Die Autoren danken allen Mitgliedern des Balboula-Labors für ihre wertvolle Hilfe und Diskussionen. Die Autoren danken Melina Schuh für das freundliche Teilen des mCherry-Cep192-Konstrukts. Diese Studie wurde von R35GM142537 (NIGMS, NIH) an AZB unterstützt.

Alle hier beschriebenen Methoden wurden von der University of Missouri genehmigt (Animal Care Quality Assurance Ref. Nummer 9695). Cep192-eGFP Reporter weibliche Mäuse im Alter von 6-8 Wochen wurden in der vorliegenden Studie verwendet. Um Cep192-eGFP-Reportermäuse zu erzeugen, wurde die CRISPR/Cas9-vermittelte homologiegesteuerte Reparatur verwendet, um das EGFP-Reportergen in das CF-1-Mausgenom zu integrieren. Der EGFP-Reporter wurde an der C-Endstation von Cep192 (einem integralen Bestandteil der MTOCs)15 fusioniert. Um die Mauskolonie zu erhalten, wurden homozygote Cep192-eGfp-Reportermäuse verwendet. Alle Tiere wurden in Käfigen (bis zu vier Tiere/Käfig) bei 21 °C und 55% Luftfeuchtigkeit gehalten, mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus und Ad-libitum-Zugang zu Futter und Wasser.
1. Entnahme von Mauseizellen
<ol><li>Das Kulturmedium (Chatot, Ziomek und Bavister, CZB19, siehe Materialtabelle) vorbereiten und über Nacht bei 37 °C und 5% CO2 inkubieren. HINWEIS: Das CZB-Medium kann 1 Monat lang bei 4 °C gelagert werden (siehe Zusatzdatei 1 für die Medienkomposition).</li>
	<li>Ergänzen Sie das CZB-Medium mit Glutamin (1 mM) und Milrinon (2,5 mM) (CZB + M) (siehe Materialtabelle) und legen Sie es in den Inkubator. HINWEIS: Milrinon ist ein Phosphodiesterase-Hemmer, der die in der Prophase I blockierten Eizellen aufrechterhält und die meiotische Wiederaufnahme verhindert20.</li>
	<li>Bereiten Sie das Sammelmedium (bikarbonatfreies minimales essentielles Medium, MEM) vor, das 3 mg/ml Polyvinylpyrolidon (PVP), 25 mM HEPES (pH 7,3) (Zusatzdossier 1) und Milrinon (2,5 mM) (MEM/PVP + M, siehe Materialtabelle) enthält.</li>
	<li>Bereiten Sie die Sammel- und Kulturschalen vor, stellen Sie vier Mikrotropfen (100 μL) Sammelmedium (MEM/PVP + M) und zwei Mikrotropfen (100 μL) Kulturmedium (CZB + M) in 60 mm bzw. 35 mm Petrischalen her und bedecken Sie sie mit Mineralöl (siehe Materialtabelle). Halten Sie die Auffangschale wärmer auf dem Objektträger und stellen Sie die Kulturschale bei 37 °C und 5% CO2 in den Inkubator.</li>
	<li>Injizieren Sie intraperitoneal 5 IE Serumgonadotropin (PMSG, siehe Materialtabelle) in geschlechtsreife (6-8 Wochen alte) Cep192-eGFP-Reporterinnen 44-48 h vor der Eizellentnahme.</li>
	<li>Opfern Sie die Mäuse durch zervikale Dislokation, identifizieren und entfernen Sie die Eierstöcke21 und geben Sie sie in ein Uhrenglas mit vorgewärmtem Sammelmedium (MEM/PVP + M) bei 37 °C.</li>
	<li>Fixieren Sie den Eierstock, indem Sie eine 1-ml-Spritze am Boden des Uhrenglases berühren und mehrmals (~ 40 Mal pro Eierstock) mit zusammengebündelten Nähnadeln punktieren, um die Eizellen in das Medium freizusetzen.</li>
	<li>Mit einer Kunststoff-Transferpipette wird das gesamte Medium, das die Cumulus-Eizelle-Komplexe (KOK) enthält, aus Schritt 1.7 in eine leere 100-mm-Kunststoff-Petrischale überführt.</li>
	<li>Sammeln Sie die COCs unter einem Stereomikroskop mit einer Pasteur-Glaspipette und geben Sie sie in die Auffangschale, die MEM/PVP + M enthält.</li>
	<li>Mit einer schmalen Pasteur-Glaspipette (ca. 100 μm Durchmesser) werden die Eizellen mechanisch durch sanftes, wiederholtes Pipettieren entgiftet, anschließend in vier Mikrotropfen (100 μL) MEM/PVP + M (die Auffangschale) überführt und gewaschen, bevor sie in die Kulturschale CZB + M überführt werden.</li>
	<li>Die entblößten Eizellen für 1 h bei 37 °C mit 5% CO2 in der Luft bebrüten.</li>
</ol>2. Mikroinjektion von Eizellen
<ol><li>Geben Sie einen 250 μL Tropfen MEM/PVP + M in einen 100 mm Kunststoff-Petrischalendeckel und decken Sie ihn mit Mineralöl ab. HINWEIS: Der Petrischalendeckel hat einen unteren Rand, der mehr Platz für die Einstellung des Mikromanipulators bietet.</li>
	<li>Schalten Sie das Mikroinjektionssystem ein (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Stellen Sie die Mikroinjektionsschale auf den Wärmetisch (37 °C) des Mikroskops.</li>
	<li>Laden Sie die Injektionsnadel mit 0,5 μL mCh-Cep192cRNA unter Verwendung von Mikroladerpipettenspitzen (siehe Materialtabelle) und befestigen Sie die Injektionsnadel am Mikromanipulator.</li>
	<li>Übertragen Sie die entblößten Eizellen (Schritt 1.11) in den 250 μL Mikrotropfen (Schritt 2.1).</li>
	<li>Stellen Sie unter einem 20- oder 40-fachen Objektiv die Position und den Fokus der Injektions- und Haltenadeln entsprechend der Eizellposition ein (Abbildung 1).</li>
	<li>Richten Sie die Mikroinjektionseinheit ein und stellen Sie den Injektionsdruck (pi), den Kompensationsdruck (pc) und die Injektionszeit (ti) ein, um 5-10 pl mCh-Cep192 cRNA injizieren zu können (um die MTOCs exogen zu markieren).</li>
	<li>Injizieren Sie die Eizellen vorsichtig, ohne den Zellkern zu berühren.</li>
	<li>Sobald alle Eizellen injiziert sind, waschen Sie sie in drei Mikrotropfen CZB + M, geben Sie sie in die Kulturschale (CZB + M) und inkubieren Sie sie für 3 h bei 37 ° C, um die mCh-Cep192-Expression zu ermöglichen.</li>
</ol>3. Eizellreifung
<ol><li>Das Reifungsmedium wird durch Zugabe von Glutamin (1 mM) zu CZB-Medium vorbereitet, das in einem Inkubator mit 5%CO2 in Luft bei 37 °C für mindestens 3 h voräquilibriert wurde.</li>
	<li>Zwei Mikrotropfen (100 μL) des Reifungsmediums in einer 35 mm Petrischale herstellen und mit Mineralöl abdecken (Reifungsschale).</li>
	<li>Waschen Sie Prophase-I-blockierte Eizellen mindestens dreimal in 100 μL Milrinon-freien CZB-Mikrotropfen, um das Milrinon vollständig zu entfernen und eine meiotische Wiederaufnahme zu ermöglichen.</li>
	<li>Die Eizellen werden in die Reifungsschale überführt und für 5 h (Prometaphase-I-Stadium) in einem befeuchteten Inkubator mit 5%CO2 in Luft bei 37 °C inkubiert.</li>
</ol>4. Eizellpräparat für Ablation und Bildgebung
<ol><li>Die Prometaphase-I-Eizellen (Schritt 3.4) werden in eine Glasboden-Kulturschale mit 100 μL Reifungsmedium (Schritt 3.1) überführt, die mit Mineralöl bedeckt ist.</li>
</ol>5. Mikroskopische Vorbereitung für die Ablation
<ol><li>Schalten Sie mindestens 30 min vor dem Abtragen den Temperaturregler für den Stufeninkubator ein (siehe Materialtabelle) und stellen Sie ihn auf 37 °C ein.</li>
	<li>Schalten Sie den CO 2 -Regler ein und stellen Sie ihn auf 5% CO2 ein.</li>
	<li>Wählen Sie ein apochromatisches 40-faches Ölimmersionsobjektiv und tragen Sie einen kleinen Tropfen des Immersionsöls auf.</li>
	<li>Montieren Sie die Glasboden-Kulturschale mit den Eizellen auf einen Inkubator und decken Sie den Inkubator mit einem Gasdeckel ab.</li>
	<li>Wählen Sie in der Bilderfassungssoftware (siehe Materialtabelle) eine Option aus, mit der Sie mehrere Stufenpositionen speichern können (z. B. "Markierung definieren und Experiment finden"). Zentrieren Sie mit Durchlicht-Hellfeldbeleuchtung die einzelnen Eizellen und speichern Sie deren Positionen.</li>
	<li>Wählen Sie in der Bilderfassungssoftware den XYZ-Scanmodus , stellen Sie das Bildformat auf 256 x 256 Pixel ein, stellen Sie den Zoomfaktor auf 2,5x - 3,0x ein und wählen Sie eine Scanfrequenz von 600 Hz. Dies entspricht einer Pixelverweilzeit von ca. 1,6 μs.</li>
	<li>Stellen Sie eine 488-nm-Anregungslaserlinie auf etwa 10% der Laserleistung ein (was 4,0 μW auf Probenebene entspricht) (siehe Materialtabelle) und verwenden Sie eine spektrale Bandbreite von 500-550 nm, um das GFP-Signal der MTOCs zu beobachten. Für die gleichzeitige Beobachtung der Fluoreszenz aus dem mCherry-markierten Cep192 stellen Sie eine 585-nm-Anregungslaserlinie auf etwa 8% der Laserleistung ein (was 10,7 μW auf Probenebene entspricht) und verwenden Sie einen anderen Detektor, der auf eine spektrale Bandbreite von 595-645 nm eingestellt ist. HINWEIS: Es ist hilfreich, den Durchlichtdetektor (TLD) des konfokalen Mikroskops zu verwenden, um Eizellgrenzen gleichzeitig zu erkennen.</li>
	<li>Verwenden Sie einen Live-Scan-Modus und die manuelle Steuerung des Z-Laufwerks, um die Eizelle auf MTOCs zu untersuchen.</li>
	<li>Sobald ein mcMTOC erkannt wurde, zeichnen Sie eine quadratische Region of Interest (ROI) um ihn herum.</li>
</ol>6. Ablation von mcMTOCs
<ol><li>Stellen Sie einen Femtosekundenlaser auf eine Wellenlänge von 740 nm ein. HINWEIS: Die Laserwellenlänge kann je nach Mikroskop und Laserbedingungen geändert werden.</li>
	<li>Verwenden Sie den elektrooptischen Modulator des Multiphotonenmikroskops (siehe Materialtabelle), um die Laserleistung auf 70%-80% einzustellen, was 60-70 mW Leistung auf der Probenebene entspricht. HINWEIS: Wenn der Laser mit einem Femtosekunden-Pulskompensator ausgestattet ist, verwenden Sie diesen, um die Gruppenverzögerungsdispersion (GDD) zu korrigieren. Die GDD-Korrektur reduziert die Menge an Laserleistung, die für eine effiziente mcMTOC-Ablation erforderlich ist, und minimiert Lichtschäden an der Eizelle. Die GDD-Steuerung ist in der Regel in die Bildaufnahmesoftware kommerzieller Multiphotonenmikroskope integriert.</li>
	<li>Verwenden Sie dasselbe Bildformat, denselben Zoomfaktor und dieselbe Scanfrequenz wie in Schritt 5.6. Legen Sie die Parameter für die Mittelung von Linie und Rahmen auf 1 fest.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Scan in der Software, um die Ablation des mcMTOC durchzuführen, indem Sie einen einzigen Laserscan des ausgewählten ROI durchführen.</li>
	<li>Verwenden Sie die Kanaleinstellungen aus Schritt 5.7, um die Ergebnisse der Ablation zu überprüfen, indem Sie die Bilder der GFP-markierten Strukturen vergleichen, die vor und nach der Multiphotonen-Laserbelichtung aufgenommen wurden. Wenn die Ablation erfolgreich ist, sinkt die Intensität der GFP-Fluoreszenz im angestrebten mcMTOC auf die im Hintergrund beobachteten Werte.</li>
	<li>Wenn einige Fragmente einer GFP-Markierungsstruktur verbleiben, wiederholen Sie Schritt 6.4 ein- oder mehrmals, indem Sie sich auf verschiedene z-Ebenen des mcMTOC konzentrieren.</li>
	<li>Verwenden Sie die Kanaleinstellungen aus Schritt 5.7, um die Ablationseffizienz durch den vollständigen Verlust von mcMTOC-assoziierten mCherry-Signalen zu überprüfen (mCh-Cep192).</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 5.8 bis Schritt 6.7, bis alle MTOCs einer Eizelle (auf verschiedenen Fokusebenen) abgetragen sind. HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet die mCh-Cep192-Mikroinjektion als Strategie, um die mcMTOC-Depletion nach Multiphotonen-Laserbelichtung zu bestätigen und die Möglichkeit auszuschließen, dass der Verlust der GFP-Fluoreszenz durch GFP-Photobleiche verursacht wird. Die Mikroinjektion dieser Sonde ist jedoch optional und für den Ablationsvorgang nicht erforderlich.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Es gibt verschiedene Methoden, um die zytoskelettbezogenen Strukturen in den Zellen22,23,24,25 zu stören. Es ist jedoch eine Herausforderung, effiziente Techniken zu finden, um die Zielstruktur selektiv zu stören, ohne die Zelllebensfähigkeit zu beeinträchtigen. Die hier vorgestellte Multiphotonen-Laserablationsmethode ist eine effiziente Strategie, um eine selektive mechanische Störung von mcMTOCs innerhalb der Eizelle zu induzieren, ohne die Lebensfähigkeit der Eizellen zu verändern.
Die Laserablation wurde umfassend eingesetzt, um die molekularen Mechanismen zu verstehen, die die Chromosomentrennung während der Mitose und Meiose steuern22,23,26,27. Aufgrund der relativ großen Größe (>80 mm Durchmesser) von Säugetiereizellen im Vergleich zu Körperzellen28 stellt die Ablation ihrer intrazellulären Strukturen eine Herausforderung dar. Darüber hinaus beträgt das durchschnittliche mcMTOC-Volumen in Metaphase-I-Eizellen ~20 μm15, was eine zusätzliche Herausforderung darstellt. Um diese Herausforderungen zu meistern, muss eine effiziente Methode eingesetzt werden, die eine tiefere Gewebepenetration ermöglicht. Der Hauptvorteil der Verwendung des Multiphotonenlasers für die Ablation ist seine Fähigkeit, tiefer in die Zelle einzudringen und gleichzeitig Off-Target-Effekte zu minimieren29.
Um die Wirksamkeit und Effizienz der Laserablationsmethode zum Abbau der Zielstruktur zu überprüfen, wird empfohlen, ein fluoreszenzmarkiertes Protein zu verwenden, um die Zielstruktur im Laufe der Zeit (vor und nach der Ablation) zu identifizieren23. Es ist wichtig zu beachten, dass die Laserablation das gesamte mcMTOC als Struktur erschöpft, und obwohl kleinere mcMTOCs nur eine einzige Laserbelichtung benötigen, um erschöpft zu sein, können größere mcMTOCs mehr als eine Laserbelichtung auf verschiedenen Fokusebenen erfordern. Es wird auch empfohlen, eine Untergruppe von Kontroll- und mcMTOC-ablatierten Eizellen mit einem MTOC-Marker (wie γ-Tubulin, Pericentrin oder Cep192) zu fixieren und zu immunisieren, um die Effizienz der mcMTOC-Ablation weiter zu bestätigen. In Kontrolloozyten werden Bereiche des Zytoplasmas, die direkt an mcMTOCs angrenzen, sich aber nicht mit mcMTOCs überlappen, dem Laser ausgesetzt.
Dieses Experiment erfordert mehrere mcMTOC-Ablationen während der Bewegung zwischen verschiedenen Fokusebenen innerhalb der Eizellen. Daher wird dringend empfohlen, diese Technik vor der Durchführung des Experiments mehrmals zu üben, um die Experimentzeit zu minimieren und dadurch die Lebensfähigkeit der Eizellen zu erhöhen. Darüber hinaus ist es wichtig, die minimale Laserleistung zu verwenden, die ausreicht, um die mcMTOCs zu erschöpfen, ohne die Lebensfähigkeit der Eizellen zu beeinträchtigen.
Diese Technik hat einige Einschränkungen. Erstens sind konfokale Multiphotonenmikroskope relativ teurer als normale konfokale Mikroskope. Zweitens ist die Störung aller mcMTOCs auf verschiedenen Fokusebenen zeitaufwendiger als chemische oder genetische Störungen. Drittens erfordert dieses Protokoll technische Fähigkeiten, um alle mcMTOCs in kürzester Zeit abzutragen. Einmal beherrscht, bietet die Verwendung des Multiphotonenlasers jedoch eine hervorragende Strategie, um mehrere intrazelluläre Strukturen in Mauseizellen, einschließlich mcMTOCs, zu stören, was zum Verständnis der molekularen Mechanismen beiträgt, die die Positionierung der Spindel und ihre rechtzeitige Migration in Säugetiereizellen regulieren.

Haploide Gameten (Spermien und Eizellen) werden durch Meiose produziert, die eine Runde DNA-Replikation beinhaltet, gefolgt von zwei aufeinanderfolgenden Teilungen, die für die Verringerung der Chromosomenzahl vor der Befruchtung notwendig sind. Bei Säugetieren erfährt die Eizelle während des frühen fetalen Lebens einen längeren Arrest (bis zur Pubertät) im Diplotenstadium der Prophase I der ersten meiotischen Teilung, einem Stadium, das als Keimvesikel (GV) bezeichnet wird. Nach der meiotischen Wiederaufnahme erfährt die GV-Eizelle einen Kernhüllenabbau (NEBD), und die Spindel wird hauptsächlich im Eizellzentrum 1,2,3 aufgebaut. Später, angetrieben von F-Aktin, wandert die Spindel rechtzeitig vom Eizellzentrum zum Kortex, um eine stark asymmetrische Teilung zu gewährleisten, was zu einem Ei mit einem winzigen Polkörper (PB)4,5,6 führt.
In mitotischen Zellen bestehen die Zentrosomen aus einem Paar Zentriolen, die von perizentriolären Materialkomponenten (PMC) wie Pericentrin, γ-Tubulin, Cep152 und Cep1927 umgeben sind. Diese zentriolhaltigen Zentrosomen tragen zur Genauigkeit der bipolaren Spindelbildung bei8. Zentriolen gehen jedoch während der frühen Oogenese bei verschiedenen Arten verloren, einschließlich Nagetieren9. Daher nehmen Mauseizellen einen zentriolenunabhängigen Spindelanordnungsweg unter Verwendung zahlreicher acentriolarer Mikrotubuli (MT) Organisationszentren (MTOCs) an9,10. Nach der meiotischen Wiederaufnahme durchlaufen die perinukleären MTOCs drei verschiedene Schritte der Rekondensation, Dehnung und Fragmentierung in eine große Anzahl kleinerer MTOCs11,12. Die fragmentierten MTOCs werden dann gruppiert und sortiert, um eine bipolare Spindel10,13,14 zu organisieren. Ein weiterer Pool von MTOCs befindet sich während der NEBD im Zytoplasma. Einige dieser zytoplasmatischen MTOCs wandern und bilden Spindelpole (polare MTOCs, pMTOCs)10,11. Kürzlich wurde eine weitere Untergruppe zytoplasmatischer MTOCs entdeckt, die als metaphastische zytoplasmatische MTOCs (mcMTOCs) bezeichnet werden, die nicht zur Spindelpolbildung beitragen, sondern während der Metaphase I (Met I) im Zytoplasma der Eizellen verbleiben15. Die Depletion von mcMTOCs durch Multiphotonen-Laserablation oder abnorme Erhöhung ihrer Anzahl durch Autophagiehemmung stört die Positionierung und Migration der Spindel und erhöht die Inzidenz von Aneuploidie in Metaphase-II-Oozyten15.
Interessanterweise unterscheiden sich mcMTOCs in vielerlei Hinsicht von pMTOCs15. Im Gegensatz zu pMTOCs, die hauptsächlich aus perinukleären MTOCs stammen, stammen mcMTOCs beispielsweise aus dem Eizellkortex. Wenn sich die Spindel noch im Zentrum der Eizelle befindet, sind die mcMTOCs asymmetrisch gegenüber der Seite lokalisiert, zu der die Spindel für die PB-Extrusion15 wandert. Astralähnliche MTs können den Kortex in der relativ großen Eizelle nicht erreichen. Daher kernen diese mcMTOCs MTs, um die Spindel (über astralähnliche MTOCs) im Kortex zu verankern. Diese Ergebnisse deuten auf ein Modell hin, in dem die mcMTOC-kernhaltige MT-Kraft der F-Aktin-vermittelten Kraft entgegenwirkt, die die Spindelmigration in Richtung Kortex antreibt. Das Gleichgewicht zwischen diesen beiden entgegengesetzten Kräften ist wesentlich, um die zentrale Spindelpositionierung und die rechtzeitige Spindelmigration zu regulieren15.
Bisher lokalisieren alle untersuchten PMC-Proteine (Pericentrin, g-Tubulin, Cep192 und Aurora-Kinase A) in beiden MTOC-Pools: mcMTOCs und pMTOCs15. Daher gibt es keinen chemischen oder genetischen Ansatz, um mcMTOCs selektiv zu stören, ohne pMTOCs zu stören. Diese Einschränkungen können umgangen werden, indem die mcMTOCs selektiv mit Laserablation anvisiert werden. Unter den laserbasierten Technologien, die für die Mikroablation entwickelt wurden, zeigen gepulste Multiphotonen-Femtosekundenlaser ein großes Potenzial aufgrund ihrer auf die Fokusebene beschränkten Präzisionswirkung, der hohen Eindringtiefe des nahinfraroten Lichts und der reduzierten Phototoxizität und thermischen Schädigung der Zelle16,17,18. Diese Arbeit beschreibt einen selektiven Ansatz zur Ablation von mcMTOCs in Mauseizellen unter Verwendung eines Multiphotonenlasers, der an ein inverses Mikroskop gekoppelt ist.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4 IN thinwall GL 1.0 OD/.75 ID</td>
			<td>World precision instrument&#160;</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td>Injection needles&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass&#160;</td>
			<td>Fisherbrand&#160;</td>
			<td>Cat# 13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillarities&#160;</td>
			<td>World Precision Instrument&#160;</td>
			<td>Cat# TW100-6</td>
			<td>Holding needles&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage incubator for Leica DMI6000 B microscope</td>
			<td>Life Imaging Services GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chlrode dihydrate</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 controller&#160;</td>
			<td>Pecon</td>
			<td># 0506.000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Cover HP</td>
			<td>Pecon</td>
			<td># 0506.020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Lactic acid&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# L7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMi8</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtojet 4i</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microinjector&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotips Microloader</td>
			<td>Fisher scientific&#160;</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# G1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# 1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish&#160;</td>
			<td>Mat Tek Corporation</td>
			<td>Cat# P35G-1.0-20-C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes Sodium Salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cat # H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hera Cell vios 160i</td>
			<td>Thermo&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>CO2 incubator&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCP SP8 spectral laser scanning confocal micorscope with inverted stand DMI6000 B</td>
			<td>Leica Microsystems, Inc</td>
			<td>N/A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cat#G8540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate dihydrate</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# M7774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai DeepSee Ti-Sapphire femtosecond laser</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCH-Cep192 cRNA</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium Essential Medium Eagle - MEM</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cat #M0258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milrinone</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cat# M4659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cat# M5310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium eagle (MEM)</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# M0268 - 1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: Cep192-eGFP reporter CF-1</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100 mm)</td>
			<td>Fisherbrand&#160;</td>
			<td>Cat# FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (35 mm)</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>Cat# 430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (60 mm)</td>
			<td>Falcon&#160;</td>
			<td>Cat# 351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# P5530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrolidone</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cat# P2307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrolidone (PVP)</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# P2307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant mare&#180;s serum gonadotropin&#160;</td>
			<td>Lee BioSolutions</td>
			<td>Cat# 493-10-10&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# P4562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# P4562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sewing needles&#160;</td>
			<td>D.M.C</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N&#176; 5 * 16 Needles&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage-top heating insert P</td>
			<td>Pecon</td>
			<td># 0426.300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterezoom S9i</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Stereomicroscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td>BD company&#160;</td>
			<td>Cat# 309597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller Tempcontrol 37-2 digital</td>
			<td>Pecon</td>
			<td># 0503.000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Cube temperature controller for the cage incubator</td>
			<td>Life Imaging Services GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-photon laser ablation of cytoplasmic microtubule organizing centers in mouse oocytes

Die Treue der Eizellmeiose ist entscheidend für die Erzeugung entwicklungskompetenter euploider Eizellen. Bei Säugetieren erfährt die Eizelle in der Prophase I der ersten meiotischen Teilung einen längeren Arrest. Nach der Pubertät und bei der meiotischen Wiederaufnahme zerlegt sich die Kernmembran (Kernhüllenzusammenbruch), und die Spindel wird hauptsächlich im Zentrum der Eizellen zusammengesetzt. Die anfängliche Positionierung der zentralen Spindel ist unerlässlich, um vor abnormalen Kinetochor-Mikrotubuli (MT)-Anhaftungen und Aneuploidie zu schützen. Die zentral positionierte Spindel wandert zeitkritisch in Richtung Kortex, und dies ist ein notwendiger Prozess, um einen winzigen Polkörper zu extrudieren. In mitotischen Zellen beruht die Spindelpositionierung auf der Interaktion zwischen zentrosomenvermittelten astralen MTs und dem Zellkortex. Im Gegenteil, Mauseizellen fehlen klassische Zentrosomen und enthalten stattdessen zahlreiche acentriolare MT-Organisationszentren (MTOCs). Im Metaphase-I-Stadium haben Maus-Eizellen zwei verschiedene Sätze von MTOCs: (1) MTOCs, die gruppiert und sortiert sind, um Spindelpole (polare MTOCs) zusammenzusetzen, und (2) metaphastische zytoplasmatische MTOCs (mcMTOCs), die im Zytoplasma verbleiben und nicht direkt zur Spindelbildung beitragen, aber eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Spindelpositionierung und der rechtzeitigen Spindelmigration spielen. Hier wird eine Multiphotonen-Laserablationsmethode beschrieben, um endogen markierte mcMTOCs in Eizellen von Cep192-eGfp-Reportermäusen selektiv abzubauen. Diese Methode trägt zum Verständnis der molekularen Mechanismen bei, die der Positionierung und Migration der Spindel in Säugetiereizellen zugrunde liegen.

Die Multiphotonen-Laserablation bietet eine effiziente Methode, um intrazelluläre Strukturen selektiv abzutragen. Die aktuelle Studie verwendete Multi-Photonen-Laserablation, um mcMTOCs in Maus-Eizellen selektiv abzubauen. Die Laserablation dezimierte die mcMTOCs effizient, wie die Reduktion der endogenen GFP-Fluoreszenz in den angestrebten mcMTOCs auf ein mit dem Hintergrund vergleichbares Niveau zeigt. Exogenes mCh-Cep192 in den anvisierten mcMTOCs wurde ebenfalls nach Laserablation abgeschafft. Die Laserablation von mcMTOCs sollte auf verschiedenen Fokusebenen innerhalb der Eizelle durchgeführt werden (wo sich mcMTOCs befinden, Abbildung 2), um sicherzustellen, dass alle mcMTOCs innerhalb der Eizelle erschöpft sind (Abbildung 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig01.jpg"> Abbildung 1: Mikroinjektion von Eizellen. Mikroinjektion einer Prophase-I-blockierten Mauseizelle mit mCh-Cep192 cRNA. Maßstabsleiste: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig02.jpg"> Abbildung 2: Depletion von mcMTOCs in Maus-Eizellen. Repräsentative Bilder einzelner Fokusebenen. Die weißen Quadrate zeigen eine mcMTOC vor und nach der Multiphotonen-Laserablation an. Maßstabsleiste: 40 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig03.jpg"> Abbildung 3: Depletion von mcMTOCs auf verschiedenen Fokusebenen in einer Mauseizelle. Repräsentative Maximalprojektionsbilder einer mcMTOC-ablatierten Mauseizelle. Maßstabsleiste: 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Ergänzungsdatei 1: Kompositionen von Chatot, Ziomek und Bavister (CZB) und bikarbonatfreiem minimal essential medium (MEM/PVP). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439_Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multi-Photon Laser Ablation of Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers in Mouse Oocytes at JoVE.com

Multi-Photon Laser Ablation of Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers in Mouse Oocytes

Es wird ein optimiertes Protokoll vorgestellt, das die Depletion zytoplasmatischer Mikrotubuli-Organisationszentren in Maus-Eizellen während der Metaphase I mit einem Nahinfrarot-Femtosekundenlaser ermöglicht.

Multiphotonen-Laserablation von zytoplasmatischen Mikrotubuli-Organisationszentren in Maus-Eizellen

The fidelity of oocyte meiosis is critical for generating developmentally competent euploid eggs. In mammals, the oocyte undergoes a lengthy arrest at ...

multi-photon-laser-ablation-cytoplasmic-microtubule-organizing

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

1.6K Aufrufe.  University of Missouri. Es wird ein optimiertes Protokoll vorgestellt, das die Depletion zytoplasmatischer Mikrotubuli-Organisationszentren in Maus-Eizellen während der Metaphase I mit einem Nahinfrarot-Femtosekundenlaser ermöglicht. 

Serie: Multi-Photon Laser Ablation of Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers in Mouse Oocytes

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures. 
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

Here we present a protocol for the characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar organization.

Isolierung und Charakterisierung von Maus Antral Oozyten Basierend auf Nucleolar Chromatinorganisation

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their abundant pluripotent stem cell population and ability to regenerate all cell and tissue types after injuries that would be catastrophic for most animals. Recently, planarians have gained popularity as a model for eye regeneration. Their ability to regenerate the entire eye (comprised of two tissue types: pigment cells and photoreceptors) allows for the dissection of the mechanisms regulating visual system regeneration. Eye ablation has several advantages over other techniques (such as decapitation or hole punch) for examining eye-specific pathways and mechanisms, the most important of which is that regeneration is largely restricted to eye tissues alone. The purpose of this video article is to demonstrate how to reliably remove the planarian optic cup without disturbing the brain or surrounding tissues. The handling of worms and maintenance of an established colony is also described. This technique uses a 31 G, 5/16-inch insulin needle to surgically scoop out the optic cup of planarians immobilized on a cold plate. This method encompasses both single and double eye ablation, with eyes regenerating within 1-2 weeks, allowing for a wide range of applications. In particular, this ablation technique can be easily combined with pharmacological and genetic (RNA interference) screens for a better understanding of regenerative mechanisms and their evolution, eye stem cells and their maintenance, and phototaxic behavioral responses and their neurological basis.

This protocol shows how to consistently excise planarian eyes (optic cups) without disturbing surrounding tissues. Using an insulin needle and syringe, either one or both eyes can be ablated to facilitate investigations into the mechanisms regulating eye regeneration, the evolution of visual regeneration, and the neural basis of light-induced behavior.

Chirurgische Ablation Assay zur Untersuchung von Augen Regeneration in Planarien

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

Multi-Photonen-Time Lapse Imaging Entwicklung in Echtzeit zu visualisieren: Visualisierung der Migration Neuralleisten-Zellen in den Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus improving the overall pregnancy outcome. We recently developed a classification method based on microscopic live observations of mouse oocytes during their in vitro maturation from the germinal vesicle (GV) to the metaphase II stage, followed by the analysis of the cytoplasmic movements occurring during this time-lapse period. Here, we present detailed protocols of this procedure. Oocytes are isolated from fully-grown antral follicles and cultured for 15 h inside a microscope equipped for time-lapse analysis at 37 &#176;C and 5% CO2. Pictures are taken at 8 min intervals. The images are analyzed using the Particle Image Velocimetry (PIV) method that calculates, for each oocyte, the profile of Cytoplasmic Movement Velocities (CMVs) occurring throughout the culture period. Finally, the CMVs of each single oocyte are fed through a mathematical classification tool (Feed-forward Artificial Neural Network, FANN), which predicts the probability of a gamete to be developmentally competent or incompetent with an accuracy of 91.03%. This protocol, set up for the mouse, could now be tested on oocytes of other species, including humans.

Here, we present a protocol for non-invasive assessment of oocyte developmental competence performed during their in vitro maturation from the germinal vesicle to the metaphase II stage. This method combines time-lapse imaging with particle image velocimetry (PIV) and neural network analyses.

Eine neuronale Netzwerk-basierte Identifikation der entwicklungsgeschichtlich zuständigen oder inkompetent Maus ausgewachsene Eizellen

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus ...

Confocal Microscope-Based Laser Ablation and Regeneration Assay in Zebrafish Interneuromast Cells

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally replenished in non-mammalian vertebrates such as zebrafish. The zebrafish lateral line system is a useful model for characterizing sensory hair cell regeneration. The lateral line is comprised of hair cell-containing organs called neuromasts, which are linked together by a string of interneuromast cells (INMCs). INMCs act as progenitor cells that give rise to new neuromasts during development. INMCs can repair gaps in the lateral line system created by&#160;cell death. A method is described here for selective INMC ablation using a conventional laser-scanning confocal microscope and transgenic fish that express green fluorescent protein in INMCs. Time-lapse microscopy is then used to monitor INMC regeneration and determine the rate of gap closure. This represents an accessible protocol for cell ablation that does not require specialized equipment, such as a high-powered pulsed ultraviolet laser. The ablation protocol may serve broader interests, as it could be useful for the ablation of additional cell types, employing a tool set that is already available to many users. This technique will further enable the characterization of INMC regeneration under different conditions and from different genetic backgrounds, which will advance the understanding of sensory progenitor cell regeneration.

Laser ablation is a widely applicable technology for studying regeneration in biological systems. The presented protocol describes use of a standard laser-scanning confocal microscope for laser ablation and subsequent time-lapse imaging of regenerating interneuromast cells in the zebrafish lateral line.

Konfokale Mikroskop-basierte Laserablation und Regenerationstest in Zebrafisch Interneuromastzellen

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally ...

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to promote biodiversity preservation. In felids, most species are threatened with extinction, and domestic breeds are used as a model to increase the efficiency of protocols for germplasm banking. Among oocyte cryopreservation techniques, vitrification is more and more popular in human and veterinary assisted reproduction. Cryotop vitrification, which was at first developed for human oocytes and embryos, has demonstrated to be well-suited for cat oocytes. This method offers several advantages, such as the feasibility in field conditions and the speed of the procedure, which can be helpful when several samples need to be processed. However, the efficiency is strongly dependent on the operator&#8217;s skills, and intra- and inter-laboratory standardization are needed, as well as personnel training. This protocol describes minimum volume vitrification of immature feline oocytes on a commercial support in a step by step field-friendly protocol, from oocyte collection to warming. Following the protocol, preservation of oocyte integrity and viability at warming (as high as 90%) can be expected, although there is still room for improvement in post-warming maturation and embryonic development outcomes.

This manuscript describes a protocol for the minimum volume vitrification of immature cat oocytes with laboratory-made media on commercial supports. It covers every step from oocyte isolation from ex vivo gonads to vitrification and warming.

Minimale Volumenverglasung von unreifen FelineOozyten

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that during the reproductive life span only about 1% of the oocytes in an ovary mature and ovulate, several techniques have been developed to increase the exploitation of the ovarian reserve to the growing population of non-ovulatory follicles. Such technologies have allowed interventions of fertility preservation, selection programs in livestock, and conservation of endangered species. However, the vast potential of the ovarian reserve is still largely unexploited. In cows, for instance, some attempts have been made to support in vitro culture of oocytes at specific developmental stages, but efficient and reliable protocols have not yet been developed. Here we describe a culture system that reproduce the physiological conditions of the corresponding follicular stage, defined to develop in vitro growing oocytes collected from bovine early antral follicles to the fully-grown stage, corresponding to the medium antral follicle in vivo. A combination of hormones and a phosphodiesterase 3 inhibitor was used to prevent untimely meiotic resumption and to guide oocyte&#39;s differentiation.

We describe the procedures for isolation of growing oocytes from ovarian follicles at early stages of development, as well as the setup of an in vitro culture system which can support the growth and differentiation up to the fully-grown stage. &#160;

In Vitro Kulturstrategie für Oozyten aus dem frühen Antralfollikel bei Rindern

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of oocytes and surrounding follicular cells. It is vital to separate both follicular cells and oocytes for various research purposes such as for primary culture of follicular cells, analysis of gene expression, oocyte maturation and in vitro fertilization, etc. The conventional method uses forceps to separate both compartments, which is laborious, time consuming and has high damage to the oocyte. Here, we have established a simple method to separate both compartments using a pulled glass capillary. Under a stereomicroscope, oocytes and follicular cells can be easily separated by pipetting in a pulled fine glass capillary (the diameter depends on the follicle diameter). Compared with the conventional method, this new method has high efficiency in separating both oocytes and follicular cells and has low damage to the oocytes. More importantly, this method can be applied to early-stage follicles including at the pre-vitellogenesis stage. Thus, this simple method can be used to separate follicular cells and oocytes of zebrafish.

Here, we present a simple method for separating follicular cells and oocytes in zebrafish ovarian follicles, which will facilitate investigations of ovarian development in zebrafish.

Trennung von Follikulärzellen und Oozyten in Denrogarischen Follikel von Zebrafischen

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...

Vitrification of In Vitro Matured Oocytes Collected from Adult and Prepubertal Ovaries in Sheep

In livestock, in vitro embryo production systems can be developed and sustained thanks to the large number of ovaries and oocytes that can be easily obtained from a slaughterhouse. Adult ovaries always bear several antral follicles, while in pre-pubertal donors the maximal numbers of oocytes are available at 4 weeks of age, when ovaries bear peak numbers of antral follicles. Thus, 4 weeks old lambs are considered good donors, even if the developmental competence of prepubertal oocytes is lower compared to their adult counterpart. 
Basic research and commercial applications would be boosted by the possibility of successfully cryopreserving vitrified oocytes obtained from both adult and prepubertal donors. The vitrification of oocyte collected from prepubertal donors would also allow shortening the generation interval and thus increasing the genetic gain in breeding programs. However, the loss of developmental potential after cryopreservation makes mammalian oocytes probably one of the most difficult cell types to cryopreserve. Among the available cryopreservation techniques, vitrification is widely applied to animal and human oocytes. Despite recent advancements in the technique, exposures to high concentrations of cryoprotective agents as well as chilling injury and osmotic stress still induce several structural and molecular alterations and reduce the developmental potential of mammalian oocytes. Here, we describe a protocol for the vitrification of sheep oocytes collected from juvenile and adult donors and matured in vitro prior to cryopreservation. The protocol includes all the procedures from oocyte in vitro maturation to vitrification, warming and post-warming incubation period. Oocytes vitrified at the MII stage can indeed be fertilized following warming, but they need extra time prior to fertilization to restore damage due to cryopreservation procedures and to increase their developmental potential. Thus, post-warming culture conditions and timing are crucial steps for the restoration of oocyte developmental potential, especially when oocyte are collected from juvenile donors.

The protocol aims at providing a standard method for the vitrification of adult and juvenile sheep oocytes. It includes all the steps from the preparation of the in vitro maturation media to the post-warming culture. Oocytes are vitrified at the MII stage using Cryotop to ensure the minimum essential volume.

Vitrifikation von in vitro gereiften Eizellen, die aus adulten und präpubertären Eierstöcken bei Schafen entnommen wurden

In livestock, in vitro embryo production systems can be developed and sustained thanks to the large number of ovaries and oocytes that can be easily ...

Spatiotemporal Subcellular Manipulation of the Microtubule Cytoskeleton in the Living Preimplantation Mouse Embryo using Photostatins

The microtubule cytoskeleton forms the framework of a cell and is fundamental for intracellular transport, cell division, and signal transduction. Traditional pharmacological disruption of the ubiquitous microtubule network using, for instance, nocodazole can have devastating consequences for any cell. Reversibly photoswitchable microtubule inhibitors have the potential to overcome the limitations by enabling drug effects to be implemented in a spatiotemporally-controlled manner. One such family of drugs is the azobenzene-based photostatins (PSTs). These compounds are inactive in dark conditions, and upon illumination with UV light, they bind to the colchicine-binding site of &#946;-tubulin and block microtubule polymerization and dynamic turnover. Here, the application of PSTs in the 3-dimensional (3D) live preimplantation mouse embryo is set out to disrupt the microtubule network on a subcellular level. This protocol provides instructions for the experimental setup, as well as light activation and deactivation parameters for PSTs using live-cell confocal microscopy. This ensures reproducibility and enables others to apply this procedure to their research questions. Innovative photoswitches like PSTs may evolve as powerful tools to advance the understanding of the dynamic intracellular microtubule network and to non-invasively manipulate the cytoskeleton in real-time. Furthermore, PSTs may prove useful in other 3D structures such as organoids, blastoids, or embryos of other species.

Typical microtubule inhibitors, used widely in basic and applied research, have far-reaching effects on cells. Recently, photostatins emerged as a class of photoswitchable microtubule inhibitors, capable of instantaneous, reversible, spatiotemporally precise manipulation of microtubules. This step-by-step protocol details the application of photostatins in a 3D live preimplantation mouse embryo.