Os autores gostariam de agradecer a todos os membros do laboratório Balboula por sua valiosa ajuda e discussões. Os autores agradecem a Melina Schuh por gentilmente compartilhar o construto mCherry-Cep192. Este estudo foi apoiado pelo R35GM142537 (NIGMS, NIH) para AZB.

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pela Universidade do Missouri (Animal Care Quality Assurance Ref. Number 9695). Camundongos repórteres Cep192-eGFP fêmeas com idades entre 6-8 semanas de idade foram utilizados no presente estudo. Para gerar camundongos repórteres Cep192-eGFP , o reparo dirigido por homologia mediado por CRISPR/Cas9 foi usado para integrar o gene repórter EGFP no genoma do camundongo CF-1. O repórter do EGFP foi fundido no terminal C do Cep192 (componente integrante dos MTOCs)15. Para manter a colônia de camundongos, foram utilizados camundongos repórteres homozigotos Cep192-eGfp . Todos os animais foram mantidos em gaiolas (até quatro animais/gaiola) a 21 °C e 55% de umidade, com ciclo claro/escuro de 12 h e acesso ad libitum a alimentos e água.
1. Coleção de ovócitos do rato
<ol><li>Preparar o meio de cultura (Chatot, Ziomek e Bavister, CZB19, ver Tabela de Materiais) e incubá-lo a 37 °C e 5% de CO2 durante a noite. NOTA: O meio CZB pode ser armazenado a 4 °C durante 1 mês (consulte o arquivo suplementar 1 para a composição da mídia).</li>
	<li>Complementar o meio CZB com glutamina (1 mM) e milrinona (2,5 mM) (CZB + M) (ver Tabela de Materiais) e colocá-lo na incubadora. NOTA: A milrinona é um inibidor da fosfodiesterase que mantém os ovócitos presos na prófase I e impede a retomada meiótica20.</li>
	<li>Prepare o meio de coleta (meio essencial mínimo livre de bicarbonato, MEM) contendo 3 mg/mL de polivinilpirolidona (PVP), 25 mM HEPES (pH 7,3) (Arquivo Suplementar 1) e milrinona (2,5 mM) (MEM/PVP + M, consulte a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Preparar os pratos de coleta e cultura, fazer quatro microgotas (100 μL) de meio de coleta (MEM/PVP + M) e duas microgotas (100 μL) de meio de cultura (CZB + M) em placas de Petri de 60 mm e 35 mm, respectivamente, e cobri-las com óleo mineral (ver Tabela de Materiais). Mantenha o prato de coleta na lâmina mais quente e coloque o prato de cultura na incubadora a 37 °C e 5% de CO2.</li>
	<li>Injetar por via intraperitoneal 5 UI de gonadotrofina sérica de égua grávida (PMSG, ver Tabela de Materiais) em ratas fêmeas Cep192-eGFP sexualmente maduras (6-8 semanas de idade) 44-48 h antes da recolha de ovócitos.</li>
	<li>Sacrificar os camundongos por luxação cervical, identificar e remover os ovários21 e transferi-los para um vidro de relógio contendo meio de coleta pré-aquecido (MEM/PVP + M) a 37 °C.</li>
	<li>Fixe o ovário tocando uma seringa de 1 ml no fundo do vidro do relógio e perfurando-o várias vezes (~ 40 vezes por ovário) usando agulhas de costura agrupadas para liberar os oócitos no meio.</li>
	<li>Usando uma pipeta de transferência de plástico, transfira todo o meio que contém os complexos cumulus-ovócitos (COCs) da etapa 1.7 para uma placa de Petri de plástico vazia de 100 mm.</li>
	<li>Sob um estereomicroscópio, colete os COCs usando uma pipeta de vidro Pasteur e transfira-os para o prato de coleta que contém MEM / PVP + M.</li>
	<li>Usando uma pipeta de vidro Pasteur estreita (aproximadamente 100 μm de diâmetro), desnude os oócitos mecanicamente por pipetagem repetitiva suave, seguida de transferi-los e lavá-los em quatro microgotas de (100 μL) MEM/PVP + M (o prato de coleta) antes de sua transferência para o prato de cultura CZB + M.</li>
	<li>Incubar os ovócitos desnudados durante 1 h a 37 °C com 5% de CO2 no ar.</li>
</ol>2. Microinjeção de ovócitos
<ol><li>Coloque uma gota de 250 μL de MEM/PVP + M em uma tampa de placa de Petri de plástico de 100 mm e cubra-a com óleo mineral. NOTA: A tampa da placa de Petri tem um aro inferior que fornece mais espaço para ajustar o micromanipulador.</li>
	<li>Ligue o sistema de microinjeção (consulte a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Colocar a placa de microinjeção na fase de aquecimento (37 °C) do microscópio.</li>
	<li>Carregue a agulha de injeção com 0,5 μL de cRNA mCh-Cep192usando as pontas da pipeta do microcarregador (consulte Tabela de Materiais) e prenda a agulha de injeção ao micromanipulador.</li>
	<li>Transferir os ovócitos desnudos (etapa 1.11) para a microgota de 250 μL (etapa 2.1).</li>
	<li>Sob uma lente objetiva de 20x ou 40x, ajuste a posição e o foco das agulhas de injeção e de retenção de acordo com a posição do ovócito (Figura 1).</li>
	<li>Configure a unidade de microinjeção e defina a pressão de injeção (p i), a pressão de compensação (pc) e o tempo de injeção (ti) para poder injetar 5-10 pl de cRNA mCh-Cep192 (para rotular exogenamente os MTOCs).</li>
	<li>Injete cuidadosamente os oócitos sem tocar no núcleo.</li>
	<li>Uma vez que todos os ovócitos são injetados, lave-os em três microgotas de CZB + M, transfira-os para a placa de cultura (CZB + M) e incube-os por 3 h a 37 °C para permitir a expressão de mCh-Cep192.</li>
</ol>3. Maturação dos ovócitos
<ol><li>Preparar o meio de maturação adicionando glutamina (1 mM) a um meio CZB pré-equilibrado numa incubadora com 5% de CO2 no ar a 37 °C durante, pelo menos, 3 h.</li>
	<li>Faça duas microgotas (100 μL) do meio de maturação em uma placa de Petri de 35 mm e cubra-as com óleo mineral (placa de maturação).</li>
	<li>Lave os ovócitos presos à prófase I pelo menos três vezes em microgotas de CZB isentas de milrinona de 100 μL para remover completamente a milrinona e permitir a retomada meiótica.</li>
	<li>Transferir os ovócitos para a placa de maturação e incubá-los por 5 h (estágio de prometáfase I) em incubadora umidificada com 5% de CO2 em ar a 37 °C.</li>
</ol>4. Preparação de ovócitos para ablação e imagem
<ol><li>Transferir os ovócitos da prometáfase I (etapa 3.4) para uma placa de cultura com fundo de vidro contendo 100 μL de meio de maturação (etapa 3.1) coberto com óleo mineral.</li>
</ol>5. Preparação do microscópio para ablação
<ol><li>Pelo menos 30 min antes da ablação, ligue o controlador de temperatura da incubadora de palco (ver Tabela de Materiais) e fixe-o a 37 °C.</li>
	<li>Ligue o controlador de CO 2 e defina-o em 5% de CO2.</li>
	<li>Selecione uma objetiva apocromática de imersão em óleo de 40x e aplique uma pequena gota do óleo de imersão.</li>
	<li>Monte o prato de cultura com fundo de vidro com os oócitos em uma incubadora de topo de palco e cubra a incubadora com uma tampa de gás.</li>
	<li>No software de aquisição de imagens (consulte a Tabela de Materiais), selecione uma opção que permita salvar várias posições de estágio (por exemplo, "Definir marca e encontrar experimento"). Usando a iluminação de campo brilhante de luz transmitida, centralize nos ovócitos individuais e salve suas posições.</li>
	<li>No software de aquisição de imagens, selecione o modo de digitalização XYZ , defina o formato da imagem como 256 x 256 pixels, defina o fator de zoom como 2,5x - 3,0x e selecione uma frequência de digitalização de 600 Hz. Isso corresponde a um tempo de permanência de pixels de aproximadamente 1,6 μs.</li>
	<li>Defina uma linha de laser de excitação de 488 nm a aproximadamente 10% da potência do laser (o que corresponde a 4,0 μW no nível da amostra) (veja Tabela de Materiais) e use uma largura de banda espectral de 500-550 nm para observar o sinal GFP dos MTOCs. Para a observação simultânea da fluorescência do Cep192 marcado com mCherry, defina uma linha de laser de excitação de 585 nm em aproximadamente 8% da potência do laser (o que corresponde a 10,7 μW no nível da amostra) e use outro detector ajustado para uma largura de banda espectral de 595-645 nm. NOTA: É útil usar o detector de luz transmitida (TLD) do microscópio confocal para detectar simultaneamente os limites dos ovócitos.</li>
	<li>Usando um modo de varredura ao vivo e o controle manual da unidade z, filtre o ovócito para MTOCs.</li>
	<li>Uma vez que um mcMTOC é detectado, desenhe uma região quadrada de interesse (ROI) em torno dele.</li>
</ol>6. Ablação de mcMTOCs
<ol><li>Defina um laser de femtossegundo para um comprimento de onda de 740 nm. NOTA: O comprimento de onda do laser pode ser alterado de acordo com o microscópio e as condições do laser.</li>
	<li>Use o modulador eletro-óptico do microscópio multifóton (ver Tabela de Materiais) para definir a potência do laser para 70%-80%, correspondendo à potência de 60-70 mW no plano da amostra. NOTA: Se o laser estiver equipado com um compensador de pulso de femtossegundos, use-o para corrigir a dispersão de atraso de grupo (GDD). A correção de GDD reduz a quantidade de energia do laser necessária para uma ablação eficiente do mcMTOC e minimiza os fotodanos ao ovócito. O controle GDD é geralmente integrado com o software de aquisição de imagem de microscópios multifótons comerciais.</li>
	<li>Use o mesmo formato de imagem, fator de zoom e frequência de digitalização como na etapa 5.6. Defina os parâmetros de média de linha e quadro como 1.</li>
	<li>Clique no botão Scan no software para realizar a ablação do mcMTOC realizando uma única varredura a laser do ROI selecionado.</li>
	<li>Use as configurações de canal da etapa 5.7 para revisar os resultados da ablação comparando as imagens das estruturas marcadas com GFP tiradas antes e depois da exposição ao laser multifóton. Se a ablação for bem-sucedida, a intensidade da fluorescência da GFP no mcMTOC alvo diminui para os níveis observados no fundo.</li>
	<li>Se alguns fragmentos de uma estrutura de marcação GFP permanecerem, repita a etapa 6.4 uma ou mais vezes, concentrando-se em vários planos z do mcMTOC.</li>
	<li>Use as configurações de canal da etapa 5.7 para verificar a eficiência da ablação pela perda completa de sinais mCherry associados ao mcMTOC (mCh-Cep192).</li>
	<li>Repita a etapa 5.8 para a etapa 6.7 até que todos os MTOCs de um ovócito (em vários planos focais) sejam ablados. NOTA: Este protocolo usa a microinjeção mCh-Cep192 como uma estratégia para confirmar a depleção de mcMTOC após a exposição ao laser multifóton e excluir a possibilidade de que a perda de fluorescência de GFP seja causada pelo fotobranqueamento de GFP. No entanto, a microinjeção desta sonda é opcional e não é necessária para o procedimento de ablação.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bennabi, I., Terret, M. E., Verlhac, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+spindle+assembly+and+chromosome+segregation+in+oocytes.">Meiotic spindle assembly and chromosome segregation in oocytes.</a> Journal of Cell Biology. 215 (5), 611-619 (2016).</li><li>Hashimoto, N., Kishimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+meiotic+metaphase+by+a+cytoplasmic+maturation-promoting+factor+during+mouse+oocyte+maturation.">Regulation of meiotic metaphase by a cytoplasmic maturation-promoting factor during mouse oocyte maturation.</a> Development Biology. 126 (2), 242-252 (1988).</li><li>Kitajima, T. 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Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Existem diferentes métodos para perturbar as estruturas relacionadas ao citoesqueleto dentro das células22,23,24,25. No entanto, encontrar técnicas eficientes para perturbar seletivamente a estrutura alvo sem comprometer a viabilidade celular é um desafio. O método de ablação a laser multifóton aqui apresentado é uma estratégia eficiente para induzir uma perturbação mecânica seletiva aos mcMTOCs dentro do ovócito sem alterar a viabilidade do ovócito.
A ablação a laser tem sido amplamente utilizada para compreender os mecanismos moleculares que controlam a segregação cromossômica durante a mitose e meiose22,23,26,27. Devido ao tamanho relativamente grande (>80 mm de diâmetro) dos ovócitos de mamíferos em comparação com as células somáticas28, a ablação de suas estruturas intracelulares representa um desafio. Além disso, o volume médio de mcMTOC em ovócitos de metáfase I é de ~20 μm15, representando um desafio adicional. Um método eficiente que ofereça uma penetração tecidual mais profunda deve ser adotado para superar esses desafios. A principal vantagem do uso do laser multifóton para ablação é sua capacidade de penetrar mais profundamente na célula, minimizando os efeitos fora do alvo29.
Para verificar a eficácia e a eficiência do método de ablação a laser para esgotar a estrutura alvo, recomenda-se o uso de uma proteína marcada fluorescentemente para identificar a estrutura alvo ao longo do tempo (antes e após a ablação)23. É importante notar que a ablação a laser esgota todo o mcMTOC como estrutura e, embora mcMTOCs menores exijam apenas uma única exposição ao laser para serem esgotados, mcMTOCs maiores podem exigir mais de uma exposição a laser em diferentes planos focais. Recomenda-se também fixar e imunomarcar um subconjunto de oócitos ablados-mcMTOC e de controle com um marcador MTOC (como γ-tubulina, pericentrina ou Cep192) para confirmar ainda mais a eficiência da ablação mcMTOC. Nos ovócitos de controle, áreas do citoplasma adjacentes, mas não sobrepostas aos mcMTOCs, serão expostas ao laser.
Este experimento requer várias ablações mcMTOC enquanto se move entre diferentes planos focais dentro dos ovócitos. Portanto, é altamente recomendável praticar essa técnica várias vezes antes de executar o experimento para minimizar o tempo de experimento, aumentando assim a viabilidade dos ovócitos. Além disso, é importante usar a potência mínima do laser que seja suficiente para esgotar os mcMTOCs sem afetar a viabilidade dos ovócitos.
Esta técnica tem algumas limitações. Primeiro, os microscópios confocais multifótons são relativamente mais caros do que os microscópios confocais regulares. Em segundo lugar, perturbar todos os mcMTOCs em diferentes planos focais é mais demorado do que perturbações químicas ou genéticas. Em terceiro lugar, este protocolo requer habilidades técnicas para ablar todos os mcMTOCs no menor tempo possível. No entanto, uma vez dominado, o uso do laser multifóton fornece uma excelente estratégia para perturbar várias estruturas intracelulares em ovócitos de camundongos, incluindo mcMTOCs, contribuindo para a compreensão dos mecanismos moleculares que regulam o posicionamento do fuso e sua migração oportuna em ovócitos de mamíferos.

Os gametas haploides (espermatozoides e ovócitos) são produzidos através da meiose, o que implica uma rodada de replicação do DNA seguida por duas divisões consecutivas que são necessárias para a redução do número cromossômico antes da fertilização. Em mamíferos, durante o início da vida fetal, o ovócito sofre uma longa parada (até a puberdade) no estágio diploteno da prófase I da primeira divisão meiótica, um estágio chamado estágio vesícula germinal (GV). Após a retomada meiótica, o ovócito GV sofre quebra do envelope nuclear (NEBD), e o fuso é montado principalmente no centro do ovócito 1,2,3. Posteriormente, impulsionado pela F-actina, o fuso migra em tempo hábil do centro do ovócito para o córtex para garantir uma divisão altamente assimétrica, resultando em um ovo com um minúsculo corpo polar (PB)4,5,6.
Nas células mitóticas, os centrossomos consistem em um par de centríolos circundados por componentes de material pericentríolo (PMC), como pericentrina, γ-tubulina, Cep152 e Cep1927. Esses centrossomos contendo centríolos contribuem para a fidelidade da formação do fuso bipolar8. No entanto, os centríolos são perdidos durante a oogênese precoce em várias espécies, incluindo roedores9. Portanto, os ovócitos de camundongos adotam uma via de montagem de fuso independente de centríolo utilizando numerosos centros organizadores de microtúbulos acentriolares (MTOCs)9,10. Após a retomada meiótica, os MTOCs perinucleares passam por três etapas distintas de recondensação, alongamento e fragmentação em um grande número de MTOCs menores11,12. Os MTOCs fragmentados são então agrupados e classificados para organizar um fuso bipolar10,13,14. Outro pool de MTOCs está localizado no citoplasma durante o NEBD. Alguns desses MTOCs citoplasmáticos migram e formam polos fusiformes (MTOCs polares, pMTOCs)10,11. Recentemente, outro subconjunto de MTOCs citoplasmáticos foi descoberto, denominado MTOCs citoplasmáticos de metáfase (mcMTOCs), que não contribuem para a formação de polos fusiformes, mas permanecem no citoplasma de ovócitos durante a metáfase I (Met I)15. O esgotamento dos mcMTOCs pela ablação a laser multifótons ou o aumento anormal de seu número pela inibição da autofagia perturba o posicionamento e a migração do fuso e aumenta a incidência de aneuploidia em ovócitos da metáfase II15.
Curiosamente, os mcMTOCs diferem dos pMTOCs em muitos aspectos15. Por exemplo, em contraste com os pMTOCs, que se originam principalmente de MTOCs perinucleares, os mcMTOCs se originam do córtex de ovócitos. Quando o fuso ainda está no centro do ovócito, os mcMTOCs estão localizados assimetricamente opostos ao lado para o qual o fuso migra para extrusão PB15. Os MTs semelhantes a astrais não podem alcançar o córtex na célula de ovócitos relativamente grande. Portanto, esses mcMTOCs nucleam MTs para ancorar o fuso (via MTOCs astrais) ao córtex. Essas descobertas sugerem um modelo no qual a força MT nucleada por mcMTOC neutraliza a força mediada por F-actina que impulsiona a migração do fuso em direção ao córtex. O equilíbrio entre essas duas forças opostas é essencial para regular o posicionamento do fuso central e a migração oportuna dofuso 15.
Até o momento, todas as proteínas PMC examinadas (pericentrina, g-tubulina, Cep192 e Aurora quinase A) localizam-se em ambos os pools MTOC: mcMTOCs e pMTOCs15. Portanto, não há abordagem química ou genética para perturbar seletivamente os mcMTOCs sem perturbar os pMTOCs. Essas limitações podem ser contornadas visando seletivamente os mcMTOCs com ablação a laser. Dentre as tecnologias baseadas em laser desenvolvidas para microablação, os lasers de femtossegundos multifótons pulsados apresentam grande potencial devido ao seu impacto de precisão limitado ao plano focal, à alta profundidade de penetração da luz infravermelha próxima e à fototoxicidade e danos térmicos reduzidos à célula16,17,18. Este trabalho descreve uma abordagem seletiva para ablar mcMTOCs em ovócitos de camundongos usando um laser multifóton acoplado a um microscópio invertido.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4 IN thinwall GL 1.0 OD/.75 ID</td>
			<td>World precision instrument&#160;</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td>Injection needles&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass&#160;</td>
			<td>Fisherbrand&#160;</td>
			<td>Cat# 13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillarities&#160;</td>
			<td>World Precision Instrument&#160;</td>
			<td>Cat# TW100-6</td>
			<td>Holding needles&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage incubator for Leica DMI6000 B microscope</td>
			<td>Life Imaging Services GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chlrode dihydrate</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 controller&#160;</td>
			<td>Pecon</td>
			<td># 0506.000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Cover HP</td>
			<td>Pecon</td>
			<td># 0506.020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Lactic acid&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# L7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMi8</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtojet 4i</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microinjector&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotips Microloader</td>
			<td>Fisher scientific&#160;</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# G1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# 1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish&#160;</td>
			<td>Mat Tek Corporation</td>
			<td>Cat# P35G-1.0-20-C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes Sodium Salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cat # H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hera Cell vios 160i</td>
			<td>Thermo&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>CO2 incubator&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCP SP8 spectral laser scanning confocal micorscope with inverted stand DMI6000 B</td>
			<td>Leica Microsystems, Inc</td>
			<td>N/A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cat#G8540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate dihydrate</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# M7774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai DeepSee Ti-Sapphire femtosecond laser</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCH-Cep192 cRNA</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium Essential Medium Eagle - MEM</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cat #M0258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milrinone</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cat# M4659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cat# M5310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium eagle (MEM)</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# M0268 - 1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: Cep192-eGFP reporter CF-1</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100 mm)</td>
			<td>Fisherbrand&#160;</td>
			<td>Cat# FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (35 mm)</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>Cat# 430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (60 mm)</td>
			<td>Falcon&#160;</td>
			<td>Cat# 351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# P5530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrolidone</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cat# P2307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrolidone (PVP)</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# P2307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant mare&#180;s serum gonadotropin&#160;</td>
			<td>Lee BioSolutions</td>
			<td>Cat# 493-10-10&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# P4562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# P4562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sewing needles&#160;</td>
			<td>D.M.C</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N&#176; 5 * 16 Needles&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage-top heating insert P</td>
			<td>Pecon</td>
			<td># 0426.300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterezoom S9i</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Stereomicroscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td>BD company&#160;</td>
			<td>Cat# 309597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller Tempcontrol 37-2 digital</td>
			<td>Pecon</td>
			<td># 0503.000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Cube temperature controller for the cage incubator</td>
			<td>Life Imaging Services GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-photon laser ablation of cytoplasmic microtubule organizing centers in mouse oocytes

A fidelidade da meiose de ovócitos é fundamental para a geração de ovos euploides competentes em termos de desenvolvimento. Nos mamíferos, o ovócito sofre uma longa prisão na prófase I da primeira divisão meiótica. Após a puberdade e após a retomada meiótica, a membrana nuclear se desmonta (quebra do envelope nuclear), e o fuso é montado principalmente no centro do ovócito. O posicionamento inicial do fuso central é essencial para proteger contra ligações anormais de cinetocócoro-microtúbulo (MT) e aneuploidia. O fuso posicionado centralmente migra de maneira sensível ao tempo em direção ao córtex, e esse é um processo necessário para extrudar um minúsculo corpo polar. Nas células mitóticas, o posicionamento do fuso depende da interação entre os MTs astrais mediados pelo centrossomo e o córtex celular. Pelo contrário, os ovócitos de camundongos não possuem centrossomos clássicos e, em vez disso, contêm numerosos centros organizadores de MT acentriolares (MTOCs). No estágio de metáfase I, os oócitos de camundongos têm dois conjuntos diferentes de MTOCs: (1) MTOCs que são agrupados e classificados para montar polos fusiformes (MTOCs polares) e (2) MTOCs citoplasmáticos de metáfase (mcMTOCs) que permanecem no citoplasma e não contribuem diretamente para a formação do fuso, mas desempenham um papel crucial na regulação do posicionamento do fuso e na migração oportuna do fuso. Aqui, um método de ablação a laser multifóton é descrito para esgotar seletivamente mcMTOCs endogenamente marcados em oócitos coletados de camundongos repórteres Cep192-eGfp . Este método contribui para a compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes ao posicionamento e migração do fuso em ovócitos de mamíferos.

A ablação a laser multifóton fornece um método eficiente para ablar seletivamente estruturas intracelulares. O presente estudo empregou a ablação a laser multifóton para esgotar mcMTOCs em oócitos de camundongos seletivamente. A ablação a laser esgotou os mcMTOCs de forma eficiente, como demonstrado pela redução da fluorescência endógena de GFP nos mcMTOCs alvo para um nível comparável ao fundo. O mCh-Cep192 exógeno nos mcMTOCs alvo também foi abolido após a ablação a laser. A ablação a laser de mcMTOCs deve ser realizada em diferentes planos focais dentro do ovócito (onde os mcMTOCs estão localizados, Figura 2) para garantir que todos os mcMTOCs dentro do ovócito estejam esgotados (Figura 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig01.jpg"> Figura 1: Microinjeção de ovócitos. Microinjeção de um ovócito de camundongo preso por prófase I com cRNA mCh-Cep192 . Barra de escala: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig02.jpg"> Figura 2: Depleção de mcMTOCs em ovócitos de ratinhos. Imagens representativas de planos focais únicos. Os quadrados brancos indicam um mcMTOC antes e depois da ablação a laser multifóton. Barra de escala: 40 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig03.jpg"> Figura 3: Depleção de mcMTOCs em diferentes planos focais em um ovócito de camundongo. Imagens de projeção máxima representativas de um ovócito de rato ablado-mcMTOC. Barra de escala: 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Arquivo Suplementar 1: Composições de Chatot, Ziomek e Bavister (CZB) e meio essencial mínimo livre de bicarbonato (MEM/PVP). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439_Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multi-Photon Laser Ablation of Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers in Mouse Oocytes at JoVE.com

Multi-Photon Laser Ablation of Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers in Mouse Oocytes

Apresenta-se um protocolo otimizado que permite a depleção de centros organizadores de microtúbulos citoplasmáticos em ovócitos de camundongos durante a metáfase I utilizando um laser de femtossegundos no infravermelho próximo.

Ablação a Laser Multifóton de Centros Organizadores de Microtúbulos Citoplasmáticos em Oócitos de Camundongos

The fidelity of oocyte meiosis is critical for generating developmentally competent euploid eggs. In mammals, the oocyte undergoes a lengthy arrest at ...

This protocol offers an excellent strategy to selectively ablate cytoplasmic MTOCs, which are critical regulators for spindle positioning in mouse oocytes.Therefore contributing to our understanding of molecular mechanisms that regulates oocyte meiosis.This technique allows to perform targeted ablations within live oocytes with high spatial accuracy and with minimal phototoxic effects on the cell.This protocol can be used to induce a selective mechanical perturbation of different instructors without altering the cell viability.This protocol requires the technical skills to ablate all cytoplasmic MTOCs in the shortest possible time to avoid compromising the oocytes'viability.So practicing this technique several times before carrying out the actual experiment is essential.To begin supplement the CZB medium with glutamine and milrinone and place it in the incubator.Prepare the collection and culture dishes.Make four micro drops of collection medium and two micro drops of culture medium in 60 and 35 mm Petri dishes, respectively.And cover them with mineral oil.Keep the collection dish on the slide warmer, and incubate at 37

multi-photon-laser-ablation-cytoplasmic-microtubule-organizing

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

1.5K visualizações.  University of Missouri. This protocol offers an excellent strategy to selectively ablate cytoplasmic MTOCs, which are critical regulators for spindle positioning in mouse oocytes.Therefore contributing to our understanding of molecular mechanisms that regulates oocyte meiosis.This technique allows to perform targeted ablations within live oocytes with high spatial accuracy and with minimal phototoxic effects on the cell.This protocol can be used to induce a selective mechanical perturbation of different instructors ...