Gli autori desiderano ringraziare tutti i membri del laboratorio Balboula per il loro prezioso aiuto e discussioni. Gli autori ringraziano Melina Schuh per aver gentilmente condiviso il costrutto mCherry-Cep192. Questo studio è stato supportato da R35GM142537 (NIGMS, NIH) a AZB.

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Università del Missouri (Animal Care Quality Assurance Ref. Number 9695). Nel presente studio sono stati utilizzati topi femmina reporter Cep192-eGFP di età compresa tra 6 e 8 settimane. Per generare topi reporter Cep192-eGFP , è stata utilizzata la riparazione diretta dall'omologia mediata da CRISPR / Cas9 per integrare il gene reporter EGFP nel genoma del topo CF-1. Il reporter EGFP è stato fuso al C-terminus di Cep192 (una componente integrante degli MTOC)15. Per mantenere la colonia di topi, sono stati utilizzati topi reporter omozigoti Cep192-eGfp . Tutti gli animali sono stati tenuti in gabbie (fino a quattro animali / gabbia) a 21 ° C e 55% di umidità, con un ciclo luce / buio di 12 ore e accesso ad libitum a cibo e acqua.
1. Raccolta di ovociti di topo
<ol><li>Preparare il terreno di coltura (Chatot, Ziomek e Bavister, CZB19, vedere la tabella dei materiali) e incubarlo a 37 °C e al 5% di CO2 durante la notte. NOTA: Il mezzo CZB può essere conservato a 4 °C per 1 mese (vedere il file supplementare 1 per la composizione del supporto).</li>
	<li>Integrare il terreno CZB con glutammina (1 mM) e milrinone (2,5 mM) (CZB + M) (vedi Tabella dei materiali) e metterlo nell'incubatore. NOTA: Il milrinone è un inibitore della fosfodiesterasi che mantiene gli ovociti arrestati alla profase I e impedisce la ripresa meiotica20.</li>
	<li>Preparare il mezzo di raccolta (terreno essenziale minimo privo di bicarbonato, MEM) contenente 3 mg/ml di polivinilpirolidone (PVP), 25 mM HEPES (pH 7,3) (File supplementare 1) e milrinone (2,5 mM) (MEM/PVP + M, vedere la tabella dei materiali).</li>
	<li>Preparare i piatti di raccolta e coltura, preparare quattro microgocce (100 μL) di terreno di raccolta (MEM / PVP + M) e due microgocce (100 μL) di terreno di coltura (CZB + M) in piastre di Petri da 60 mm e 35 mm, rispettivamente, e coprirle con olio minerale (vedi Tabella dei materiali). Tenere il piatto di raccolta sul vetrino più caldo e mettere il piatto di coltura nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO2.</li>
	<li>Iniettare per via intraperitoneale 5 UI di gonadotropina sierica di cavalla gravida (PMSG, vedere la tabella dei materiali) in topi femmina sessualmente maturi (6-8 settimane) Cep192-eGFP 44-48 ore prima della raccolta degli ovociti.</li>
	<li>Sacrificare i topi mediante lussazione cervicale, identificare e rimuovere le ovaie21 e trasferirle in un vetro da orologio contenente terreno di raccolta preriscaldato (MEM / PVP + M) a 37 ° C.</li>
	<li>Fissare l'ovaia toccando una siringa da 1 mL sul fondo del vetro dell'orologio e perforandola più volte (~ 40 volte per ovaio) usando aghi da cucito raggruppati insieme per rilasciare gli ovociti nel mezzo.</li>
	<li>Utilizzando un pipetta di trasferimento in plastica, trasferire tutto il mezzo contenente i complessi cumulo-ovocita (COC) dal punto 1.7 in una capsula di Petri di plastica vuota da 100 mm.</li>
	<li>Sotto uno stereomicroscopio, raccogliere i COC utilizzando un pipet di vetro Pasteur e trasferirli nel piatto di raccolta che contiene MEM / PVP + M.</li>
	<li>Utilizzando un pipetta di vetro Pasteur stretto (circa 100 μm di diametro), denudare meccanicamente gli ovociti mediante un delicato pipettaggio ripetitivo, seguito dal trasferimento e dal lavaggio in quattro microgocce di (100 μL) MEM/PVP + M (il piatto di raccolta) prima del loro trasferimento nel piatto di coltura CZB + M.</li>
	<li>Incubare gli ovociti denudati per 1 ora a 37 °C con il 5% di CO2 nell'aria.</li>
</ol>2. Microiniezione di ovociti
<ol><li>Introdurre una goccia da 250 μL di MEM/PVP + M in un coperchio in plastica di Petri da 100 mm e coprirlo con olio minerale. NOTA: Il coperchio della piastra di Petri ha un bordo inferiore che offre più spazio per la regolazione del micromanipolatore.</li>
	<li>Accendere il sistema di microiniezione (vedere la tabella dei materiali).</li>
	<li>Posizionare il piatto di microiniezione sullo stadio di riscaldamento (37 °C) del microscopio.</li>
	<li>Caricare l'ago per iniezione con 0,5 μL di cRNA mCh-Cep192utilizzando le punte delle pipette del microcaricatore (vedere Tabella dei materiali) e fissare l'ago per iniezione al micromanipolatore.</li>
	<li>Trasferire gli ovociti denudati (fase 1.11) nella microgoccia da 250 μL (fase 2.1).</li>
	<li>Sotto una lente obiettivo 20x o 40x, regolare la posizione e la messa a fuoco degli aghi per iniezione e di tenuta in base alla posizione dell'ovocita (Figura 1).</li>
	<li>Impostare l'unità di microiniezione e impostare la pressione di iniezione (p i), la pressione di compensazione (pc) e il tempo di iniezione (ti) per essere in grado di iniettare 5-10 pl di cRNA mCh-Cep192 (per marcare esogenamente gli MTOC).</li>
	<li>Iniettare con cura gli ovociti senza toccare il nucleo.</li>
	<li>Una volta iniettati tutti gli ovociti, lavarli in tre microgocce di CZB + M, trasferirli nel piatto di coltura (CZB + M) e incubarli per 3 ore a 37 °C per consentire l'espressione di mCh-Cep192.</li>
</ol>3. Maturazione degli ovociti
<ol><li>Preparare il mezzo di maturazione aggiungendo glutammina (1 mM) al mezzo CZB pre-equilibrato in un incubatore con il 5% di CO2 in aria a 37 °C per almeno 3 ore.</li>
	<li>Fare due microgocce (100 μL) del mezzo di maturazione in una capsula di Petri da 35 mm e coprirle con olio minerale (piatto di maturazione).</li>
	<li>Lavare gli ovociti arrestati in profase I almeno tre volte in microgocce CZB prive di milrinone da 100 μL per rimuovere completamente il milrinone e consentire la ripresa meiotica.</li>
	<li>Trasferire gli ovociti nel piatto di maturazione e incubarli per 5 ore (stadio di prometafase I) in un incubatore umidificato con il 5% di CO2 in aria a 37 °C.</li>
</ol>4. Preparazione degli ovociti per l'ablazione e l'imaging
<ol><li>Trasferire gli ovociti di prometafase I (fase 3.4) in una capsula di coltura a fondo di vetro contenente 100 μL di terreno di maturazione (fase 3.1) ricoperta di olio minerale.</li>
</ol>5. Preparazione al microscopio per l'ablazione
<ol><li>Almeno 30 minuti prima dell'ablazione, accendere il regolatore di temperatura per l'incubatore dello stadio (vedere Tabella dei materiali) e impostarlo a 37 °C.</li>
	<li>Accendere il controller CO 2 e impostarlo su 5% CO2.</li>
	<li>Selezionare un obiettivo apocromatico ad immersione in olio 40x e applicare una piccola goccia dell'olio ad immersione.</li>
	<li>Montare il piatto di coltura con fondo di vetro con gli ovociti su un'incubatrice da palcoscenico e coprire l'incubatrice con un coperchio a gas.</li>
	<li>Nel software di acquisizione delle immagini (vedere la tabella dei materiali), selezionare un'opzione che consente il salvataggio di più posizioni di fase (ad esempio, "Definisci segna e trova esperimento"). Utilizzando l'illuminazione a luce luminosa trasmessa, centrare i singoli ovociti e salvare le loro posizioni.</li>
	<li>Nel software di acquisizione immagini, selezionare la modalità di scansione XYZ , impostare il formato dell'immagine su 256 x 256 pixel, impostare il fattore di zoom su 2,5x - 3,0x e selezionare una frequenza di scansione di 600 Hz. Ciò corrisponde a un tempo di permanenza dei pixel di circa 1,6 μs.</li>
	<li>Impostare una linea laser di eccitazione a 488 nm a circa il 10% della potenza del laser (che corrisponde a 4,0 μW a livello del campione) (vedere Tabella dei materiali) e utilizzare una larghezza di banda spettrale di 500-550 nm per osservare il segnale GFP dagli MTOC. Per l'osservazione simultanea della fluorescenza dal Cep192 marcato con mCherry, impostare una linea laser di eccitazione a 585 nm a circa l'8% della potenza del laser (che corrisponde a 10,7 μW a livello del campione) e utilizzare un altro rivelatore impostato su una larghezza di banda spettrale di 595-645 nm. NOTA: È utile utilizzare il rilevatore di luce trasmessa (TLD) del microscopio confocale per rilevare contemporaneamente i confini degli ovociti.</li>
	<li>Utilizzando una modalità di scansione dal vivo e il controllo manuale dello z-drive, eseguire lo screening dell'ovocita per gli MTOC.</li>
	<li>Una volta rilevato un mcMTOC, disegna una regione quadrata di interesse (ROI) attorno ad esso.</li>
</ol>6. Ablazione di mcMTOCs
<ol><li>Impostare un laser a femtosecondi su una lunghezza d'onda di 740 nm. NOTA: La lunghezza d'onda del laser può essere modificata in base al microscopio e alle condizioni del laser.</li>
	<li>Utilizzare il modulatore elettro-ottico del microscopio multi-fotone (vedi Tabella dei materiali) per impostare la potenza del laser al 70% -80%, corrispondente alla potenza di 60-70 mW sul piano del campione. NOTA: Se il laser è dotato di un compensatore di impulsi a femtosecondi, utilizzarlo per correggere la dispersione del ritardo di gruppo (GDD). La correzione GDD riduce la quantità di potenza laser necessaria per un'ablazione efficiente di mcMTOC e minimizza il fotodanneggiamento dell'ovocita. Il controllo GDD è solitamente integrato con il software di acquisizione immagini dei microscopi multifotoni commerciali.</li>
	<li>Utilizzare lo stesso formato immagine, fattore di zoom e frequenza di scansione del passaggio 5.6. Impostate i parametri di media di linee e fotogrammi su 1.</li>
	<li>Fare clic sul pulsante Scan nel software per eseguire l'ablazione del mcMTOC eseguendo una singola scansione laser del ROI selezionato.</li>
	<li>Utilizzare le impostazioni del canale dal passaggio 5.7 per rivedere i risultati dell'ablazione confrontando le immagini delle strutture marcate con GFP prese prima e dopo l'esposizione laser multi-fotone. Se l'ablazione ha successo, l'intensità della fluorescenza GFP nel mcMTOC mirato diminuisce ai livelli osservati sullo sfondo.</li>
	<li>Se rimangono alcuni frammenti di una struttura di etichettatura GFP, ripetere il passaggio 6.4 una o più volte concentrandosi su vari piani z del mcMTOC.</li>
	<li>Utilizzare le impostazioni del canale dal passaggio 5.7 per verificare l'efficienza di ablazione mediante la perdita completa dei segnali mCherry associati a mcMTOC (mCh-Cep192).</li>
	<li>Ripetere il passaggio da 5.8 al punto 6.7 fino a quando tutti gli MTOC di un ovocita (su vari piani focali) sono ablati. NOTA: Questo protocollo utilizza la microiniezione mCh-Cep192 come strategia per confermare la deplezione di mcMTOC dopo esposizione laser multi-fotone ed escludere la possibilità che la perdita di fluorescenza GFP sia causata dal fotosbiancamento GFP. Tuttavia, la microiniezione di questa sonda è facoltativa e non richiesta per la procedura di ablazione.</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Esistono diversi metodi per disturbare le strutture correlate al citoscheletro all'interno delle cellule22,23,24,25. Tuttavia, trovare tecniche efficienti per perturbare selettivamente la struttura mirata senza compromettere la vitalità cellulare è difficile. Il metodo di ablazione laser multi-fotone qui presentato è una strategia efficiente per indurre una perturbazione meccanica selettiva ai mcMTOC all'interno dell'ovocita senza alterare la vitalità dell'ovocita.
L'ablazione laser è stata ampiamente utilizzata per comprendere i meccanismi molecolari che controllano la segregazione cromosomica durante la mitosi e la meiosi22,23,26,27. A causa delle dimensioni relativamente grandi (>80 mm di diametro) degli ovociti di mammifero rispetto alle cellule somatiche28, l'ablazione delle loro strutture intracellulari rappresenta una sfida. Inoltre, il volume medio di mcMTOC negli ovociti in metafase I è ~ 20 μm15, rappresentando un'ulteriore sfida. Un metodo efficiente che offra una penetrazione più profonda dei tessuti deve essere adottato per superare queste sfide. Il vantaggio principale dell'utilizzo del laser multi-fotone per l'ablazione è la sua capacità di raggiungere più in profondità la cellula riducendo al minimo gli effetti fuori bersaglio29.
Per verificare l'efficacia e l'efficienza del metodo di ablazione laser per esaurire la struttura mirata, si raccomanda di utilizzare una proteina marcata con fluorescenza per identificare la struttura bersaglio nel tempo (prima e dopo l'ablazione)23. È importante notare che l'ablazione laser esaurisce l'intero mcMTOC come struttura e, sebbene gli mcMTOC più piccoli richiedano solo una singola esposizione laser per essere esauriti, gli mcMTOC più grandi possono richiedere più di un'esposizione laser a diversi piani focali. Si raccomanda inoltre di fissare e immunomarcare un sottogruppo di ovociti di controllo e mcMTOC-ablati con un marcatore MTOC (come γ-tubulina, pericentrina o Cep192) per confermare ulteriormente l'efficienza dell'ablazione mcMTOC. Negli ovociti di controllo, le aree del citoplasma adiacenti ma non sovrapposte agli mcMTOC saranno esposte al laser.
Questo esperimento richiede diverse ablazioni mcMTOC mentre si sposta tra diversi piani focali all'interno degli ovociti. Pertanto, si consiglia vivamente di praticare questa tecnica più volte prima di eseguire l'esperimento per ridurre al minimo il tempo dell'esperimento, aumentando così la vitalità degli ovociti. Inoltre, è importante utilizzare la potenza laser minima sufficiente per esaurire gli mcMTOC senza compromettere la vitalità degli ovociti.
Questa tecnica ha alcune limitazioni. In primo luogo, i microscopi confocali multi-fotone sono relativamente più costosi dei normali microscopi confocali. In secondo luogo, perturbare tutti gli mcMTOC su diversi piani focali richiede più tempo rispetto alle perturbazioni chimiche o genetiche. In terzo luogo, questo protocollo richiede competenze tecniche per ablare tutti gli mcMTOC nel più breve tempo possibile. Tuttavia, una volta padroneggiato, l'uso del laser multi-fotone fornisce un'eccellente strategia per perturbare diverse strutture intracellulari negli ovociti di topo, compresi gli mcMTOC, contribuendo alla comprensione dei meccanismi molecolari che regolano il posizionamento del fuso e la sua tempestiva migrazione negli ovociti di mammifero.

I gameti aploidi (spermatozoi e ovociti) sono prodotti attraverso la meiosi, che comporta un ciclo di replicazione del DNA seguito da due divisioni consecutive necessarie per la riduzione del numero cromosomico prima della fecondazione. Nei mammiferi, durante la prima vita fetale, l'ovocita subisce un lungo arresto (fino alla pubertà) allo stadio diplotene della profase I della prima divisione meiotica, uno stadio chiamato stadio della vescicola germinale (GV). Dopo la ripresa meiotica, l'ovocita GV subisce la rottura dell'involucro nucleare (NEBD) e il fuso viene assemblato principalmente al centro dell'ovocita 1,2,3. Successivamente, guidato da F-actina, il fuso migra in modo tempestivo dal centro dell'ovocita alla corteccia per garantire una divisione altamente asimmetrica, risultando in un uovo con un piccolo corpo polare (PB)4,5,6.
Nelle cellule mitotiche, i centrosomi sono costituiti da una coppia di centrioli circondati da componenti materiali pericentriolari (PMC), come pericentrina, γ-tubulina, Cep152 e Cep1927. Questi centrosomi contenenti centrioli contribuiscono alla fedeltà della formazione del fuso bipolare8. Tuttavia, i centrioli vengono persi durante l'oogenesi precoce in varie specie, compresi i roditori9. Pertanto, gli ovociti di topo adottano una via di assemblaggio del fuso indipendente dal centriolo utilizzando numerosi centri di organizzazione dei microtubuli acentriolari (MTOC)9,10. Alla ripresa meiotica, gli MTOC perinucleari subiscono tre fasi distinte di ricondensazione, allungamento e frammentazione in un gran numero di MTOC più piccoli11,12. Gli MTOC frammentati vengono quindi raggruppati e ordinati per organizzare un fuso bipolare10,13,14. Un altro pool di MTOC si trova nel citoplasma durante NEBD. Alcuni di questi MTOC citoplasmatici migrano e formano poli del fuso (MTOC polari, pMTOC)10,11. Recentemente, è stato scoperto un altro sottogruppo di MTOC citoplasmatici, chiamati MTOC citoplasmatici metafase (mcMTOC), che non contribuiscono alla formazione del polo del fuso ma rimangono nel citoplasma ovocitario durante la metafase I (Met I)15. L'esaurimento degli mcMTOC mediante ablazione laser multi-fotone o l'aumento anomalo del loro numero mediante inibizione dell'autofagia perturba il posizionamento e la migrazione del fuso e aumenta l'incidenza di aneuploidia negli ovociti in metafase II15.
È interessante notare che i mcMTOC differiscono dai pMTOC in molti aspetti15. Ad esempio, a differenza dei pMTOC, che provengono principalmente dagli MTOC perinucleari, i mMTOC provengono dalla corteccia ovocitaria. Quando il fuso è ancora al centro dell'ovocita, gli mcMTOC sono localizzati in modo asimmetrico opposto al lato verso il quale il mandrino migra per l'estrusione PB15. Le MT astrali non possono raggiungere la corteccia nella cellula ovocitaria relativamente grande. Pertanto, questi mcMTOC nucleano MT per ancorare il fuso (tramite MTOC astrali) alla corteccia. Questi risultati suggeriscono un modello in cui la forza MT nucleata da mcMTOC contrasta la forza mediata da F-actina che guida la migrazione del fuso verso la corteccia. L'equilibrio tra queste due forze opposte è essenziale per regolare il posizionamento centrale del mandrino e la migrazione tempestiva del mandrino15.
Ad oggi, tutte le proteine PMC esaminate (pericentrina, g-tubulina, Cep192 e Aurora chinasi A) si localizzano in entrambi i pool MTOC: mcMTOCs e pMTOCs15. Pertanto, non esiste un approccio chimico o genetico per perturbare selettivamente gli mcMTOC senza perturbare i pMTOC. Queste limitazioni possono essere aggirate prendendo di mira selettivamente gli mcMTOC con ablazione laser. Tra le tecnologie basate su laser sviluppate per la microablazione, i laser a femtosecondi multifotoni pulsati mostrano un grande potenziale grazie al loro impatto di precisione limitato al piano focale, all'elevata profondità di penetrazione della luce nel vicino infrarosso e alla ridotta fototossicità e danno termico alla cella16,17,18. Questo lavoro descrive un approccio selettivo per ablare i mcMTOC negli ovociti di topo utilizzando un laser multi-fotone accoppiato a un microscopio invertito.

<table><tbody><tr><td>4 IN thinwall GL 1.0 OD/.75 ID</td><td>World precision instrument&amp;nbsp;</td><td>TW100F-4</td><td>Injection needles&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Borosilicate glass&amp;nbsp;</td><td>Fisherbrand&amp;nbsp;</td><td>Cat# 13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillarities&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instrument&amp;nbsp;</td><td>Cat# TW100-6</td><td>Holding needles&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Bovine serum albumine&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# A4503</td><td></td></tr><tr><td>Cage incubator for Leica DMI6000 B microscope</td><td>Life Imaging Services GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcium chlrode dihydrate</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# C7902</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; controller&amp;nbsp;</td><td>Pecon</td><td># 0506.000</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Cover HP</td><td>Pecon</td><td># 0506.020</td><td></td></tr><tr><td>DL-Lactic acid&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# L7900</td><td></td></tr><tr><td>DMi8</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>Microscope&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# E5134</td><td></td></tr><tr><td>Femtojet 4i</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>Microinjector&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Femtotips Microloader</td><td>Fisher scientific&amp;nbsp;</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# G1272</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# 1272</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom dish&amp;nbsp;</td><td>Mat Tek Corporation</td><td>Cat# P35G-1.0-20-C&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hepes&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# H3784</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Sodium Salt</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat # H3784</td><td></td></tr><tr><td>Hera Cell vios 160i</td><td>Thermo&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Leica TCP SP8 spectral laser scanning confocal micorscope with inverted stand DMI6000 B</td><td>Leica Microsystems, Inc</td><td>N/A&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat#G8540</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate dihydrate</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# M7774</td><td></td></tr><tr><td>MaiTai DeepSee Ti-Sapphire femtosecond laser</td><td>Spectra-Physics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>mCH-Cep192 cRNA</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Medium Essential Medium Eagle - MEM</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat #M0258</td><td></td></tr><tr><td>Milrinone</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat# M4659</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat# M5310</td><td></td></tr><tr><td>Minimum essential medium eagle (MEM)</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# M0268 - 1L</td><td></td></tr><tr><td>Mouse: Cep192-eGFP reporter CF-1</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (100 mm)</td><td>Fisherbrand&amp;nbsp;</td><td>Cat# FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (35 mm)</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>Cat# 430165</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (60 mm)</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>Cat# 351007</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# P5530</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrolidone</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cat# P2307</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrolidone (PVP)</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# P2307</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# P5405</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# P5655</td><td></td></tr><tr><td>Pregnant mare&amp;acute;s serum gonadotropin&amp;nbsp;</td><td>Lee BioSolutions</td><td>Cat# 493-10-10&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvic acid&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# P4562</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvic acid&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# P4562</td><td></td></tr><tr><td>Sewing needles&amp;nbsp;</td><td>D.M.C</td><td>N/A</td><td>N&amp;deg; 5 * 16 Needles&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# S5761</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# S5886</td><td></td></tr><tr><td>Stage-top heating insert P</td><td>Pecon</td><td># 0426.300</td><td></td></tr><tr><td>Sterezoom S9i</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>Stereomicroscope&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Syringe 1 mL</td><td>BD company&amp;nbsp;</td><td>Cat# 309597</td><td></td></tr><tr><td>Taurine&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma&amp;nbsp;</td><td>Cat# T0625</td><td></td></tr><tr><td>Temperature controller Tempcontrol 37-2 &lt;em&gt;digital&lt;/em&gt;</td><td>Pecon</td><td># 0503.000</td><td></td></tr><tr><td>The Cube temperature controller for the cage incubator</td><td>Life Imaging Services GmbH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

multi-photon laser ablation of cytoplasmic microtubule organizing centers in mouse oocytes

La fedeltà della meiosi ovocitaria è fondamentale per generare uova euploidi competenti dal punto di vista dello sviluppo. Nei mammiferi, l'ovocita subisce un lungo arresto alla profase I della prima divisione meiotica. Dopo la pubertà e alla ripresa meiotica, la membrana nucleare si smonta (rottura dell'involucro nucleare) e il fuso viene assemblato principalmente al centro dell'ovocita. Il posizionamento iniziale del mandrino centrale è essenziale per proteggersi da attacchi anomali cinetococo-microtubuli (MT) e aneuploidia. Il fuso posizionato centralmente migra in modo sensibile al tempo verso la corteccia, e questo è un processo necessario per estrudere un piccolo corpo polare. Nelle cellule mitotiche, il posizionamento del fuso si basa sull'interazione tra MT astrali mediate dal centrosoma e la corteccia cellulare. Al contrario, gli ovociti di topo mancano dei centrosomi classici e, invece, contengono numerosi centri di organizzazione MT acentriolare (MTOC). Nella fase di metafase I, gli ovociti di topo hanno due diversi set di MTOC: (1) MTOC raggruppati e ordinati per assemblare i poli del fuso (MTOC polari) e (2) MTOC citoplasmatici in metafase (mcMTOC) che rimangono nel citoplasma e non contribuiscono direttamente alla formazione del fuso ma svolgono un ruolo cruciale nella regolazione del posizionamento del fuso e nella migrazione tempestiva del fuso. Qui, viene descritto un metodo di ablazione laser multi-fotone per esaurire selettivamente gli mcMTOC marcati endogenamente negli ovociti raccolti da topi reporter Cep192-eGfp . Questo metodo contribuisce alla comprensione dei meccanismi molecolari alla base del posizionamento e della migrazione del fuso negli ovociti di mammifero.

L'ablazione laser multi-fotone fornisce un metodo efficiente per ablare selettivamente le strutture intracellulari. L'attuale studio ha utilizzato l'ablazione laser multi-fotone per esaurire selettivamente gli mcMTOC negli ovociti di topo. L'ablazione laser ha depauperato gli mcMTOC in modo efficiente, come dimostrato dalla riduzione della fluorescenza endogena GFP negli mcMTOC mirati a un livello paragonabile allo sfondo. Anche l'mCh-Cep192 esogeno negli mcMTOC mirati è stato abolito in seguito all'ablazione laser. L'ablazione laser degli mcMTOC deve essere eseguita su diversi piani focali all'interno dell'ovocita (dove si trovano gli mcMTOC, Figura 2) per garantire che tutti gli mcMTOC all'interno dell'ovocita siano esauriti (Figura 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig01.jpg"> Figura 1: Microiniezione di ovociti. Microiniezione di un ovocita di topo arrestato con profase I con cRNA mCh-Cep192 . Barra scala: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig02.jpg"> Figura 2: Deplezione di mcMTOCs negli ovociti di topo. Immagini rappresentative di singoli piani focali. I quadrati bianchi indicano un mcMTOC prima e dopo l'ablazione laser multi-fotone. Barra di scala: 40 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig03.jpg"> Figura 3: Deplezione di mcMTOC su diversi piani focali in un ovocita di topo. Immagini rappresentative di massima proiezione di un ovocita di topo ablato da mcMTOC. Barra scala: 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
File supplementare 1: Composizioni di Chatot, Ziomek e Bavister (CZB) e mezzo essenziale minimo privo di bicarbonato (MEM/PVP). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439_Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

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Multi-Photon Laser Ablation of Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers in Mouse Oocytes

Viene presentato un protocollo ottimizzato che consente l'esaurimento dei centri di organizzazione dei microtubuli citoplasmatici negli ovociti di topo durante la metafase I utilizzando un laser a femtosecondi nel vicino infrarosso.

Ablazione laser multi-fotone di centri di organizzazione di microtubuli citoplasmatici in ovociti di topo

The fidelity of oocyte meiosis is critical for generating developmentally competent euploid eggs. In mammals, the oocyte undergoes a lengthy arrest at ...

multi-photon-laser-ablation-cytoplasmic-microtubule-organizing

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

1.6K Views.  University of Missouri. Viene presentato un protocollo ottimizzato che consente l'esaurimento dei centri di organizzazione dei microtubuli citoplasmatici negli ovociti di topo durante la metafase I utilizzando un laser a femtosecondi nel vicino infrarosso. 

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Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures. 
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

Here we present a protocol for the characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar organization.

Isolamento e caratterizzazione di mouse Antral ovociti Sulla base Nucleolare cromatina Organizzazione

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

Usando i Oocytes del Mouse per valutare la funzione del Gene umano durante la meiosi I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Genetica

Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that take place in the cytoplasm in preparation for fertilization and acquisition of totipotency. During oocyte maturation, changes in gene expression depend exclusively on the translation and degradation of maternal messenger RNAs (mRNAs) rather than on transcription. Execution of the translational program, therefore, plays a key role in establishing oocyte developmental competence to sustain embryo development. This paper is part of a focus on defining the program of maternal mRNA translation that takes place during meiotic maturation and at the oocyte-to-zygote transition. In this method paper, a strategy is presented to study the regulation of translation of target mRNAs during in vitro oocyte maturation. Here, a Ypet reporter is fused to the 3&#39; untranslated region (UTR) of the gene of interest and then micro-injected into oocytes together with polyadenylated mRNA encoding for mCherry to control for injected volume. By using time-lapse microscopy to measure reporter accumulation, translation rates are calculated at different transitions during oocyte meiotic maturation. Here, the protocols for oocyte isolation and injection, time-lapse recording, and data analysis have been described, using the Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3&#39; UTR reporter as an example.

This protocol describes a reporter assay to study the regulation of mRNA translation in single oocytes during in vitro maturation.

Definizione del programma di traduzione dell'mRNA materno durante la maturazione in vitro utilizzando un saggio single oocyte reporter

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...

Spatiotemporal Subcellular Manipulation of the Microtubule Cytoskeleton in the Living Preimplantation Mouse Embryo using Photostatins

The microtubule cytoskeleton forms the framework of a cell and is fundamental for intracellular transport, cell division, and signal transduction. Traditional pharmacological disruption of the ubiquitous microtubule network using, for instance, nocodazole can have devastating consequences for any cell. Reversibly photoswitchable microtubule inhibitors have the potential to overcome the limitations by enabling drug effects to be implemented in a spatiotemporally-controlled manner. One such family of drugs is the azobenzene-based photostatins (PSTs). These compounds are inactive in dark conditions, and upon illumination with UV light, they bind to the colchicine-binding site of &#946;-tubulin and block microtubule polymerization and dynamic turnover. Here, the application of PSTs in the 3-dimensional (3D) live preimplantation mouse embryo is set out to disrupt the microtubule network on a subcellular level. This protocol provides instructions for the experimental setup, as well as light activation and deactivation parameters for PSTs using live-cell confocal microscopy. This ensures reproducibility and enables others to apply this procedure to their research questions. Innovative photoswitches like PSTs may evolve as powerful tools to advance the understanding of the dynamic intracellular microtubule network and to non-invasively manipulate the cytoskeleton in real-time. Furthermore, PSTs may prove useful in other 3D structures such as organoids, blastoids, or embryos of other species.

Typical microtubule inhibitors, used widely in basic and applied research, have far-reaching effects on cells. Recently, photostatins emerged as a class of photoswitchable microtubule inhibitors, capable of instantaneous, reversible, spatiotemporally precise manipulation of microtubules. This step-by-step protocol details the application of photostatins in a 3D live preimplantation mouse embryo.

Manipolazione subcellulare spaziotemporale del citoscheletro del microtubulo nell'embrione di topo vivente preimpianto utilizzando le fotostattine

The microtubule cytoskeleton forms the framework of a cell and is fundamental for intracellular transport, cell division, and signal transduction. ...

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

Valutazione dell'integrità del checkpoint dell'assemblaggio del mandrino negli ovociti di topo

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

Identificazione del danno al DNA negli ovociti arrestati con profase di topi

Detection of DNA Double-Stranded Breaks in Mouse Oocytes

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain arrested at the prophase of meiosis I. The quiescent state may last for years until the oocytes receive a stimulus to grow and obtain the competency to resume meiosis. This protracted state of arrest makes them extremely susceptible to accumulating DNA-damaging insults, which affect the genetic integrity of the female gametes and, therefore, the genetic integrity of the future embryo. 
Consequently, the development of an accurate method to detect DNA damage, which is the first step for the establishment of DNA damage response mechanisms, is of vital importance. This paper describes a common protocol to test the presence and progress of DNA damage in prophase-arrested oocytes during a period of 20 h. Specifically, we dissect mouse ovaries, retrieve the cumulus-oocyte complexes (COCs), remove the cumulus cells from the COCs, and culture the oocytes in &#924;2 medium containing 3-isobutyl-1-methylxanthine to maintain the state of arrest. Thereafter, the oocytes are treated with the cytotoxic, antineoplasmic drug, etoposide, to engender double-strand breaks (DSBs). 
By using immunofluorescence and confocal microscopy, we detect and quantify the levels of the core protein &#947;H2AX, which is the phosphorylated form of the histone H2AX. H2AX becomes phosphorylated at the sites of DSBs after DNA damage. The inability to restore DNA integrity following DNA damage in oocytes can lead to infertility, birth defects, and increased rates of spontaneous abortions. Therefore, the understanding of DNA damage response mechanisms and, at the same time, the establishment of an intact method for studying these mechanisms are essential for reproductive biology research.

Autore in primo piano: Comprendere la risposta al danno al DNA negli ovociti dei mammiferi e negli embrioni preimpianto 

Maintaining oocyte genome integrity is necessary to ensure the genetic fidelity in the resulting embryo. Here, we present an accurate protocol for detecting DNA double-strand breaks in mammalian female germ cells.

Rilevamento di rotture a doppio filamento di DNA in ovociti di topo

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

Microiniezione degli ovociti mouse, Maturazione e Ploidia valutazione

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Biologia

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.

Ablazione laser multi-fotone di centri di organizzazione di microtubuli citoplasmatici in ovociti di topo

Riepilogo

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Capitoli in questo video

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Rilevamento di rotture a doppio filamento di DNA in ovociti di topo

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Microiniezione degli ovociti mouse, Maturazione e Ploidia valutazione

Meiotic mandrino valutazione in mouse Ovociti mettendo a tacere siRNA-mediata