המחברים רוצים להודות לכל חברי מעבדת בלבואלה על עזרתם ודיונים חשובים. המחברים מודים למלינה שו על ששיתפה בחביבות את מבנה mCherry-Cep192. מחקר זה נתמך על ידי R35GM142537 (NIGMS, NIH) ל-AZB.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי אוניברסיטת מיזורי (הבטחת איכות לטיפול בבעלי חיים מספר 9695). במחקר הנוכחי נעשה שימוש בעכברות בנות 6-8 שבועות של Cep192-eGFP . כדי ליצור עכברי כתב Cep192-eGFP , נעשה שימוש בתיקון מונחה הומולוגיה בתיווך CRISPR/Cas9 כדי לשלב את הגן המדווח EGFP בגנום העכבר CF-1. כתב ה-EGFP התמזג ב-C-terminus של Cep192 (מרכיב אינטגרלי של MTOCs)15. כדי לתחזק את מושבת העכברים, נעשה שימוש בעכברי כתב Cep192-eGfp . כל בעלי החיים הוחזקו בכלובים (עד ארבע חיות / כלוב) ב 21 מעלות צלזיוס ו -55% לחות, עם מחזור אור / חושך של 12 שעות וגישה ad libitum למזון ומים.
1. אוסף ביצית עכבר
<ol><li>הכינו את מדיום התרבית (צ'אטו, זיומק ובאביסטר, CZB19, ראו טבלת החומרים), ודגרו אותו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך הלילה. הערה: ניתן לאחסן את המדיום CZB בטמפרטורה של 4 °C למשך חודש אחד (ראה קובץ משלים 1 להרכב המדיה).</li>
	<li>הוסיפו למדיום CZB גלוטמין (1 מ"מ) ומילרינון (2.5 מ"מ) (CZB + M) (ראו טבלת חומרים), והניחו אותו באינקובטור. הערה: מילרינון הוא מעכב פוספודיאסטראז השומר על הביציות שנעצרו בפרופזה I ומונע חידוש מיוטי20.</li>
	<li>הכן את מדיום האיסוף (מדיום חיוני מינימלי ללא ביקרבונט, MEM) המכיל 3 מ"ג/מ"ל פוליוויניל פירולידון (PVP), 25 mM HEPES (pH 7.3) (קובץ משלים 1), ומילרינון (2.5 mM) (MEM/PVP + M, ראה טבלת החומרים).</li>
	<li>הכינו את כלי האיסוף והתרבית, הכינו ארבע מיקרו-טיפות (100 μL) של מדיום איסוף (MEM/PVP + M) ושתי מיקרו-טיפות (100 μL) של תרבית (CZB + M) בינוניות בצלחות פטרי בקוטר 60 מ"מ ו-35 מ"מ, בהתאמה, וכסו אותן בשמן מינרלי (ראו טבלת חומרים). שמור את צלחת האיסוף על שקופית חמה יותר, והכניס את צלחת התרבית לחממה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2.</li>
	<li>יש להזריק תוך צפק 5 יחב"ל של גונדוטרופין בסרום של סוסה הרה (PMSG, ראו טבלת חומרים) לעכברות בוגרות מינית (בנות 6-8 שבועות) Cep192-eGFP 44-48 שעות לפני איסוף הביציות.</li>
	<li>להקריב את העכברים על ידי נקע צוואר הרחם, לזהות ולהסיר את השחלות21, ולהעביר אותם לתוך זכוכית שעון המכילה אמצעי איסוף מראש (MEM / PVP + M) ב 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>מקבעים את השחלה על ידי נגיעה במזרק של 1 מ"ל בתחתית זכוכית השעון ומנקבים אותו מספר פעמים (~ 40 פעמים לכל שחלה) באמצעות מחטי תפירה המחוברות יחד כדי לשחרר את הביציות למדיום.</li>
	<li>באמצעות פיפט העברת פלסטיק, מעבירים את כל המדיום המכיל את קומפלקסי הקומולוס-ביצית (COCs) משלב 1.7 לתוך צלחת פטרי פלסטיק ריקה בקוטר 100 מ"מ.</li>
	<li>תחת סטריאומיקרוסקופ, אספו את ה-COCs באמצעות פיפט זכוכית פסטר, והעבירו אותם לצלחת האיסוף המכילה MEM/PVP + M.</li>
	<li>באמצעות פיפט זכוכית פסטר צר (בקוטר של כ-100 מיקרומטר), מפרקים את הביציות באופן מכני על ידי פיפטציה עדינה שחוזרת על עצמה, ולאחר מכן מעבירים ושוטפים אותן בארבע טיפות מיקרו של (100 μL) MEM/PVP + M (צלחת האיסוף) לפני העברתן לצלחת התרבית CZB + M.</li>
	<li>לדגום את הביציות denuded במשך 1 שעה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% של CO2 באוויר.</li>
</ol>2. מיקרו הזרקת ביציות
<ol><li>הכניסו טיפה של 250 μL של MEM/PVP + M לתוך מכסה צלחת פטרי מפלסטיק בקוטר 100 מ"מ, וכסו אותה בשמן מינרלי. הערה: מכסה צלחת פטרי כולל שפה תחתונה המספקת יותר מקום להתאמת המיקרומניפולטור.</li>
	<li>הפעל את מערכת המיקרו-הזרקות (ראה טבלת החומרים).</li>
	<li>מניחים את צלחת המיקרו-הזרקה על שלב ההתחממות (37 מעלות צלזיוס) של המיקרוסקופ.</li>
	<li>טען את מחט ההזרקה עם 0.5 μL של mCh-Cep192cRNA באמצעות קצוות פיפטה microloader (ראה טבלת חומרים), והצמיד את מחט ההזרקה למיקרומניפולטור.</li>
	<li>מעבירים את הביציות המנודות (שלב 1.11) למיקרודרופ 250 μL (שלב 2.1).</li>
	<li>תחת עדשה אובייקטיבית של 20x או 40x, התאימו את המיקום ואת המיקוד של ההזרקה ומחטי ההחזקה בהתאם לתנוחת הביציות (איור 1).</li>
	<li>הגדר את יחידת המיקרו-הזרקה, והגדר את לחץ ההזרקה (p i), לחץ הפיצוי (pc) וזמן ההזרקה (ti) כך שיוכלו להזריק 5-10 pl של mCh-Cep192 cRNA (כדי לסמן באופן אקסוגני את ה- MTOCs).</li>
	<li>בזהירות להזריק את הביציות מבלי לגעת בגרעין.</li>
	<li>לאחר הזרקת כל הביציות, שטפו אותן בשלוש טיפות מיקרו של CZB + M, העבירו אותן לצלחת התרבית (CZB + M), ודגרו אותן במשך 3 שעות ב-37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר ביטוי mCh-Cep192.</li>
</ol>3. הבשלת ביציות
<ol><li>הכן את מדיום ההבשלה על ידי הוספת גלוטמין (1 מ"מ) למדיום CZB בשיווי משקל מראש באינקובטור עם 5% CO2 באוויר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות לפחות.</li>
	<li>מכינים שתי מיקרו-טיפות (100 μL) של מדיום ההבשלה בצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ, ומכסים אותן בשמן מינרלי (צלחת הבשלה).</li>
	<li>יש לשטוף לפחות שלוש פעמים במיקרו-טיפות CZB נטולות 100 μL כדי להסיר לחלוטין את המילרינון ולאפשר חידוש מיוטי.</li>
	<li>מעבירים את הביציות לצלחת ההבשלה, ודוגרים אותן במשך 5 שעות (שלב Prometaphase I) באינקובטור לח עם 5% CO2 באוויר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>4. הכנת ביציות לאבלציה והדמיה
<ol><li>מעבירים את הביציות של Prometaphase I (שלב 3.4) לצלחת תרבית עם תחתית זכוכית המכילה 100 μL של מדיום הבשלה (שלב 3.1) מכוסה בשמן מינרלי.</li>
</ol>5. הכנת מיקרוסקופ לאבלציה
<ol><li>לפחות 30 דקות לפני אבלציה, הפעל את בקר הטמפרטורה של חממת הבמה (ראה טבלת חומרים) והגדר אותו ל-37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הפעל את בקר CO 2 והגדר אותו ל- 5% CO2.</li>
	<li>בחרו מטרה אפוכרומטית של טבילת שמן פי 40, ומרחו טיפה קטנה משמן הטבילה.</li>
	<li>הרכיבו את צלחת התרבית בעלת תחתית הזכוכית עם הביציות על אינקובטור עליון, וכיסו את האינקובטור במכסה גז.</li>
	<li>בתוכנת רכישת התמונה (ראו טבלת חומרים), בחרו אפשרות המאפשרת שמירה של מיקומי במה מרובים (לדוגמה, "הגדר סימן ומצא ניסוי"). באמצעות תאורת אור המועברת, מרכז על הביציות הבודדות ושמור את מיקומן.</li>
	<li>בתוכנת רכישת התמונות, בחר את מצב הסריקה XYZ , הגדר את פורמט התמונה ל- 256 x 256 פיקסלים, הגדר את גורם הזום ל- 2.5x - 3.0x ובחר תדר סריקה של 600 הרץ. זה מתאים לזמן השהייה של פיקסל של כ-1.6 μs.</li>
	<li>הגדר קו לייזר עירור של 488 ננומטר בכ-10% מעוצמת הלייזר (המתאימה ל-4.0 מיקרו-וואט ברמת הדגימה) (ראו טבלת חומרים), והשתמש ברוחב פס ספקטרלי של 500-550 ננומטר כדי לצפות באות GFP מה-MTOCs. לתצפית סימולטנית של פלואורסצנציה מ- Cep192 המתויג mCherry, הגדר קו לייזר עירור של 585 ננומטר בכ-8% מעוצמת הלייזר (המתאימה ל-10.7 μW ברמת הדגימה), והשתמש בגלאי אחר שנקבע לרוחב פס ספקטרלי של 595-645 ננומטר. הערה: כדאי להשתמש בגלאי האור המועבר (TLD) של המיקרוסקופ הקונפוקלי לגילוי גבולות ביציות בו-זמנית.</li>
	<li>באמצעות מצב סריקה חי ושליטה ידנית של כונן z, מסך את הביצית עבור MTOCs.</li>
	<li>לאחר זיהוי mcMTOC, צייר סביבו אזור מרובע של עניין (ROI).</li>
</ol>6. אבלציה של mcMTOCs
<ol><li>הגדר לייזר פמטו-שניות לאורך גל של 740 ננומטר. הערה: ניתן לשנות את אורך גל הלייזר בהתאם למיקרוסקופ ולתנאי הלייזר.</li>
	<li>השתמש במודולטור האלקטרו-אופטי של המיקרוסקופ הרב-פוטוני (ראו טבלת חומרים) כדי להגדיר את עוצמת הלייזר ל-70%-80%, המתאימה להספק של 60-70 mW במישור הדגימה. הערה: אם הלייזר מצויד במפצה דופק femtosecond, השתמש בו כדי לתקן פיזור עיכוב קבוצתי (GDD). תיקון GDD מפחית את כמות כוח הלייזר הנדרשת לאבלציה יעילה של mcMTOC וממזער את הנזק לביצית. בקרת GDD משולבת בדרך כלל עם תוכנת רכישת התמונה של מיקרוסקופים מסחריים מרובי פוטונים.</li>
	<li>השתמש באותו פורמט תמונה, מקדם זום ותדירות סריקה כמו בשלב 5.6. הגדר את הפרמטרים לממוצע של קו ומסגרת ל- 1.</li>
	<li>לחץ על כפתור הסריקה בתוכנה כדי לבצע את האבלציה של mcMTOC על ידי ביצוע סריקת לייזר אחת של החזר ההשקעה שנבחר.</li>
	<li>השתמש בהגדרות הערוץ משלב 5.7 כדי לסקור את תוצאות האבלציה על-ידי השוואת התמונות של המבנים בעלי תווית GFP שצולמו לפני ואחרי החשיפה ללייזר מרובה פוטונים. אם האבלציה מצליחה, עוצמת הפלואורסצנציה של GFP ב-mcMTOC הממוקד יורדת לרמות שנצפו ברקע.</li>
	<li>אם נותרו כמה קטעים ממבנה תיוג GFP, חזור על שלב 6.4 פעם אחת או יותר על-ידי התמקדות במישורי z שונים של ה-mcMTOC.</li>
	<li>השתמש בהגדרות הערוץ משלב 5.7 כדי לאמת את יעילות האבלציה על-ידי אובדן מוחלט של אותות mCherry הקשורים ל-mcMTOC (mCh-Cep192).</li>
	<li>חזור על שלב 5.8 לשלב 6.7 עד שכל ה- MTOCs של ביצית (במישורי מוקד שונים) יתבטלו. הערה: פרוטוקול זה משתמש במיקרו-הזרקה mCh-Cep192 כאסטרטגיה לאישור דלדול mcMTOC בעקבות חשיפה ללייזר מרובה פוטונים ולא כולל את האפשרות שאובדן פלואורסצנציה של GFP נגרם על ידי הלבנת תמונות GFP. עם זאת, המיקרו-הזרקה של בדיקה זו היא אופציונלית ואינה נדרשת להליך האבלציה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bennabi, I., Terret, M. E., Verlhac, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+spindle+assembly+and+chromosome+segregation+in+oocytes.">Meiotic spindle assembly and chromosome segregation in oocytes.</a> Journal of Cell Biology. 215 (5), 611-619 (2016).</li><li>Hashimoto, N., Kishimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+meiotic+metaphase+by+a+cytoplasmic+maturation-promoting+factor+during+mouse+oocyte+maturation.">Regulation of meiotic metaphase by a cytoplasmic maturation-promoting factor during mouse oocyte maturation.</a> Development Biology. 126 (2), 242-252 (1988).</li><li>Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+kinetochore+tracking+reveals+error-prone+homologous+chromosome+biorientation+in+mammalian+oocytes.">Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes.</a> Cell. 146 (4), 568-581 (2011).</li><li>Azoury, J., Verlhac, M. H., Dumont, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+filaments:+Key+players+in+the+control+of+asymmetric+divisions+in+mouse+oocytes.">Actin filaments: Key players in the control of asymmetric divisions in mouse oocytes.</a> Biology of the Cell. 101 (2), 69-76 (2009).</li><li>Li, H., Guo, F., Rubinstein, B., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-driven+chromosomal+motility+leads+to+symmetry+breaking+in+mammalian+meiotic+oocytes.">Actin-driven chromosomal motility leads to symmetry breaking in mammalian meiotic oocytes.</a> Nature Cell Biology. 10 (11), 1301-1308 (2008).</li><li>Schuh, M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+for+asymmetric+spindle+positioning+in+mouse+oocytes.">A new model for asymmetric spindle positioning in mouse oocytes.</a> Current Biology. 18 (24), 1986-1992 (2008).</li><li>Pimenta-Marques, A., Bettencourt-Dias, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericentriolar+material.">Pericentriolar material.</a> Current Biology. 30 (12), 687-689 (2020).</li><li>Hinchcliffe, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrosome+and+bipolar+spindle+assembly:+Does+one+have+anything+to+do+with+the+other.">The centrosome and bipolar spindle assembly: Does one have anything to do with the other.</a> Cell Cycle. 10 (22), 3841-3848 (2011).</li><li>Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+centrioles+in+the+first+and+second+meiotic+spindles+of+mouse+oocytes.">Absence of centrioles in the first and second meiotic spindles of mouse oocytes.</a> Journal of Cell Science. 11 (2), 521-541 (1972).</li><li>Schuh, M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+MTOCs+replaces+centrosome+function+during+acentrosomal+spindle+assembly+in+live+mouse+oocytes.">Self-organization of MTOCs replaces centrosome function during acentrosomal spindle assembly in live mouse oocytes.</a> Cell. 130 (3), 484-498 (2007).</li><li>Clift, D., Schuh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-step+MTOC+fragmentation+mechanism+facilitates+bipolar+spindle+assembly+in+mouse+oocytes.">A three-step MTOC fragmentation mechanism facilitates bipolar spindle assembly in mouse oocytes.</a> Nature Communications. 6, 7217 (2015).</li><li>Luksza, M., Queguigner, I., Verlhac, M. H., Brunet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebuilding+MTOCs+upon+centriole+loss+during+mouse+oogenesis.">Rebuilding MTOCs upon centriole loss during mouse oogenesis.</a> Developmental Biology. 382 (1), 48-56 (2013).</li><li>Balboula, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haspin+kinase+regulates+microtubule-organizing+center+clustering+and+stability+through+Aurora+kinase+C+in+mouse+oocytes.">Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes.</a> Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).</li><li>Breuer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HURP+permits+MTOC+sorting+for+robust+meiotic+spindle+bipolarity,+similar+to+extra+centrosome+clustering+in+cancer+cells.">HURP permits MTOC sorting for robust meiotic spindle bipolarity, similar to extra centrosome clustering in cancer cells.</a> Journal of Cell Biology. 191 (7), 1251-1260 (2010).</li><li>Londo&#241;o-V&#225;squez, D., Rodriguez-Lukey, K., Behura, S. K., Balboula, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+organizing+centers+regulate+spindle+positioning+in+mouse+oocytes.">Microtubule organizing centers regulate spindle positioning in mouse oocytes.</a> Developmental Cell. 57 (2), 197-211 (2022).</li><li>Konig, K., Riemann, I., Fischer, P., Halbhuber, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+nanosurgery+with+near+infrared+femtosecond+laser+pulses.">Intracellular nanosurgery with near infrared femtosecond laser pulses.</a> Cellular and Molecular Biology. 45 (2), 195-201 (1999).</li><li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation.">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (5), 1808-1817 (2003).</li><li>Maghelli, N., Tolic-Norrelykke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablation+of+the+microtubule+cytoskeleton:+Setting+up+and+working+with+an+ablation+system.">Laser ablation of the microtubule cytoskeleton: Setting up and working with an ablation system.</a> Methods in Molecular Biology. 777, 261-271 (2011).</li><li>Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+culture+medium+supports+development+of+random-bred+1-cell+mouse+embryos+in+vitro.">An improved culture medium supports development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 86 (2), 679-688 (1989).</li><li>Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+maturation+involves+compartmentalization+and+opposing+changes+of+cAMP+levels+in+follicular+somatic+and+germ+cells:+Studies+using+selective+phosphodiesterase+inhibitors.">Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: Studies using selective phosphodiesterase inhibitors.</a> Developmental Biology. 178 (2), 393-402 (1996).</li><li>Greaney, J., Subramanian, G. N., Ye, Y., Homer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+in+vitro+culture+of+mouse+oocytes.">Isolation and in vitro culture of mouse oocytes.</a> Bio Protocol. 11 (15), 4104 (2021).</li><li>Khodjakov, A., Cole, R. W., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synergy+of+technologies:+Combining+laser+microsurgery+with+green+fluorescent+protein+tagging.">A synergy of technologies: Combining laser microsurgery with green fluorescent protein tagging.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 38 (4), 311-317 (1997).</li><li>Pavin, N., Tolic, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+of+the+mitotic+spindle.">Mechanobiology of the mitotic spindle.</a> Developmental Cell. 56 (2), 192-201 (2021).</li><li>Khodjakov, A., Cole, R. W., Oakley, B. R., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome-independent+mitotic+spindle+formation+in+vertebrates.">Centrosome-independent mitotic spindle formation in vertebrates.</a> Current Biology. 10 (2), 59-67 (2000).</li><li>Aist, J. R., Liang, H., Berns, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astral+and+spindle+forces+in+PtK2+cells+during+anaphase+B:+a+laser+microbeam+study.">Astral and spindle forces in PtK2 cells during anaphase B: a laser microbeam study.</a> Journal of Cell Science. 104, 1207-1216 (1993).</li><li>Bennabi, I., Manil-Segalen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Ablation+of+microtubule-chromosome+attachment+in+mouse+oocytes.">Laser Ablation of microtubule-chromosome attachment in mouse oocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1818, 153-161 (2018).</li><li>Milas, A., Jagric, M., Martincic, J., Tolic, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+reversible+knocksideways,+laser+ablation,+and+photoactivation+on+the+mitotic+spindle+in+human+cells.">Optogenetic reversible knocksideways, laser ablation, and photoactivation on the mitotic spindle in human cells.</a> Methods in Cell Biology. 145, 191-215 (2018).</li><li>Warzych, E., Lipinska, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+follicular+environment+during+oocyte+growth+and+maturation.">Energy metabolism of follicular environment during oocyte growth and maturation.</a> Journal of Reproduction and Development. 66 (1), 1-7 (2020).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

קיימות שיטות שונות להפרעה למבנים הקשורים לשלד הציטוסקלטון בתוך תאים22,23,24,25. עם זאת, מציאת טכניקות יעילות כדי לשבש באופן סלקטיבי את המבנה הממוקד מבלי לפגוע בכדאיות התא היא מאתגרת. שיטת האבלציה בלייזר רב-פוטונים המוצגת כאן היא אסטרטגיה יעילה להשראת הפרעה מכנית סלקטיבית ל-mcMTOCs בתוך הביצית מבלי לשנות את כדאיות הביציות.
נעשה שימוש נרחב באבלציה בלייזר כדי להבין את המנגנונים המולקולריים השולטים בהפרדת כרומוזומים במהלך מיטוזהומיוזה 22,23,26,27. בשל גודלם הגדול יחסית (קוטר >80 מ"מ) של ביציות יונקים בהשוואה לתאים סומטיים28, האבלציה של המבנים התוך-תאיים שלהם מהווה אתגר. יתר על כן, נפח mcMTOC הממוצע בביציות metaphase I הוא ~ 20 μm15, המייצג אתגר נוסף. יש לאמץ שיטה יעילה המציעה חדירה עמוקה יותר לרקמות כדי להתגבר על אתגרים אלה. היתרון העיקרי של שימוש בלייזר מרובה פוטונים לאבלציה הוא יכולתו להגיע עמוק יותר לתוך התא תוך מזעור ההשפעות מחוץ למטרה29.
כדי לוודא את היעילות והיעילות של שיטת האבלציה בלייזר כדי לרוקן את המבנה הממוקד, מומלץ להשתמש בחלבון המסומן בפלואורסצנטיות כדי לזהות את המבנה הממוקד לאורך זמן (לפני ואחרי אבלציה)23. חשוב לשים לב שאבלציה בלייזר מדלדלת את כל ה-mcMTOC כמבנה, ולמרות ש-mcMTOCs קטנים יותר דורשים חשיפה אחת בלבד ללייזר כדי להתרוקן, מק-MTOCs גדולים יותר עשויים לדרוש יותר מחשיפה אחת ללייזר במישורי מוקד שונים. מומלץ גם לתקן ולתייג תת-קבוצה של ביציות בקרה ו- mcMTOC-ablated עם סמן MTOC (כגון γ-טובולין, פריצנטרי או Cep192) כדי לאשר את היעילות של אבלציה mcMTOC עוד יותר. בביציות בקרה, אזורים בציטופלסמה הסמוכים ל-mcMTOCs אך אינם חופפים אליהם ייחשפו ללייזר.
ניסוי זה דורש מספר אבלציות של mcMTOC תוך כדי תנועה בין מישורי מוקד שונים בתוך הביציות. לכן, מומלץ מאוד לתרגל טכניקה זו מספר פעמים לפני ביצוע הניסוי כדי למזער את זמן הניסוי, ובכך להגדיל את הכדאיות של הביציות. יתר על כן, חשוב להשתמש בכוח הלייזר המינימלי שמספיק כדי לרוקן את mcMTOCs מבלי להשפיע על כדאיות הביציות.
טכניקה זו יש כמה מגבלות. ראשית, מיקרוסקופים קונפוקליים מרובי פוטונים יקרים יחסית למיקרוסקופים קונפוקליים רגילים. שנית, הפרעה לכל ה-mcMTOCs במישורי מוקד שונים גוזלת זמן רב יותר מאשר הפרעות כימיות או גנטיות. שלישית, פרוטוקול זה דורש מיומנויות טכניות כדי לבטל את כל mcMTOCs בזמן הקצר ביותר האפשרי. עם זאת, לאחר השליטה, השימוש בלייזר מרובה פוטונים מספק אסטרטגיה מצוינת לשבש כמה מבנים תוך תאיים בביציות עכבר, כולל mcMTOCs, תורם להבנת המנגנונים המולקולריים המווסתים את מיקום הציר ואת נדידתו בזמן בביציות יונקים.

גמטות הפלואידים (זרע וביצית) מיוצרות באמצעות מיוזה, הכוללת סיבוב אחד של שכפול DNA ואחריו שתי חלוקות רצופות הנחוצות להפחתת מספר הכרומוזומים לפני ההפריה. ביונקים, במהלך חיי העובר המוקדמים, הביצית עוברת מעצר ממושך (עד גיל ההתבגרות) בשלב הדיפלוטן של פרופאזה I של החלוקה המיוטית הראשונה, שלב הנקרא שלפוחית הנבטית (GV). לאחר חידוש מיוטי, הביצית GV עוברת פירוק מעטפת גרעינית (NEBD), והציר מורכב בעיקר במרכז הביציות 1,2,3. מאוחר יותר, מונע על ידי F-actin, הציר נודד בזמן ממרכז הביציות אל קליפת המוח כדי להבטיח חלוקה אסימטרית מאוד, וכתוצאה מכך ביצה עם גוף קוטבי זעיר (PB)4,5,6.
בתאים מיטוטיים, הצנטרוזומים מורכבים מזוג צנטריולים המוקפים ברכיבי חומר פרי-צנטריולאריים (PMC), כגון פריצנטרי, γ-טובולין, Cep152 ו-Cep1927. צנטרוזומים אלה, המכילים צנטריול, תורמים לנאמנות של היווצרות ציר דו-קוטבי8. עם זאת, צנטריולים הולכים לאיבוד במהלך האוגנזה המוקדמת במינים שונים, כולל מכרסמים9. לכן, ביציות עכבר מאמצות מסלול הרכבה של ציר שאינו תלוי בצנטריול באמצעות מספר רב של מרכזי ארגון מיקרוטובולים (MT) (MTOCs)9,10. עם חידוש המיוט, ה- MTOCs הפרי-גרעיניים עוברים שלושה שלבים נפרדים של עיבוי, מתיחה ופיצול למספר רב של MTOCsקטנים יותר 11,12. לאחר מכן, ה-MTOCs המקוטעים מקובצים באשכולות וממוינים כדי לארגן ציר דו-קוטבי10,13,14. מאגר נוסף של MTOCs ממוקם בציטופלסמה במהלך NEBD. חלק מה-MTOCs הציטופלסמיים האלה נודדים ויוצרים קטבי ציר (MTOCs קוטביים, pMTOCs)10,11. לאחרונה התגלתה תת-קבוצה נוספת של MTOCs ציטופלסמיים, המכונים MTOCs ציטופלסמיים מטאפאזיים (mcMTOCs), שאינם תורמים להיווצרות מוט ציר אך נשארים בציטופלסמה של הביצית במהלך מטאפאזה I (Met I)15. דלדול mcMTOCs על ידי אבלציה לייזר מרובת פוטונים או הגדלה חריגה של מספרם על ידי עיכוב אוטופגיה טורפים מיקום ציר ונדידה ומגדילה את שכיחות האנאופלואידיה בביציות מטאפאזה II15.
באופן מעניין, mcMTOCs שונים מ- pMTOCs בהיבטים רבים15. לדוגמה, בניגוד ל-pMTOCs, שמקורם בעיקר ב-MTOCs פרי-גרעיניים, mMTOCs מקורם בקליפת הביצית. כאשר הציר עדיין במרכז הביצית, ה- mcMTOCs ממוקמים באופן אסימטרי הפוך לצד שאליו הציר נודד עבור שחול PB15. MTs דמויי אסטרל אינם יכולים להגיע לקליפת המוח בתא הביצית הגדול יחסית. לכן, ה-mcMTOCs האלה מנוקאלים MTs כדי לעגן את הציר (באמצעות MTOCs דמויי אסטרל) לקליפת המוח. ממצאים אלה מציעים מודל שבו כוח ה-MT בעל גרעין ה-mcMTOC מנטרל את הכוח המתווך F-actin שמניע את נדידת הציר לכיוון קליפת המוח. האיזון בין שני הכוחות המנוגדים הללו חיוני כדי לווסת את מיקום הציר המרכזי ואת נדידת הצירבזמן 15.
נכון להיום, כל חלבוני ה-PMC שנבדקו (פריצנטריים, g-טובולין, Cep192 ו-Aurora kinase A) מתמקמים בשני מאגרי ה-MTOC: mcMTOCs ו-pMTOCs15. לכן, אין גישה כימית או גנטית להפרעות סלקטיביות של mcMTOCs מבלי להפריע ל-pMTOCs. ניתן לעקוף מגבלות אלה על ידי התמקדות סלקטיבית ב- mcMTOCs עם אבלציה בלייזר. בין הטכנולוגיות מבוססות הלייזר שפותחו עבור מיקרואבלציה, לייזרים פמטו-שניות רב-פוטונים פועמים מראים פוטנציאל רב בשל פגיעתם המדויקת המוגבלת למישור המוקד, עומק החדירה הגבוה של אור אינפרה-אדום קרוב, והפחתת הפוטוטוקסיות והנזק התרמי לתא16,17,18. עבודה זו מתארת גישה סלקטיבית לביטול mcMTOCs בביציות עכבר באמצעות לייזר רב-פוטוני המוצמד למיקרוסקופ הפוך.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4 IN thinwall GL 1.0 OD/.75 ID</td>
			<td>World precision instrument&#160;</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td>Injection needles&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass&#160;</td>
			<td>Fisherbrand&#160;</td>
			<td>Cat# 13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillarities&#160;</td>
			<td>World Precision Instrument&#160;</td>
			<td>Cat# TW100-6</td>
			<td>Holding needles&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage incubator for Leica DMI6000 B microscope</td>
			<td>Life Imaging Services GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chlrode dihydrate</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 controller&#160;</td>
			<td>Pecon</td>
			<td># 0506.000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Cover HP</td>
			<td>Pecon</td>
			<td># 0506.020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Lactic acid&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# L7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMi8</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtojet 4i</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microinjector&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotips Microloader</td>
			<td>Fisher scientific&#160;</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# G1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# 1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish&#160;</td>
			<td>Mat Tek Corporation</td>
			<td>Cat# P35G-1.0-20-C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes Sodium Salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cat # H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hera Cell vios 160i</td>
			<td>Thermo&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>CO2 incubator&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCP SP8 spectral laser scanning confocal micorscope with inverted stand DMI6000 B</td>
			<td>Leica Microsystems, Inc</td>
			<td>N/A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cat#G8540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate dihydrate</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# M7774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai DeepSee Ti-Sapphire femtosecond laser</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCH-Cep192 cRNA</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium Essential Medium Eagle - MEM</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cat #M0258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milrinone</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cat# M4659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cat# M5310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium eagle (MEM)</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# M0268 - 1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: Cep192-eGFP reporter CF-1</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100 mm)</td>
			<td>Fisherbrand&#160;</td>
			<td>Cat# FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (35 mm)</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>Cat# 430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (60 mm)</td>
			<td>Falcon&#160;</td>
			<td>Cat# 351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# P5530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrolidone</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cat# P2307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrolidone (PVP)</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# P2307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant mare&#180;s serum gonadotropin&#160;</td>
			<td>Lee BioSolutions</td>
			<td>Cat# 493-10-10&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# P4562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# P4562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sewing needles&#160;</td>
			<td>D.M.C</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N&#176; 5 * 16 Needles&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage-top heating insert P</td>
			<td>Pecon</td>
			<td># 0426.300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterezoom S9i</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Stereomicroscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td>BD company&#160;</td>
			<td>Cat# 309597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller Tempcontrol 37-2 digital</td>
			<td>Pecon</td>
			<td># 0503.000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Cube temperature controller for the cage incubator</td>
			<td>Life Imaging Services GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-photon laser ablation of cytoplasmic microtubule organizing centers in mouse oocytes

הנאמנות של מיוזה של ביצית היא קריטית ליצירת ביציות אופלואידיות מוכשרות מבחינה התפתחותית. ביונקים, הביצית עוברת מעצר ממושך בפרופאזה I של החטיבה המיוטית הראשונה. לאחר גיל ההתבגרות ועם חידוש המיוט, קרום הגרעין מתפרק (פירוק מעטפת הגרעין), והציר מורכב בעיקר במרכז הביצית. מיקום ציר מרכזי ראשוני חיוני להגנה מפני חיבורים חריגים של קינטוצ'ור-מיקרוטובול (MT) ואנופלואידיה. הציר הממוקם במיקום מרכזי נודד באופן רגיש לזמן לכיוון קליפת המוח, וזהו תהליך הכרחי כדי לבלוט גוף קוטבי זעיר. בתאים מיטוטיים, מיקום הציר מסתמך על האינטראקציה בין MTs אסטרליים בתיווך צנטרוזום לבין קליפת התא. להיפך, ביציות עכבר חסרות צנטרוזומים קלאסיים, ובמקום זאת, מכילות מרכזי ארגון MT אצנטריולאריים רבים (MTOCs). בשלב המטאפאזה I, לביציות עכבר יש שתי קבוצות שונות של MTOCs: (1) MTOCs המקובצים באשכולות וממוינים להרכבת קטבי ציר (MTOCs קוטביים), ו-(2) MTOCs ציטופלסמיים מטאפאזיים (mcMTOCs) שנשארים בציטופלסמה ואינם תורמים ישירות להיווצרות צירים אך ממלאים תפקיד מכריע בוויסות מיקום הציר ונדידת הציר בזמן. כאן מתוארת שיטת אבלציה בלייזר מרובת פוטונים כדי לרוקן באופן סלקטיבי mcMTOCs המסומנים באופן אנדוגני בביציות שנאספו מעכברים מדווחים Cep192-eGfp . שיטה זו תורמת להבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס מיקום ציר ונדידתם בביציות של יונקים.

אבלציה בלייזר מרובה פוטונים מספקת שיטה יעילה לפירוק סלקטיבי של מבנים תוך-תאיים. המחקר הנוכחי השתמש באבלציה של לייזר רב-פוטוני כדי לרוקן mcMTOCs בביציות עכבר באופן סלקטיבי. אבלציה בלייזר דלדלה את ה-mcMTOCs ביעילות, כפי שמראה ההפחתה בפלואורסצנציה האנדוגנית של GFP ב-mcMTOCs הממוקדים לרמה דומה לרקע. mCh-Cep192 אקסוגני ב-mcMTOCs הממוקדים בוטל גם הוא בעקבות אבלציה בלייזר. אבלציה בלייזר של mcMTOCs צריכה להתבצע במישורי מוקד שונים בתוך הביצית (היכן ש-mcMTOCs ממוקמים, איור 2) כדי להבטיח שכל ה-mcMTOCs בתוך הביצית יתרוקנו (איור 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig01.jpg"> איור 1: מיקרו-הזרקת ביציות. מיקרו-הזרקה של ביצית עכבר שנעצרה על ידי Prophase I עם mCh-Cep192 cRNA. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig02.jpg"> איור 2: דלדול של mcMTOCs בביציות עכבר. תמונות מייצגות של מישורי מוקד בודדים. הריבועים הלבנים מציינים mcMTOC לפני ואחרי אבלציה בלייזר מרובה פוטונים. סרגל קנה מידה: 40 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig03.jpg"> איור 3: דלדול של mcMTOCs במישורי מוקד שונים בביצית עכבר. תמונות הקרנה מקסימליות מייצגות של ביצית עכבר אבלציה של mcMTOC. סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
קובץ משלים 1: הרכבים של צ'אטו, זיומק ובאביסטר (CZB) ומדיום חיוני מינימלי ללא ביקרבונט (MEM/PVP). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439_Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multi-Photon Laser Ablation of Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers in Mouse Oocytes at JoVE.com

Multi-Photon Laser Ablation of Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers in Mouse Oocytes

מוצג פרוטוקול אופטימלי המאפשר דלדול של מרכזי ארגון מיקרוטובולים ציטופלסמיים בביציות עכבר במהלך מטאפאזה I באמצעות לייזר פמטו-שניות כמעט אינפרה-אדום.

אבלציה בלייזר רב-פוטונים של מרכזי ארגון מיקרוטובולים ציטופלסמיים בביציות עכבר

The fidelity of oocyte meiosis is critical for generating developmentally competent euploid eggs. In mammals, the oocyte undergoes a lengthy arrest at ...

multi-photon-laser-ablation-cytoplasmic-microtubule-organizing

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

1.6K Views.  University of Missouri. מוצג פרוטוקול אופטימלי המאפשר דלדול של מרכזי ארגון מיקרוטובולים ציטופלסמיים בביציות עכבר במהלך מטאפאזה I באמצעות לייזר פמטו-שניות כמעט אינפרה-אדום. 

Video: Multi-Photon Laser Ablation of Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers in Mouse Oocytes

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures. 
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

Here we present a protocol for the characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar organization.

בידוד ואפיון של עכבר Antral ביציות בהתבסס על ארגון הכרומטין nucleolar

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their abundant pluripotent stem cell population and ability to regenerate all cell and tissue types after injuries that would be catastrophic for most animals. Recently, planarians have gained popularity as a model for eye regeneration. Their ability to regenerate the entire eye (comprised of two tissue types: pigment cells and photoreceptors) allows for the dissection of the mechanisms regulating visual system regeneration. Eye ablation has several advantages over other techniques (such as decapitation or hole punch) for examining eye-specific pathways and mechanisms, the most important of which is that regeneration is largely restricted to eye tissues alone. The purpose of this video article is to demonstrate how to reliably remove the planarian optic cup without disturbing the brain or surrounding tissues. The handling of worms and maintenance of an established colony is also described. This technique uses a 31 G, 5/16-inch insulin needle to surgically scoop out the optic cup of planarians immobilized on a cold plate. This method encompasses both single and double eye ablation, with eyes regenerating within 1-2 weeks, allowing for a wide range of applications. In particular, this ablation technique can be easily combined with pharmacological and genetic (RNA interference) screens for a better understanding of regenerative mechanisms and their evolution, eye stem cells and their maintenance, and phototaxic behavioral responses and their neurological basis.

This protocol shows how to consistently excise planarian eyes (optic cups) without disturbing surrounding tissues. Using an insulin needle and syringe, either one or both eyes can be ablated to facilitate investigations into the mechanisms regulating eye regeneration, the evolution of visual regeneration, and the neural basis of light-induced behavior.

אבלציה כירורגית Assay עבור לימוד Regeneration Eye ב Planarians

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

פוטון רב זמן לשגות הדמיה כדי להמחיש את התפתחות בזמן אמת: ויזואליזציה של העברת תאי הרכס העצבי עוברי דג זברה

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus improving the overall pregnancy outcome. We recently developed a classification method based on microscopic live observations of mouse oocytes during their in vitro maturation from the germinal vesicle (GV) to the metaphase II stage, followed by the analysis of the cytoplasmic movements occurring during this time-lapse period. Here, we present detailed protocols of this procedure. Oocytes are isolated from fully-grown antral follicles and cultured for 15 h inside a microscope equipped for time-lapse analysis at 37 &#176;C and 5% CO2. Pictures are taken at 8 min intervals. The images are analyzed using the Particle Image Velocimetry (PIV) method that calculates, for each oocyte, the profile of Cytoplasmic Movement Velocities (CMVs) occurring throughout the culture period. Finally, the CMVs of each single oocyte are fed through a mathematical classification tool (Feed-forward Artificial Neural Network, FANN), which predicts the probability of a gamete to be developmentally competent or incompetent with an accuracy of 91.03%. This protocol, set up for the mouse, could now be tested on oocytes of other species, including humans.

Here, we present a protocol for non-invasive assessment of oocyte developmental competence performed during their in vitro maturation from the germinal vesicle to the metaphase II stage. This method combines time-lapse imaging with particle image velocimetry (PIV) and neural network analyses.

מזהה מבוססי-רשת עצבית של Oocytes וחוה עכבר נכה כשיר או לא מוכשר

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus ...

Confocal Microscope-Based Laser Ablation and Regeneration Assay in Zebrafish Interneuromast Cells

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally replenished in non-mammalian vertebrates such as zebrafish. The zebrafish lateral line system is a useful model for characterizing sensory hair cell regeneration. The lateral line is comprised of hair cell-containing organs called neuromasts, which are linked together by a string of interneuromast cells (INMCs). INMCs act as progenitor cells that give rise to new neuromasts during development. INMCs can repair gaps in the lateral line system created by&#160;cell death. A method is described here for selective INMC ablation using a conventional laser-scanning confocal microscope and transgenic fish that express green fluorescent protein in INMCs. Time-lapse microscopy is then used to monitor INMC regeneration and determine the rate of gap closure. This represents an accessible protocol for cell ablation that does not require specialized equipment, such as a high-powered pulsed ultraviolet laser. The ablation protocol may serve broader interests, as it could be useful for the ablation of additional cell types, employing a tool set that is already available to many users. This technique will further enable the characterization of INMC regeneration under different conditions and from different genetic backgrounds, which will advance the understanding of sensory progenitor cell regeneration.

Laser ablation is a widely applicable technology for studying regeneration in biological systems. The presented protocol describes use of a standard laser-scanning confocal microscope for laser ablation and subsequent time-lapse imaging of regenerating interneuromast cells in the zebrafish lateral line.

מיקרוסקופ Confocal מבוסס לייזר אבלציה והתחדשות אדון בתאים Interneuromast דגי זברה

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally ...

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to promote biodiversity preservation. In felids, most species are threatened with extinction, and domestic breeds are used as a model to increase the efficiency of protocols for germplasm banking. Among oocyte cryopreservation techniques, vitrification is more and more popular in human and veterinary assisted reproduction. Cryotop vitrification, which was at first developed for human oocytes and embryos, has demonstrated to be well-suited for cat oocytes. This method offers several advantages, such as the feasibility in field conditions and the speed of the procedure, which can be helpful when several samples need to be processed. However, the efficiency is strongly dependent on the operator&#8217;s skills, and intra- and inter-laboratory standardization are needed, as well as personnel training. This protocol describes minimum volume vitrification of immature feline oocytes on a commercial support in a step by step field-friendly protocol, from oocyte collection to warming. Following the protocol, preservation of oocyte integrity and viability at warming (as high as 90%) can be expected, although there is still room for improvement in post-warming maturation and embryonic development outcomes.

This manuscript describes a protocol for the minimum volume vitrification of immature cat oocytes with laboratory-made media on commercial supports. It covers every step from oocyte isolation from ex vivo gonads to vitrification and warming.

כמות מינימלית של ויטריפיקציה של חתולים לא בוגרים

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that during the reproductive life span only about 1% of the oocytes in an ovary mature and ovulate, several techniques have been developed to increase the exploitation of the ovarian reserve to the growing population of non-ovulatory follicles. Such technologies have allowed interventions of fertility preservation, selection programs in livestock, and conservation of endangered species. However, the vast potential of the ovarian reserve is still largely unexploited. In cows, for instance, some attempts have been made to support in vitro culture of oocytes at specific developmental stages, but efficient and reliable protocols have not yet been developed. Here we describe a culture system that reproduce the physiological conditions of the corresponding follicular stage, defined to develop in vitro growing oocytes collected from bovine early antral follicles to the fully-grown stage, corresponding to the medium antral follicle in vivo. A combination of hormones and a phosphodiesterase 3 inhibitor was used to prevent untimely meiotic resumption and to guide oocyte&#39;s differentiation.

We describe the procedures for isolation of growing oocytes from ovarian follicles at early stages of development, as well as the setup of an in vitro culture system which can support the growth and differentiation up to the fully-grown stage. &#160;

במבחנה תרבות אסטרטגיה עבור Oocytes מ זקיק אנטרל מוקדם בבקר

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of oocytes and surrounding follicular cells. It is vital to separate both follicular cells and oocytes for various research purposes such as for primary culture of follicular cells, analysis of gene expression, oocyte maturation and in vitro fertilization, etc. The conventional method uses forceps to separate both compartments, which is laborious, time consuming and has high damage to the oocyte. Here, we have established a simple method to separate both compartments using a pulled glass capillary. Under a stereomicroscope, oocytes and follicular cells can be easily separated by pipetting in a pulled fine glass capillary (the diameter depends on the follicle diameter). Compared with the conventional method, this new method has high efficiency in separating both oocytes and follicular cells and has low damage to the oocytes. More importantly, this method can be applied to early-stage follicles including at the pre-vitellogenesis stage. Thus, this simple method can be used to separate follicular cells and oocytes of zebrafish.

Here, we present a simple method for separating follicular cells and oocytes in zebrafish ovarian follicles, which will facilitate investigations of ovarian development in zebrafish.

הפרדת תאים זקיקים וביצים בזקיקי השחלות של זברהפיש

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...

Vitrification of In Vitro Matured Oocytes Collected from Adult and Prepubertal Ovaries in Sheep

In livestock, in vitro embryo production systems can be developed and sustained thanks to the large number of ovaries and oocytes that can be easily obtained from a slaughterhouse. Adult ovaries always bear several antral follicles, while in pre-pubertal donors the maximal numbers of oocytes are available at 4 weeks of age, when ovaries bear peak numbers of antral follicles. Thus, 4 weeks old lambs are considered good donors, even if the developmental competence of prepubertal oocytes is lower compared to their adult counterpart. 
Basic research and commercial applications would be boosted by the possibility of successfully cryopreserving vitrified oocytes obtained from both adult and prepubertal donors. The vitrification of oocyte collected from prepubertal donors would also allow shortening the generation interval and thus increasing the genetic gain in breeding programs. However, the loss of developmental potential after cryopreservation makes mammalian oocytes probably one of the most difficult cell types to cryopreserve. Among the available cryopreservation techniques, vitrification is widely applied to animal and human oocytes. Despite recent advancements in the technique, exposures to high concentrations of cryoprotective agents as well as chilling injury and osmotic stress still induce several structural and molecular alterations and reduce the developmental potential of mammalian oocytes. Here, we describe a protocol for the vitrification of sheep oocytes collected from juvenile and adult donors and matured in vitro prior to cryopreservation. The protocol includes all the procedures from oocyte in vitro maturation to vitrification, warming and post-warming incubation period. Oocytes vitrified at the MII stage can indeed be fertilized following warming, but they need extra time prior to fertilization to restore damage due to cryopreservation procedures and to increase their developmental potential. Thus, post-warming culture conditions and timing are crucial steps for the restoration of oocyte developmental potential, especially when oocyte are collected from juvenile donors.

The protocol aims at providing a standard method for the vitrification of adult and juvenile sheep oocytes. It includes all the steps from the preparation of the in vitro maturation media to the post-warming culture. Oocytes are vitrified at the MII stage using Cryotop to ensure the minimum essential volume.

ויטריפיקציה של אין ויטרו התבגר אוציטס שנאספו מן השחלות למבוגרים טרום-פוברטל בכבשים

In livestock, in vitro embryo production systems can be developed and sustained thanks to the large number of ovaries and oocytes that can be easily ...

Spatiotemporal Subcellular Manipulation of the Microtubule Cytoskeleton in the Living Preimplantation Mouse Embryo using Photostatins

The microtubule cytoskeleton forms the framework of a cell and is fundamental for intracellular transport, cell division, and signal transduction. Traditional pharmacological disruption of the ubiquitous microtubule network using, for instance, nocodazole can have devastating consequences for any cell. Reversibly photoswitchable microtubule inhibitors have the potential to overcome the limitations by enabling drug effects to be implemented in a spatiotemporally-controlled manner. One such family of drugs is the azobenzene-based photostatins (PSTs). These compounds are inactive in dark conditions, and upon illumination with UV light, they bind to the colchicine-binding site of &#946;-tubulin and block microtubule polymerization and dynamic turnover. Here, the application of PSTs in the 3-dimensional (3D) live preimplantation mouse embryo is set out to disrupt the microtubule network on a subcellular level. This protocol provides instructions for the experimental setup, as well as light activation and deactivation parameters for PSTs using live-cell confocal microscopy. This ensures reproducibility and enables others to apply this procedure to their research questions. Innovative photoswitches like PSTs may evolve as powerful tools to advance the understanding of the dynamic intracellular microtubule network and to non-invasively manipulate the cytoskeleton in real-time. Furthermore, PSTs may prove useful in other 3D structures such as organoids, blastoids, or embryos of other species.

Typical microtubule inhibitors, used widely in basic and applied research, have far-reaching effects on cells. Recently, photostatins emerged as a class of photoswitchable microtubule inhibitors, capable of instantaneous, reversible, spatiotemporally precise manipulation of microtubules. This step-by-step protocol details the application of photostatins in a 3D live preimplantation mouse embryo.