 다음 튜브의 무게를 다시 측정하여 셀 펠릿의 무게를 계산하고 셀 펠릿을 섭씨 영하 80도로 유지합니다.
섭씨 영하 80도에서 세포 펠릿을 취한 후 얼음에서 1-2시간 동안 해동하고 세포 펠릿 무게 그램당 DTT 버퍼를 사용하여 0.9밀리리터의 S30A에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 그런 다음 피펫을 천천히 사용하여 세포를 재현탁하여 상단 거품을 최대한 피하십시오. 부유 세포의 1 밀리리터 분취량을 1.5 밀리리터 마이크로 튜브에 넣고 섭씨 4 도의 얼음이나 사전 냉각 된 콜드 블록에 보관하십시오.
다음으로, 3주기 동안 20% 진폭의 설정으로 초음파 처리기의 각 튜브를 초음파 처리하고 섭씨 4도에서 10분 동안 12, 000G에서 용해물을 스핀다운합니다. 피펫으로 상청액을 수집 한 후 50 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 세포 용해물을 섭씨 37도에서 200RPM 교반으로 80분 동안 인큐베이션한다.
용해물을 스핀다운하고 사전 냉각된 1.5-밀리리터 마이크로튜브에서 상청액을 수집한 후, 모든 튜브를 얼음 위에 유지하면서 사전 냉각된 PCR 8-스트립 튜브에 30 마이크로리터를 분취한다. 용해물 분취량을 드라이아이스에 급속 동결시키고 영하 80도에서 보관합니다. 원고에 설명된 대로 완충액 준비 탭에 따라 마스터 믹스를 준비합니다.
10.5 마이크로 리터의 반응 부피의 경우 1.05 마이크로 리터의 다른 Mg- 글루타메이트 스톡 농도와 9.45 마이크로 리터의 마스터 믹스를 추가하고 부드럽게 혼합하십시오. 위의 반응물 10 마이크로리터를 384-웰 정사각형 바닥 마이크로플레이트에 피펫팅하고 접착 플레이트 씰을 사용하여 이를 덮는다. 분당 307 사이클의 연속 궤도 흔들림과 함께 섭씨 30도에서 8 시간 동안 배양 한 플레이트 리더로 일정한 간격으로 형광 데이터를 기록하여 유전자 발현을 형광 출력으로 측정합니다.
종말점에서 가장 높은 형광 값을 초래하는 Mg-글루타메이트 농도를 확인한 후 K-글루타메이트 보정을 진행합니다. 실험을 실행하고 테스트된 K-글루타메이트 농도 중에서 가장 높은 형광 값을 식별하여 이 용해물에 대한 Mg-글루타메이트 및 K-글루타메이트에 대한 최적의 완충액 구성을 식별합니다. Mg- 글루타메이트 및 K- 글루타메이트 값이 설정되면 얻은 배치 부피에 따라 최적화 된 완충액 조성의 스톡 튜브를 준비하십시오.
필요한 버퍼 튜브의 수를 계산 한 후 튜브 당 38 마이크로 리터를 분취하여 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 먼저, 최적의 마스터 믹스 준비를 위해 1.5밀리리터 마이크로튜브에 라벨을 붙입니다. 정확한 부피의 완충액과 용해물을 추가하고 부드럽게 혼합하십시오.
그런 다음 먼저 DNA 샘플을 피펫팅한 다음 뉴클레아제가 없는 물을 피펫팅하고 마지막으로 최적의 마스터 믹스를 만듭니다. 플레이트 리더에 추가하기 직전에 무세포 반응을 피펫으로 부드럽게 혼합하고 기포를 피하십시오. 플레이트 리더에서 반응을 설정한 후, 키네틱 런은 분당 307주기의 연속 궤도 흔들림과 함께 섭씨 30도에서 8시간 동안 일정한 간격으로 형광 데이터를 기록했습니다.
용해물의 보정 후, Mg-글루타메이트 최적 농도는 선형 및 플라스미드 DNA 모두에 대해 추출물에 걸쳐 8밀리몰에서 유사하였다. 그러나 플라스미드 DNA에 대한 최적의 K- 글루타메이트 농도는 140 밀리몰인 반면, 선형 DNA에 대한 최적의 K- 글루타메이트 농도는 20 밀리몰입니다. 보정 단계 후, 야생형, 델타 recB 및 델타 recBCD 추출물에서 선형 및 플라스미드 DNA 간에 GFP 발현 수준을 비교했습니다.
선형 DNA의 GFP 발현은 델타 recB 및 델타 recBCD 균주의 추출물에서 플라스미드 DNA의 발현의 각각 102% 및 138%에 도달했습니다. 프로토콜에서 가장 중요한 것은 세포의 초음파 용해와 선형 및 플라스미드 DNA에 대한 버퍼 교정 단계, 특히 네이티브 매개 변수를 사용할 때입니다. 이 기술은 예를 들어 바이오센서, 효소 및 경로의 스크리닝 또는 합성 유전 회로의 프로토타이핑과 같은 무세포 시스템에서 생물학적 설계 테스트 속도를 높이는 데 도움이 됩니다.
