저자는 귀중한 도움과 토론에 대해 Balboula 실험실의 모든 구성원에게 감사드립니다. 저자는 mCherry-Cep192 구조를 친절하게 공유해 준 Melina Schuh에게 감사드립니다. 이 연구는 R35GM142537 (NIGMS, NIH)에서 AZB로 지원되었습니다.

여기에 설명 된 모든 방법은 미주리 대학교 (동물 관리 품질 보증 참조 번호 9695)의 승인을 받았습니다. Cep192-eGFP 리포터 6-8주령의 암컷 마우스를 본 연구에 사용하였다. Cep192-eGFP 리포터 마우스를 생성하기 위해, CRISPR/Cas9-매개 상동성-지향 복구를 사용하여 EGFP 리포터 유전자를 CF-1 마우스 게놈 내로 통합하였다. EGFP 리포터는 Cep192(MTOC의 필수 구성 요소)15의 C-말단에서 융합되었습니다. 마우스 콜로니를 유지하기 위해, 동형접합체 Cep192-eGfp 리포터 마우스를 사용하였다. 모든 동물은 21 ° C 및 55 % 습도의 케이지 (최대 4 마리 동물 / 케이지)에서 유지되었으며, 12 시간의 명암 사이클과 음식과 물에 대한 자유로운 접근이 이루어졌습니다.
1. 마우스 난모세포 수집
<ol><li>배양 배지(Chatot, Ziomek, 및 Bavister, CZB19, 재료 표 참조)를 준비하고, 이를 37°C 및 5%CO2 에서 밤새 배양하였다. 참고: CZB 배지는 4°C에서 1개월 동안 보관할 수 있습니다(배지 구성에 대한 보충 파일 1 참조).</li>
	<li>CZB 배지에 글루타민 (1mM)과 밀리논 (2.5mM) (CZB + M) ( 재료 표 참조)을 보충하고 인큐베이터에 넣습니다. 참고: 밀리논은 전단계 I에서 정지된 난모세포를 유지하고 감수 분열 재개20을 예방하는 포스포디에스테라제 억제제입니다.</li>
	<li>3mg/mL 폴리비닐피롤리돈(PVP), 25mM hepes(pH 7.3)(보충 파일 1) 및 밀리논(2.5mM)(MEM/PVP + M, 재료 표 참조)을 포함하는 수집 배지(중탄산염이 없는 최소 필수 배지, MEM)를 준비합니다.</li>
	<li>수집 및 배양 접시를 준비하고 60mm 및 35mm 페트리 접시에 각각 4개의 마이크로방울(100μL)의 수집 배지(MEM/PVP + M)와 2개의 마이크로방울(CZB+M) 배지(CZB+M)를 만들고 미네랄 오일로 덮습니다( 재료 표 참조). 수집 접시를 슬라이드 상에 따뜻하게 유지하고, 배양 접시를 37°C 및 5%CO2에서 배양기에 넣는다.</li>
	<li>난모세포 채취 44-48시간 전에 성적으로 성숙한(6-8주령) Cep192-eGFP 리포터 암컷 마우스에 임신한 암말의 혈청 성선 자극호르몬(PMSG, 재료 표 참조) 5IU를 복강 주사합니다.</li>
	<li>자궁 경부 탈구로 마우스를 희생시키고, 난소21을 확인 및 제거하고, 37 ° C에서 예열 된 수집 배지 (MEM / PVP + M)가 들어있는 시계 유리로 옮깁니다.</li>
	<li>시계 유리 바닥에 1mL 주사기를 대고 함께 묶인 재봉 바늘을 사용하여 여러 번(난소당 ~40회) 구멍을 뚫어 난모세포를 배지로 방출하여 난소를 고정합니다.</li>
	<li>플라스틱 이송 피펫을 사용하여 단계 1.7의 적운-난모세포 복합체(COC)가 포함된 모든 배지를 빈 100mm 플라스틱 페트리 접시에 옮깁니다.</li>
	<li>실체 현미경으로 파스퇴르 유리 피펫을 사용하여 COC를 수집하고 MEM/PVP + M이 포함된 수집 접시로 옮깁니다.</li>
	<li>좁은 파스퇴르 유리 피펫(직경 약 100μm)을 사용하여 부드럽고 반복적인 피펫팅으로 난모세포를 기계적으로 탈퇴시킨 다음 CZB+M 배양 접시로 옮기기 전에 (100μL) MEM/PVP + M(수집 접시)의 4개 마이크로드롭으로 옮기고 세척합니다.</li>
	<li>탈질된 난모세포를 공기 중의 5%의CO2 와 함께 37°C에서 1시간 동안 배양한다.</li>
</ol>2. 난모세포 미세주입
<ol><li>250μL 떨어뜨린 MEM/PVP + M을 100mm 플라스틱 페트리 접시 뚜껑에 넣고 미네랄 오일로 덮습니다. 알림: 페트리 접시 덮개에는 마이크로 매니퓰레이터를 조정할 수 있는 더 많은 공간을 제공하는 하단 림이 있습니다.</li>
	<li>미세 주입 시스템을 켭니다 ( 재료 표 참조).</li>
	<li>현미경의 온난화 단계(37°C)에 미세 주입 접시를 놓습니다.</li>
	<li>마이크로로더 피펫 팁(재료 표 참조)을 사용하여 0.5μL의 mCh-Cep192cRNA를 주사 바늘에 로드하고 주사 바늘을 마이크로 매니퓰레이터에 고정합니다.</li>
	<li>탈질된 난모세포(단계 1.11)를 250 μL 마이크로드롭(단계 2.1)으로 옮깁니다.</li>
	<li>20x 또는 40x 대물 렌즈 아래에서 난모세포 위치에 따라 주사 바늘과 고정 바늘의 위치와 초점을 조정합니다(그림 1).</li>
	<li>미세주입 장치를 설정하고 주입 압력(pi), 보상 압력(pc) 및 주입 시간(ti)을 5-10pl의 mCh-Cep192 cRNA를 주입할 수 있도록 설정합니다(MTOC를 외인성 표지하기 위해).</li>
	<li>조심스럽게 핵을 건드리지 않고 난 모세포를 주입하십시오.</li>
	<li>모든 난모세포가 주입되면 CZB+M의 3개의 마이크로드롭으로 세척하고 배양 접시(CZB+M)로 옮긴 다음 mCh-Cep192 발현을 허용하기 위해 37°C에서 3시간 동안 배양합니다.</li>
</ol>3. 난모세포 성숙
<ol><li>적어도 3 시간 동안 공기 중 5%CO2 로 인큐베이터에서 미리 평형화된 CZB 배지에 글루타민(1 mM)을 첨가하여 성숙 배지를 준비한다.</li>
	<li>35mm 페트리 접시에 두 개의 마이크로 방울 (100μL)의 성숙 배지를 만들고 미네랄 오일 (성숙 접시)로 덮으십시오.</li>
	<li>100 μL 밀리논이 없는 CZB 마이크로드롭에서 프로상 I-체포된 난모세포를 최소 3회 세척하여 밀리논을 완전히 제거하고 감수 분열 재개를 허용합니다.</li>
	<li>난 모세포를 성숙 접시로 옮기고 37 ° C의 공기 중에서 5 %CO2 로 가습 된 인큐베이터에서 5 시간 (prometaphase I 단계) 동안 배양합니다.</li>
</ol>4. 절제 및 영상화를 위한 난모세포 제제
<ol><li>전구상 I 난모세포(단계 3.4)를 광유가 함유된 100μL의 성숙 배지(단계 3.1)를 함유하는 유리 바닥 배양 접시로 옮깁니다.</li>
</ol>5. 절제를위한 현미경 준비
<ol><li>절제 최소 30분 전에 스테이지 인큐베이터의 온도 컨트롤러( 재료 표 참조)를 켜고 37°C로 설정합니다.</li>
	<li>CO2 컨트롤러를 켜고 5 % CO2로 설정하십시오.</li>
	<li>40x 오일 이멀젼 아포크로매틱 대물렌즈를 선택하고 액침 오일을 소량 떨어뜨립니다.</li>
	<li>난모세포가 있는 유리 바닥 배양 접시를 스테이지 탑 인큐베이터에 장착하고 인큐베이터를 가스 뚜껑으로 덮습니다.</li>
	<li>이미지 수집 소프트웨어( 재료 표 참조)에서 여러 스테이지 위치를 저장할 수 있는 옵션을 선택합니다(예: "마크 정의 및 실험 찾기"). 투과광 명시야 조명을 사용하여 개별 난 모세포를 중심으로하고 위치를 저장합니다.</li>
	<li>이미지 수집 소프트웨어에서 XYZ 스캔 모드를 선택하고 이미지 형식을 256 x 256 픽셀로 설정하고 줌 계수를 2.5x - 3.0x로 설정하고 스캔 주파수를 600Hz로 선택합니다. 이는 약 1.6μs의 픽셀 체류 시간에 해당합니다.</li>
	<li>레이저 출력의 약 10%(샘플 레벨에서 4.0μW에 해당)에서 488nm 여기 레이저 라인을 설정하고( 재료 표 참조) 500-550nm의 스펙트럼 대역폭을 사용하여 MTOC의 GFP 신호를 관찰합니다. mCherry 태그가 붙은 Cep192에서 형광을 동시에 관찰하려면 레이저 출력의 약 8%(샘플 수준에서 10.7μW에 해당)에서 585nm 여기 레이저 라인을 설정하고 595-645nm의 스펙트럼 대역폭으로 설정된 다른 검출기를 사용합니다. 참고: 난모세포 경계를 동시에 감지하기 위해 컨포칼 현미경의 투과광 검출기(TLD)를 사용하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>라이브 스캔 모드와 z-드라이브의 수동 제어를 사용하여 난모세포에서 MTOC를 스크리닝합니다.</li>
	<li>mcMTOC가 감지되면 그 주위에 정사각형 관심 영역(ROI)을 그립니다.</li>
</ol>6. mcMTOC의 제거
<ol><li>펨토초 레이저를 740nm 파장으로 설정합니다. 참고: 레이저 파장은 현미경과 레이저 조건에 따라 변경될 수 있습니다.</li>
	<li>다광자 현미경의 전기 광학 변조기( 재료 표 참조)를 사용하여 레이저 출력을 샘플 평면에서 70-80mW 전력에 해당하는 60%-70%로 설정합니다. 알림: 레이저에 펨토초 펄스 보상기가 장착된 경우 이를 사용하여 그룹 지연 분산(GDD)을 보정합니다. GDD 보정은 효율적인 mcMTOC 제거에 필요한 레이저 출력의 양을 줄이고 난 모세포의 광 손상을 최소화합니다. GDD 제어는 일반적으로 상용 다광자 현미경의 이미지 획득 소프트웨어와 통합됩니다.</li>
	<li>5.6단계와 동일한 이미지 형식, 확대/축소 비율 및 스캔 빈도를 사용합니다. 선 및 프레임 평균 매개 변수를 1로 설정합니다.</li>
	<li>소프트웨어에서 스캔 버튼을 클릭하여 선택한 ROI의 단일 레이저 스캔 을 수행하여 mcMTOC의 제거를 수행합니다.</li>
	<li>5.7단계의 채널 설정을 사용하여 다광자 레이저 노출 전후에 촬영한 GFP 표지 구조의 이미지를 비교하여 제거 결과를 검토합니다. 절제가 성공하면 표적 mcMTOC에서 GFP 형광의 강도가 백그라운드에서 관찰된 수준으로 감소합니다.</li>
	<li>GFP-표지 구조의 일부 단편이 남아 있는 경우, mcMTOC의 다양한 z 평면에 초점을 맞추어 6.4단계를 한 번 이상 반복한다.</li>
	<li>5.7단계의 채널 설정을 사용하여 mcMTOC 관련 mCherry 신호(mCh-Cep192)의 완전한 손실에 의한 제거 효율을 확인합니다.</li>
	<li>난모세포의 모든 MTOC(다양한 초점면에서)가 제거될 때까지 5.8단계에서 6.7단계를 반복합니다. 참고: 이 프로토콜은 다광자 레이저 노출 후 mcMTOC 고갈을 확인하고 GFP 광퇴색으로 인해 GFP 형광 손실이 발생할 가능성을 배제하기 위한 전략으로 mCh-Cep192 미세 주입을 사용합니다. 그러나 이 프로브의 미세 주입은 선택 사항이며 절제 절차에는 필요하지 않습니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

세포내의 세포골격-관련 구조를 교란시키는 상이한 방법들이 존재한다 22,23,24,25. 그러나 세포 생존력을 손상시키지 않고 표적 구조를 선택적으로 교란시키는 효율적인 기술을 찾는 것은 어려운 일입니다. 여기에 제시된 다광자 레이저 절제 방법은 난모세포 생존력을 변경하지 않고 난모세포 내의 mcMTOC에 선택적 기계적 섭동을 유도하는 효율적인 전략입니다.
레이저 절제는 유사분열 및 감수 분열 22,23,26,27 동안 염색체 분리를 제어하는 분자 메커니즘을 이해하는 데 광범위하게 사용되었습니다. 체세포(28)에 비해 상대적으로 큰 크기(직경 >80mm)로 인해 포유동물 난모세포(28)의 세포 내 구조의 절제는 도전을 나타냅니다. 더욱이, 중기 I 난모세포의 평균 mcMTOC 부피는 ~20μm15이며, 이는 추가적인 도전을 나타낸다. 이러한 문제를 극복하기 위해 더 깊은 조직 침투를 제공하는 효율적인 방법을 채택해야 합니다. 절제를 위해 다광자 레이저를 사용하는 주요 이점은 오프 타겟 효과(29)를 최소화하면서 세포 깊숙이 도달 할 수있는 능력이다.
표적 구조를 고갈시키는 레이저 절제 방법의 효능과 효율성을 검증하려면 형광 표지 단백질을 사용하여 시간이 지남에 따라(절제 전후) 표적 구조를 식별하는 것이 좋습니다23. 레이저 제거는 구조로서 전체 mcMTOC를 고갈시키며, 더 작은 mcMTOC는 단일 레이저 노출만 고갈시키면 되지만 더 큰 mcMTOC는 다른 초점면에서 둘 이상의 레이저 노출이 필요할 수 있습니다. 또한 mcMTOC 절제의 효율성을 추가로 확인하기 위해 MTOC 마커(예: γ-튜불린, 페리센트린 또는 Cep192)를 사용하여 대조군 및 mcMTOC 절제 난모세포의 하위 집합을 고정하고 면역 표지하는 것이 좋습니다. 대조 난 모세포에서 mcMTOC에 인접하지만 겹치지 않는 세포질 영역이 레이저에 노출됩니다.
이 실험은 난 모세포 내의 다른 초점면 사이를 이동하는 동안 여러 mcMTOC 제거가 필요합니다. 따라서 실험 시간을 최소화하여 난모세포 생존력을 높이기 위해 실험을 실행하기 전에 이 기술을 여러 번 연습하는 것이 좋습니다. 또한, 난모세포 생존력에 영향을 미치지 않으면서 mcMTOC를 고갈시키기에 충분한 최소 레이저 출력을 사용하는 것이 중요합니다.
이 기술에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 다광자 컨포칼 현미경은 일반 컨포칼 현미경보다 상대적으로 비쌉니다. 둘째, 서로 다른 초점면에서 모든 mcMTOC를 교란하는 것은 화학적 또는 유전적 섭동보다 시간이 많이 걸립니다. 셋째, 이 프로토콜은 가능한 한 최단 시간에 모든 mcMTOC를 제거할 수 있는 기술적 기술이 필요합니다. 그러나 일단 숙달되면 다광자 레이저의 사용은 mcMTOC를 포함한 마우스 난 모세포의 여러 세포 내 구조를 교란시키는 훌륭한 전략을 제공하여 스핀들 위치를 조절하는 분자 메커니즘과 포유류 난 모세포에서의 적시 이동에 대한 이해에 기여합니다.

반수체 배우자 (정자 및 난 모세포)는 감수 분열을 통해 생성되며, 이는 수정 전에 염색체 수 감소에 필요한 두 번의 DNA 복제 후 두 번의 연속 분열을 수반합니다. 포유류에서 초기 태아 생활 동안 난 모세포는 첫 번째 감수 분열의 전상 I의 디 플로 텐 단계 인 발아 소포 (GV) 단계에서 긴 정지 (사춘기까지)를 겪습니다. 감수 분열 재개 후, GV 난 모세포는 핵 외피 파괴 (NEBD)를 거치고, 스핀들은 주로 난 모세포 중심 1,2,3에서 조립된다. 나중에 F- 액틴에 의해 구동되는 스핀들은 난 모세포 중심에서 피질로 적시에 이동하여 고도로 비대칭 인 분열을 보장하여 작은 극체 (PB)4,5,6을 가진 알을 만듭니다.
유사분열 세포에서, 중심체는 페리센트린, γ-튜불린, Cep152 및 Cep1927과 같은 중심주위 물질 성분(PMC)에 의해 둘러싸인 한 쌍의 중심체로 구성된다. 이러한 중심체 함유 중심체는 양극성 스핀들 형성의 충실도에 기여합니다8. 그러나 중심소체는 설치류9를 포함한 다양한 종에서 초기 난자 생성 동안 손실됩니다. 따라서 마우스 난모세포는 수많은 중심체 미세소관(MT) 조직 센터(MTOC)를 사용하여 중심심 독립적 방추 조립 경로를 채택합니다9,10. 감수 분열이 재개되면, 핵 주위 MTOC는 많은 수의 더 작은 MTOC로 재 응축, 스트레칭 및 단편화의 세 가지 뚜렷한 단계를 거친다. 그런 다음 조각화된 MTOC를 클러스터링하고 정렬하여 양극성 스핀들10,13,14를 구성합니다. MTOC의 또 다른 풀은 NEBD 동안 세포질에 위치합니다. 이러한 세포질 MTOC 중 일부는 이동하여 스핀들 극(극성 MTOC, pMTOC)을 형성합니다.10,11. 최근에, 방추 극 형성에 기여하지 않지만 중기 I (Met I) 동안 난 모세포 세포질에 남아있는 중기 세포질 MTOC (mcMTOC)라고 불리는 세포질 MTOC의 또 다른 하위 집합이 발견되었습니다.15. 다광자 레이저 제거에 의해 mcMTOC를 고갈시키거나 자가포식 억제에 의해 이들의 수를 비정상적으로 증가시키면 스핀들 위치 지정 및 이동이 교란되고 중기 II 난모세포에서 이수성 발생률이 증가합니다15.
흥미롭게도 mcMTOC는 여러 측면에서 pMTOC와 다릅니다15. 예를 들어, 주로 핵 주위 MTOC에서 유래하는 pMTOC와 달리 mcMTOC는 난 모세포 피질에서 유래합니다. 스핀들이 여전히 난모세포 중심에 있을 때, mcMTOC는 PB 압출(15)을 위해 스핀들이 이동하는 측면에 비대칭적으로 반대 방향으로 국한된다. 아스트랄 유사 MT는 상대적으로 큰 난 모세포 세포의 피질에 도달 할 수 없습니다. 따라서 이러한 mcMTOC는 MT를 핵으로 만들어 스핀들 (아스트랄 유사 MTOC를 통해 )을 피질에 고정시킵니다. 이러한 발견은 mcMTOC 핵 MT 힘이 피질쪽으로 스핀들 이동을 유도하는 F- 액틴 매개 힘을 상쇄하는 모델을 시사합니다. 이 두 가지 반대되는 힘 사이의 균형은 중앙 스핀들 위치 지정과 시기 적절한 스핀들 이동(15)을 조절하는 데 필수적입니다.
현재까지 검사된 모든 PMC 단백질(페리센트린, g-튜불린, Cep192 및 오로라 키나아제 A)은 mcMTOC 및 pMTOC15의 두 MTOC 풀에 국한됩니다. 따라서 pMTOC를 교란하지 않고 mcMTOC를 선택적으로 교란시키는 화학적 또는 유전적 접근은 없습니다. 이러한 제한은 레이저 제거로 mcMTOC를 선택적으로 표적으로 삼음으로써 피할 수 있습니다. 미세 제거를 위해 개발 된 레이저 기반 기술 중 펄스 다광자 펨토초 레이저는 초점면에 국한된 정밀 충격, 근적외선의 높은 침투 깊이, 세포16,17,18에 대한 광독성 및 열 손상 감소로 인해 큰 잠재력을 보여줍니다. 이 연구는 도립 현미경에 결합 된 다중 광자 레이저를 사용하여 마우스 난 모세포에서 mcMTOC를 제거하는 선택적 접근법을 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4 IN thinwall GL 1.0 OD/.75 ID</td>
			<td>World precision instrument&#160;</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td>Injection needles&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass&#160;</td>
			<td>Fisherbrand&#160;</td>
			<td>Cat# 13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillarities&#160;</td>
			<td>World Precision Instrument&#160;</td>
			<td>Cat# TW100-6</td>
			<td>Holding needles&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage incubator for Leica DMI6000 B microscope</td>
			<td>Life Imaging Services GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chlrode dihydrate</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 controller&#160;</td>
			<td>Pecon</td>
			<td># 0506.000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Cover HP</td>
			<td>Pecon</td>
			<td># 0506.020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Lactic acid&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# L7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMi8</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtojet 4i</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microinjector&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotips Microloader</td>
			<td>Fisher scientific&#160;</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# G1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# 1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish&#160;</td>
			<td>Mat Tek Corporation</td>
			<td>Cat# P35G-1.0-20-C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes Sodium Salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cat # H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hera Cell vios 160i</td>
			<td>Thermo&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>CO2 incubator&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCP SP8 spectral laser scanning confocal micorscope with inverted stand DMI6000 B</td>
			<td>Leica Microsystems, Inc</td>
			<td>N/A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cat#G8540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate dihydrate</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# M7774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai DeepSee Ti-Sapphire femtosecond laser</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCH-Cep192 cRNA</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium Essential Medium Eagle - MEM</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cat #M0258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milrinone</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cat# M4659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cat# M5310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium eagle (MEM)</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# M0268 - 1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: Cep192-eGFP reporter CF-1</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100 mm)</td>
			<td>Fisherbrand&#160;</td>
			<td>Cat# FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (35 mm)</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>Cat# 430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (60 mm)</td>
			<td>Falcon&#160;</td>
			<td>Cat# 351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# P5530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrolidone</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cat# P2307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrolidone (PVP)</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# P2307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant mare&#180;s serum gonadotropin&#160;</td>
			<td>Lee BioSolutions</td>
			<td>Cat# 493-10-10&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# P4562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# P4562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sewing needles&#160;</td>
			<td>D.M.C</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N&#176; 5 * 16 Needles&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage-top heating insert P</td>
			<td>Pecon</td>
			<td># 0426.300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterezoom S9i</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Stereomicroscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td>BD company&#160;</td>
			<td>Cat# 309597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller Tempcontrol 37-2 digital</td>
			<td>Pecon</td>
			<td># 0503.000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Cube temperature controller for the cage incubator</td>
			<td>Life Imaging Services GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-photon laser ablation of cytoplasmic microtubule organizing centers in mouse oocytes

난 모세포 감수 분열의 충실도는 발달 적으로 유능한 유배체 알을 생성하는 데 중요합니다. 포유류에서 난 모세포는 첫 번째 감수 분열의 I 단계에서 긴 정지를 겪습니다. 사춘기 이후와 감수 분열이 재개되면 핵막이 분해되고 (핵 외피 파괴) 스핀들은 주로 난 모세포 중심에서 조립됩니다. 초기 중앙 스핀들 위치는 비정상적인 키네토코어-미세소관(MT) 부착물 및 이수성으로부터 보호하는 데 필수적입니다. 중앙에 위치한 스핀들은 시간에 민감한 방식으로 피질쪽으로 이동하며, 이는 작은 극체를 압출하는 데 필요한 과정입니다. 유사분열 세포에서 스핀들 위치는 중심체 매개 아스트랄 MT와 세포 피질 사이의 상호 작용에 의존합니다. 반대로, 마우스 난 모세포는 고전적인 중심체가 부족하고 대신 수많은 중심 MT 조직 센터 (MTOC)를 포함합니다. 중기 I 단계에서 마우스 난 모세포는 두 가지 다른 MTOC 세트를 가지고 있습니다 : (1) 스핀들 폴 (극성 MTOC)을 조립하기 위해 클러스터링되고 분류 된 MTOC와 (2) 세포질에 남아 있고 스핀들 형성에 직접 기여하지는 않지만 스핀들 위치 및시기 적절한 스핀들 이동을 조절하는 데 중요한 역할을하는 중기 세포질 MTOC (mcMTOC). 여기서, Cep192-eGfp 리포터 마우스로부터 수집된 난모세포에서 내인성으로 표지된 mcMTOCs를 선택적으로 고갈시키기 위한 다광자 레이저 절제 방법이 설명된다. 이 방법은 포유류 난 모세포에서 스핀들 위치 및 이동의 기초가되는 분자 메커니즘의 이해에 기여합니다.

다광자 레이저 절제는 세포 내 구조를 선택적으로 제거하는 효율적인 방법을 제공합니다. 현재 연구는 마우스 난 모세포에서 mcMTOC를 선택적으로 고갈시키기 위해 다광자 레이저 제거를 사용했습니다. 레이저 제거는 표적 mcMTOC의 내인성 GFP 형광이 배경과 유사한 수준으로 감소하는 것으로 나타난 바와 같이 mcMTOC를 효율적으로 고갈시켰습니다. 표적 mcMTOC의 외인성 mCh-Cep192도 레이저 절제 후 폐지되었습니다. mcMTOC의 레이저 제거는 난모세포 내의 모든 mcMTOC가 고갈되도록 난모세포 내의 다른 초점면(mcMTOC가 있는 곳, 그림 2)에서 수행해야 합니다(그림 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig01.jpg"> 그림 1: 난모세포 미세 주입. mCh-Cep192 cRNA를 갖는 전상 I- 체포 마우스 난 모세포의 미세 주입. 스케일 바: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig02.jpg"> 그림 2: 마우스 난모세포에서 mcMTOC의 고갈. 단일 초점면의 대표 이미지. 흰색 사각형은 다광자 레이저 제거 전후의 mcMTOC를 나타냅니다. 스케일 바: 40 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig03.jpg"> 그림 3: 마우스 난모세포의 다른 초점면에서 mcMTOC의 고갈. mcMTOC 절제 마우스 난모세포의 대표적인 최대 투영 이미지. 스케일 바: 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1 : Chatot, Ziomek 및 Bavister (CZB) 및 중탄산염이없는 최소 필수 배지 (MEM / PVP)의 조성물. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439_Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Multi-Photon Laser Ablation of Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers in Mouse Oocytes

근적외선 펨토초 레이저를 사용하여 중기 I 동안 마우스 난 모세포에서 세포질 미세 소관 조직 중심의 고갈을 가능하게하는 최적화 된 프로토콜이 제시됩니다.

마우스 난모세포에서 세포질 미세소관 조직 센터의 다광자 레이저 제거

The fidelity of oocyte meiosis is critical for generating developmentally competent euploid eggs. In mammals, the oocyte undergoes a lengthy arrest at ...

multi-photon-laser-ablation-cytoplasmic-microtubule-organizing

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

1.6K 조회수.  University of Missouri. 근적외선 펨토초 레이저를 사용하여 중기 I 동안 마우스 난 모세포에서 세포질 미세 소관 조직 중심의 고갈을 가능하게하는 최적화 된 프로토콜이 제시됩니다. 

비디오: Multi-Photon Laser Ablation of Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers in Mouse Oocytes

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures. 
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

Here we present a protocol for the characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar organization.

핵소체 염색질 조직을 바탕으로 마우스 전 정부 난 모세포의 분리 및 특성

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

연구

발생학

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their abundant pluripotent stem cell population and ability to regenerate all cell and tissue types after injuries that would be catastrophic for most animals. Recently, planarians have gained popularity as a model for eye regeneration. Their ability to regenerate the entire eye (comprised of two tissue types: pigment cells and photoreceptors) allows for the dissection of the mechanisms regulating visual system regeneration. Eye ablation has several advantages over other techniques (such as decapitation or hole punch) for examining eye-specific pathways and mechanisms, the most important of which is that regeneration is largely restricted to eye tissues alone. The purpose of this video article is to demonstrate how to reliably remove the planarian optic cup without disturbing the brain or surrounding tissues. The handling of worms and maintenance of an established colony is also described. This technique uses a 31 G, 5/16-inch insulin needle to surgically scoop out the optic cup of planarians immobilized on a cold plate. This method encompasses both single and double eye ablation, with eyes regenerating within 1-2 weeks, allowing for a wide range of applications. In particular, this ablation technique can be easily combined with pharmacological and genetic (RNA interference) screens for a better understanding of regenerative mechanisms and their evolution, eye stem cells and their maintenance, and phototaxic behavioral responses and their neurological basis.

This protocol shows how to consistently excise planarian eyes (optic cups) without disturbing surrounding tissues. Using an insulin needle and syringe, either one or both eyes can be ablated to facilitate investigations into the mechanisms regulating eye regeneration, the evolution of visual regeneration, and the neural basis of light-induced behavior.

수술 절제 분석 플라나리아에 아이 재생을 유학을위한

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

실시간으로 개발을 시각화 하기 위해 다중 광자 시간 경과 영상: 마이그레이션 Zebrafish 태아 신경 크레스트 셀의 시각화

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus improving the overall pregnancy outcome. We recently developed a classification method based on microscopic live observations of mouse oocytes during their in vitro maturation from the germinal vesicle (GV) to the metaphase II stage, followed by the analysis of the cytoplasmic movements occurring during this time-lapse period. Here, we present detailed protocols of this procedure. Oocytes are isolated from fully-grown antral follicles and cultured for 15 h inside a microscope equipped for time-lapse analysis at 37 &#176;C and 5% CO2. Pictures are taken at 8 min intervals. The images are analyzed using the Particle Image Velocimetry (PIV) method that calculates, for each oocyte, the profile of Cytoplasmic Movement Velocities (CMVs) occurring throughout the culture period. Finally, the CMVs of each single oocyte are fed through a mathematical classification tool (Feed-forward Artificial Neural Network, FANN), which predicts the probability of a gamete to be developmentally competent or incompetent with an accuracy of 91.03%. This protocol, set up for the mouse, could now be tested on oocytes of other species, including humans.

Here, we present a protocol for non-invasive assessment of oocyte developmental competence performed during their in vitro maturation from the germinal vesicle to the metaphase II stage. This method combines time-lapse imaging with particle image velocimetry (PIV) and neural network analyses.

발달 능력 또는 무능 한 마우스 가득 Oocytes의 신경 네트워크 기반 식별

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus ...

Confocal Microscope-Based Laser Ablation and Regeneration Assay in Zebrafish Interneuromast Cells

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally replenished in non-mammalian vertebrates such as zebrafish. The zebrafish lateral line system is a useful model for characterizing sensory hair cell regeneration. The lateral line is comprised of hair cell-containing organs called neuromasts, which are linked together by a string of interneuromast cells (INMCs). INMCs act as progenitor cells that give rise to new neuromasts during development. INMCs can repair gaps in the lateral line system created by&#160;cell death. A method is described here for selective INMC ablation using a conventional laser-scanning confocal microscope and transgenic fish that express green fluorescent protein in INMCs. Time-lapse microscopy is then used to monitor INMC regeneration and determine the rate of gap closure. This represents an accessible protocol for cell ablation that does not require specialized equipment, such as a high-powered pulsed ultraviolet laser. The ablation protocol may serve broader interests, as it could be useful for the ablation of additional cell types, employing a tool set that is already available to many users. This technique will further enable the characterization of INMC regeneration under different conditions and from different genetic backgrounds, which will advance the understanding of sensory progenitor cell regeneration.

Laser ablation is a widely applicable technology for studying regeneration in biological systems. The presented protocol describes use of a standard laser-scanning confocal microscope for laser ablation and subsequent time-lapse imaging of regenerating interneuromast cells in the zebrafish lateral line.

제브라피시 간 신경종 세포의 공초점 현미경 기반 레이저 절제 및 재생 분석

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally ...

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to promote biodiversity preservation. In felids, most species are threatened with extinction, and domestic breeds are used as a model to increase the efficiency of protocols for germplasm banking. Among oocyte cryopreservation techniques, vitrification is more and more popular in human and veterinary assisted reproduction. Cryotop vitrification, which was at first developed for human oocytes and embryos, has demonstrated to be well-suited for cat oocytes. This method offers several advantages, such as the feasibility in field conditions and the speed of the procedure, which can be helpful when several samples need to be processed. However, the efficiency is strongly dependent on the operator&#8217;s skills, and intra- and inter-laboratory standardization are needed, as well as personnel training. This protocol describes minimum volume vitrification of immature feline oocytes on a commercial support in a step by step field-friendly protocol, from oocyte collection to warming. Following the protocol, preservation of oocyte integrity and viability at warming (as high as 90%) can be expected, although there is still room for improvement in post-warming maturation and embryonic development outcomes.

This manuscript describes a protocol for the minimum volume vitrification of immature cat oocytes with laboratory-made media on commercial supports. It covers every step from oocyte isolation from ex vivo gonads to vitrification and warming.

미성숙한 고양이 오키트의 최소 볼륨 바이트화

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that during the reproductive life span only about 1% of the oocytes in an ovary mature and ovulate, several techniques have been developed to increase the exploitation of the ovarian reserve to the growing population of non-ovulatory follicles. Such technologies have allowed interventions of fertility preservation, selection programs in livestock, and conservation of endangered species. However, the vast potential of the ovarian reserve is still largely unexploited. In cows, for instance, some attempts have been made to support in vitro culture of oocytes at specific developmental stages, but efficient and reliable protocols have not yet been developed. Here we describe a culture system that reproduce the physiological conditions of the corresponding follicular stage, defined to develop in vitro growing oocytes collected from bovine early antral follicles to the fully-grown stage, corresponding to the medium antral follicle in vivo. A combination of hormones and a phosphodiesterase 3 inhibitor was used to prevent untimely meiotic resumption and to guide oocyte&#39;s differentiation.

We describe the procedures for isolation of growing oocytes from ovarian follicles at early stages of development, as well as the setup of an in vitro culture system which can support the growth and differentiation up to the fully-grown stage. &#160;

가축의 초기 개국 여포에서 온수에 대한 생체 외 문화 전략

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of oocytes and surrounding follicular cells. It is vital to separate both follicular cells and oocytes for various research purposes such as for primary culture of follicular cells, analysis of gene expression, oocyte maturation and in vitro fertilization, etc. The conventional method uses forceps to separate both compartments, which is laborious, time consuming and has high damage to the oocyte. Here, we have established a simple method to separate both compartments using a pulled glass capillary. Under a stereomicroscope, oocytes and follicular cells can be easily separated by pipetting in a pulled fine glass capillary (the diameter depends on the follicle diameter). Compared with the conventional method, this new method has high efficiency in separating both oocytes and follicular cells and has low damage to the oocytes. More importantly, this method can be applied to early-stage follicles including at the pre-vitellogenesis stage. Thus, this simple method can be used to separate follicular cells and oocytes of zebrafish.

Here, we present a simple method for separating follicular cells and oocytes in zebrafish ovarian follicles, which will facilitate investigations of ovarian development in zebrafish.

얼룩말 피시의 난소 여포에서 여포 세포와 난소 세포의 분리

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...

Vitrification of In Vitro Matured Oocytes Collected from Adult and Prepubertal Ovaries in Sheep

In livestock, in vitro embryo production systems can be developed and sustained thanks to the large number of ovaries and oocytes that can be easily obtained from a slaughterhouse. Adult ovaries always bear several antral follicles, while in pre-pubertal donors the maximal numbers of oocytes are available at 4 weeks of age, when ovaries bear peak numbers of antral follicles. Thus, 4 weeks old lambs are considered good donors, even if the developmental competence of prepubertal oocytes is lower compared to their adult counterpart. 
Basic research and commercial applications would be boosted by the possibility of successfully cryopreserving vitrified oocytes obtained from both adult and prepubertal donors. The vitrification of oocyte collected from prepubertal donors would also allow shortening the generation interval and thus increasing the genetic gain in breeding programs. However, the loss of developmental potential after cryopreservation makes mammalian oocytes probably one of the most difficult cell types to cryopreserve. Among the available cryopreservation techniques, vitrification is widely applied to animal and human oocytes. Despite recent advancements in the technique, exposures to high concentrations of cryoprotective agents as well as chilling injury and osmotic stress still induce several structural and molecular alterations and reduce the developmental potential of mammalian oocytes. Here, we describe a protocol for the vitrification of sheep oocytes collected from juvenile and adult donors and matured in vitro prior to cryopreservation. The protocol includes all the procedures from oocyte in vitro maturation to vitrification, warming and post-warming incubation period. Oocytes vitrified at the MII stage can indeed be fertilized following warming, but they need extra time prior to fertilization to restore damage due to cryopreservation procedures and to increase their developmental potential. Thus, post-warming culture conditions and timing are crucial steps for the restoration of oocyte developmental potential, especially when oocyte are collected from juvenile donors.

The protocol aims at providing a standard method for the vitrification of adult and juvenile sheep oocytes. It includes all the steps from the preparation of the in vitro maturation media to the post-warming culture. Oocytes are vitrified at the MII stage using Cryotop to ensure the minimum essential volume.

양에서 성인 및 프레우버탈 난소에서 채취한 생체외 성숙 난소의 진동

In livestock, in vitro embryo production systems can be developed and sustained thanks to the large number of ovaries and oocytes that can be easily ...

Spatiotemporal Subcellular Manipulation of the Microtubule Cytoskeleton in the Living Preimplantation Mouse Embryo using Photostatins

The microtubule cytoskeleton forms the framework of a cell and is fundamental for intracellular transport, cell division, and signal transduction. Traditional pharmacological disruption of the ubiquitous microtubule network using, for instance, nocodazole can have devastating consequences for any cell. Reversibly photoswitchable microtubule inhibitors have the potential to overcome the limitations by enabling drug effects to be implemented in a spatiotemporally-controlled manner. One such family of drugs is the azobenzene-based photostatins (PSTs). These compounds are inactive in dark conditions, and upon illumination with UV light, they bind to the colchicine-binding site of &#946;-tubulin and block microtubule polymerization and dynamic turnover. Here, the application of PSTs in the 3-dimensional (3D) live preimplantation mouse embryo is set out to disrupt the microtubule network on a subcellular level. This protocol provides instructions for the experimental setup, as well as light activation and deactivation parameters for PSTs using live-cell confocal microscopy. This ensures reproducibility and enables others to apply this procedure to their research questions. Innovative photoswitches like PSTs may evolve as powerful tools to advance the understanding of the dynamic intracellular microtubule network and to non-invasively manipulate the cytoskeleton in real-time. Furthermore, PSTs may prove useful in other 3D structures such as organoids, blastoids, or embryos of other species.

Typical microtubule inhibitors, used widely in basic and applied research, have far-reaching effects on cells. Recently, photostatins emerged as a class of photoswitchable microtubule inhibitors, capable of instantaneous, reversible, spatiotemporally precise manipulation of microtubules. This step-by-step protocol details the application of photostatins in a 3D live preimplantation mouse embryo.