Gli autori desiderano ringraziare tutti i membri del laboratorio Balboula per il loro prezioso aiuto e discussioni. Gli autori ringraziano Melina Schuh per aver gentilmente condiviso il costrutto mCherry-Cep192. Questo studio è stato supportato da R35GM142537 (NIGMS, NIH) a AZB.

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Università del Missouri (Animal Care Quality Assurance Ref. Number 9695). Nel presente studio sono stati utilizzati topi femmina reporter Cep192-eGFP di età compresa tra 6 e 8 settimane. Per generare topi reporter Cep192-eGFP , è stata utilizzata la riparazione diretta dall'omologia mediata da CRISPR / Cas9 per integrare il gene reporter EGFP nel genoma del topo CF-1. Il reporter EGFP è stato fuso al C-terminus di Cep192 (una componente integrante degli MTOC)15. Per mantenere la colonia di topi, sono stati utilizzati topi reporter omozigoti Cep192-eGfp . Tutti gli animali sono stati tenuti in gabbie (fino a quattro animali / gabbia) a 21 ° C e 55% di umidità, con un ciclo luce / buio di 12 ore e accesso ad libitum a cibo e acqua.
1. Raccolta di ovociti di topo
<ol><li>Preparare il terreno di coltura (Chatot, Ziomek e Bavister, CZB19, vedere la tabella dei materiali) e incubarlo a 37 °C e al 5% di CO2 durante la notte. NOTA: Il mezzo CZB può essere conservato a 4 °C per 1 mese (vedere il file supplementare 1 per la composizione del supporto).</li>
	<li>Integrare il terreno CZB con glutammina (1 mM) e milrinone (2,5 mM) (CZB + M) (vedi Tabella dei materiali) e metterlo nell'incubatore. NOTA: Il milrinone è un inibitore della fosfodiesterasi che mantiene gli ovociti arrestati alla profase I e impedisce la ripresa meiotica20.</li>
	<li>Preparare il mezzo di raccolta (terreno essenziale minimo privo di bicarbonato, MEM) contenente 3 mg/ml di polivinilpirolidone (PVP), 25 mM HEPES (pH 7,3) (File supplementare 1) e milrinone (2,5 mM) (MEM/PVP + M, vedere la tabella dei materiali).</li>
	<li>Preparare i piatti di raccolta e coltura, preparare quattro microgocce (100 μL) di terreno di raccolta (MEM / PVP + M) e due microgocce (100 μL) di terreno di coltura (CZB + M) in piastre di Petri da 60 mm e 35 mm, rispettivamente, e coprirle con olio minerale (vedi Tabella dei materiali). Tenere il piatto di raccolta sul vetrino più caldo e mettere il piatto di coltura nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO2.</li>
	<li>Iniettare per via intraperitoneale 5 UI di gonadotropina sierica di cavalla gravida (PMSG, vedere la tabella dei materiali) in topi femmina sessualmente maturi (6-8 settimane) Cep192-eGFP 44-48 ore prima della raccolta degli ovociti.</li>
	<li>Sacrificare i topi mediante lussazione cervicale, identificare e rimuovere le ovaie21 e trasferirle in un vetro da orologio contenente terreno di raccolta preriscaldato (MEM / PVP + M) a 37 ° C.</li>
	<li>Fissare l'ovaia toccando una siringa da 1 mL sul fondo del vetro dell'orologio e perforandola più volte (~ 40 volte per ovaio) usando aghi da cucito raggruppati insieme per rilasciare gli ovociti nel mezzo.</li>
	<li>Utilizzando un pipetta di trasferimento in plastica, trasferire tutto il mezzo contenente i complessi cumulo-ovocita (COC) dal punto 1.7 in una capsula di Petri di plastica vuota da 100 mm.</li>
	<li>Sotto uno stereomicroscopio, raccogliere i COC utilizzando un pipet di vetro Pasteur e trasferirli nel piatto di raccolta che contiene MEM / PVP + M.</li>
	<li>Utilizzando un pipetta di vetro Pasteur stretto (circa 100 μm di diametro), denudare meccanicamente gli ovociti mediante un delicato pipettaggio ripetitivo, seguito dal trasferimento e dal lavaggio in quattro microgocce di (100 μL) MEM/PVP + M (il piatto di raccolta) prima del loro trasferimento nel piatto di coltura CZB + M.</li>
	<li>Incubare gli ovociti denudati per 1 ora a 37 °C con il 5% di CO2 nell'aria.</li>
</ol>2. Microiniezione di ovociti
<ol><li>Introdurre una goccia da 250 μL di MEM/PVP + M in un coperchio in plastica di Petri da 100 mm e coprirlo con olio minerale. NOTA: Il coperchio della piastra di Petri ha un bordo inferiore che offre più spazio per la regolazione del micromanipolatore.</li>
	<li>Accendere il sistema di microiniezione (vedere la tabella dei materiali).</li>
	<li>Posizionare il piatto di microiniezione sullo stadio di riscaldamento (37 °C) del microscopio.</li>
	<li>Caricare l'ago per iniezione con 0,5 μL di cRNA mCh-Cep192utilizzando le punte delle pipette del microcaricatore (vedere Tabella dei materiali) e fissare l'ago per iniezione al micromanipolatore.</li>
	<li>Trasferire gli ovociti denudati (fase 1.11) nella microgoccia da 250 μL (fase 2.1).</li>
	<li>Sotto una lente obiettivo 20x o 40x, regolare la posizione e la messa a fuoco degli aghi per iniezione e di tenuta in base alla posizione dell'ovocita (Figura 1).</li>
	<li>Impostare l'unità di microiniezione e impostare la pressione di iniezione (p i), la pressione di compensazione (pc) e il tempo di iniezione (ti) per essere in grado di iniettare 5-10 pl di cRNA mCh-Cep192 (per marcare esogenamente gli MTOC).</li>
	<li>Iniettare con cura gli ovociti senza toccare il nucleo.</li>
	<li>Una volta iniettati tutti gli ovociti, lavarli in tre microgocce di CZB + M, trasferirli nel piatto di coltura (CZB + M) e incubarli per 3 ore a 37 °C per consentire l'espressione di mCh-Cep192.</li>
</ol>3. Maturazione degli ovociti
<ol><li>Preparare il mezzo di maturazione aggiungendo glutammina (1 mM) al mezzo CZB pre-equilibrato in un incubatore con il 5% di CO2 in aria a 37 °C per almeno 3 ore.</li>
	<li>Fare due microgocce (100 μL) del mezzo di maturazione in una capsula di Petri da 35 mm e coprirle con olio minerale (piatto di maturazione).</li>
	<li>Lavare gli ovociti arrestati in profase I almeno tre volte in microgocce CZB prive di milrinone da 100 μL per rimuovere completamente il milrinone e consentire la ripresa meiotica.</li>
	<li>Trasferire gli ovociti nel piatto di maturazione e incubarli per 5 ore (stadio di prometafase I) in un incubatore umidificato con il 5% di CO2 in aria a 37 °C.</li>
</ol>4. Preparazione degli ovociti per l'ablazione e l'imaging
<ol><li>Trasferire gli ovociti di prometafase I (fase 3.4) in una capsula di coltura a fondo di vetro contenente 100 μL di terreno di maturazione (fase 3.1) ricoperta di olio minerale.</li>
</ol>5. Preparazione al microscopio per l'ablazione
<ol><li>Almeno 30 minuti prima dell'ablazione, accendere il regolatore di temperatura per l'incubatore dello stadio (vedere Tabella dei materiali) e impostarlo a 37 °C.</li>
	<li>Accendere il controller CO 2 e impostarlo su 5% CO2.</li>
	<li>Selezionare un obiettivo apocromatico ad immersione in olio 40x e applicare una piccola goccia dell'olio ad immersione.</li>
	<li>Montare il piatto di coltura con fondo di vetro con gli ovociti su un'incubatrice da palcoscenico e coprire l'incubatrice con un coperchio a gas.</li>
	<li>Nel software di acquisizione delle immagini (vedere la tabella dei materiali), selezionare un'opzione che consente il salvataggio di più posizioni di fase (ad esempio, "Definisci segna e trova esperimento"). Utilizzando l'illuminazione a luce luminosa trasmessa, centrare i singoli ovociti e salvare le loro posizioni.</li>
	<li>Nel software di acquisizione immagini, selezionare la modalità di scansione XYZ , impostare il formato dell'immagine su 256 x 256 pixel, impostare il fattore di zoom su 2,5x - 3,0x e selezionare una frequenza di scansione di 600 Hz. Ciò corrisponde a un tempo di permanenza dei pixel di circa 1,6 μs.</li>
	<li>Impostare una linea laser di eccitazione a 488 nm a circa il 10% della potenza del laser (che corrisponde a 4,0 μW a livello del campione) (vedere Tabella dei materiali) e utilizzare una larghezza di banda spettrale di 500-550 nm per osservare il segnale GFP dagli MTOC. Per l'osservazione simultanea della fluorescenza dal Cep192 marcato con mCherry, impostare una linea laser di eccitazione a 585 nm a circa l'8% della potenza del laser (che corrisponde a 10,7 μW a livello del campione) e utilizzare un altro rivelatore impostato su una larghezza di banda spettrale di 595-645 nm. NOTA: È utile utilizzare il rilevatore di luce trasmessa (TLD) del microscopio confocale per rilevare contemporaneamente i confini degli ovociti.</li>
	<li>Utilizzando una modalità di scansione dal vivo e il controllo manuale dello z-drive, eseguire lo screening dell'ovocita per gli MTOC.</li>
	<li>Una volta rilevato un mcMTOC, disegna una regione quadrata di interesse (ROI) attorno ad esso.</li>
</ol>6. Ablazione di mcMTOCs
<ol><li>Impostare un laser a femtosecondi su una lunghezza d'onda di 740 nm. NOTA: La lunghezza d'onda del laser può essere modificata in base al microscopio e alle condizioni del laser.</li>
	<li>Utilizzare il modulatore elettro-ottico del microscopio multi-fotone (vedi Tabella dei materiali) per impostare la potenza del laser al 70% -80%, corrispondente alla potenza di 60-70 mW sul piano del campione. NOTA: Se il laser è dotato di un compensatore di impulsi a femtosecondi, utilizzarlo per correggere la dispersione del ritardo di gruppo (GDD). La correzione GDD riduce la quantità di potenza laser necessaria per un'ablazione efficiente di mcMTOC e minimizza il fotodanneggiamento dell'ovocita. Il controllo GDD è solitamente integrato con il software di acquisizione immagini dei microscopi multifotoni commerciali.</li>
	<li>Utilizzare lo stesso formato immagine, fattore di zoom e frequenza di scansione del passaggio 5.6. Impostate i parametri di media di linee e fotogrammi su 1.</li>
	<li>Fare clic sul pulsante Scan nel software per eseguire l'ablazione del mcMTOC eseguendo una singola scansione laser del ROI selezionato.</li>
	<li>Utilizzare le impostazioni del canale dal passaggio 5.7 per rivedere i risultati dell'ablazione confrontando le immagini delle strutture marcate con GFP prese prima e dopo l'esposizione laser multi-fotone. Se l'ablazione ha successo, l'intensità della fluorescenza GFP nel mcMTOC mirato diminuisce ai livelli osservati sullo sfondo.</li>
	<li>Se rimangono alcuni frammenti di una struttura di etichettatura GFP, ripetere il passaggio 6.4 una o più volte concentrandosi su vari piani z del mcMTOC.</li>
	<li>Utilizzare le impostazioni del canale dal passaggio 5.7 per verificare l'efficienza di ablazione mediante la perdita completa dei segnali mCherry associati a mcMTOC (mCh-Cep192).</li>
	<li>Ripetere il passaggio da 5.8 al punto 6.7 fino a quando tutti gli MTOC di un ovocita (su vari piani focali) sono ablati. NOTA: Questo protocollo utilizza la microiniezione mCh-Cep192 come strategia per confermare la deplezione di mcMTOC dopo esposizione laser multi-fotone ed escludere la possibilità che la perdita di fluorescenza GFP sia causata dal fotosbiancamento GFP. Tuttavia, la microiniezione di questa sonda è facoltativa e non richiesta per la procedura di ablazione.</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Esistono diversi metodi per disturbare le strutture correlate al citoscheletro all'interno delle cellule22,23,24,25. Tuttavia, trovare tecniche efficienti per perturbare selettivamente la struttura mirata senza compromettere la vitalità cellulare è difficile. Il metodo di ablazione laser multi-fotone qui presentato è una strategia efficiente per indurre una perturbazione meccanica selettiva ai mcMTOC all'interno dell'ovocita senza alterare la vitalità dell'ovocita.
L'ablazione laser è stata ampiamente utilizzata per comprendere i meccanismi molecolari che controllano la segregazione cromosomica durante la mitosi e la meiosi22,23,26,27. A causa delle dimensioni relativamente grandi (>80 mm di diametro) degli ovociti di mammifero rispetto alle cellule somatiche28, l'ablazione delle loro strutture intracellulari rappresenta una sfida. Inoltre, il volume medio di mcMTOC negli ovociti in metafase I è ~ 20 μm15, rappresentando un'ulteriore sfida. Un metodo efficiente che offra una penetrazione più profonda dei tessuti deve essere adottato per superare queste sfide. Il vantaggio principale dell'utilizzo del laser multi-fotone per l'ablazione è la sua capacità di raggiungere più in profondità la cellula riducendo al minimo gli effetti fuori bersaglio29.
Per verificare l'efficacia e l'efficienza del metodo di ablazione laser per esaurire la struttura mirata, si raccomanda di utilizzare una proteina marcata con fluorescenza per identificare la struttura bersaglio nel tempo (prima e dopo l'ablazione)23. È importante notare che l'ablazione laser esaurisce l'intero mcMTOC come struttura e, sebbene gli mcMTOC più piccoli richiedano solo una singola esposizione laser per essere esauriti, gli mcMTOC più grandi possono richiedere più di un'esposizione laser a diversi piani focali. Si raccomanda inoltre di fissare e immunomarcare un sottogruppo di ovociti di controllo e mcMTOC-ablati con un marcatore MTOC (come γ-tubulina, pericentrina o Cep192) per confermare ulteriormente l'efficienza dell'ablazione mcMTOC. Negli ovociti di controllo, le aree del citoplasma adiacenti ma non sovrapposte agli mcMTOC saranno esposte al laser.
Questo esperimento richiede diverse ablazioni mcMTOC mentre si sposta tra diversi piani focali all'interno degli ovociti. Pertanto, si consiglia vivamente di praticare questa tecnica più volte prima di eseguire l'esperimento per ridurre al minimo il tempo dell'esperimento, aumentando così la vitalità degli ovociti. Inoltre, è importante utilizzare la potenza laser minima sufficiente per esaurire gli mcMTOC senza compromettere la vitalità degli ovociti.
Questa tecnica ha alcune limitazioni. In primo luogo, i microscopi confocali multi-fotone sono relativamente più costosi dei normali microscopi confocali. In secondo luogo, perturbare tutti gli mcMTOC su diversi piani focali richiede più tempo rispetto alle perturbazioni chimiche o genetiche. In terzo luogo, questo protocollo richiede competenze tecniche per ablare tutti gli mcMTOC nel più breve tempo possibile. Tuttavia, una volta padroneggiato, l'uso del laser multi-fotone fornisce un'eccellente strategia per perturbare diverse strutture intracellulari negli ovociti di topo, compresi gli mcMTOC, contribuendo alla comprensione dei meccanismi molecolari che regolano il posizionamento del fuso e la sua tempestiva migrazione negli ovociti di mammifero.

I gameti aploidi (spermatozoi e ovociti) sono prodotti attraverso la meiosi, che comporta un ciclo di replicazione del DNA seguito da due divisioni consecutive necessarie per la riduzione del numero cromosomico prima della fecondazione. Nei mammiferi, durante la prima vita fetale, l'ovocita subisce un lungo arresto (fino alla pubertà) allo stadio diplotene della profase I della prima divisione meiotica, uno stadio chiamato stadio della vescicola germinale (GV). Dopo la ripresa meiotica, l'ovocita GV subisce la rottura dell'involucro nucleare (NEBD) e il fuso viene assemblato principalmente al centro dell'ovocita 1,2,3. Successivamente, guidato da F-actina, il fuso migra in modo tempestivo dal centro dell'ovocita alla corteccia per garantire una divisione altamente asimmetrica, risultando in un uovo con un piccolo corpo polare (PB)4,5,6.
Nelle cellule mitotiche, i centrosomi sono costituiti da una coppia di centrioli circondati da componenti materiali pericentriolari (PMC), come pericentrina, γ-tubulina, Cep152 e Cep1927. Questi centrosomi contenenti centrioli contribuiscono alla fedeltà della formazione del fuso bipolare8. Tuttavia, i centrioli vengono persi durante l'oogenesi precoce in varie specie, compresi i roditori9. Pertanto, gli ovociti di topo adottano una via di assemblaggio del fuso indipendente dal centriolo utilizzando numerosi centri di organizzazione dei microtubuli acentriolari (MTOC)9,10. Alla ripresa meiotica, gli MTOC perinucleari subiscono tre fasi distinte di ricondensazione, allungamento e frammentazione in un gran numero di MTOC più piccoli11,12. Gli MTOC frammentati vengono quindi raggruppati e ordinati per organizzare un fuso bipolare10,13,14. Un altro pool di MTOC si trova nel citoplasma durante NEBD. Alcuni di questi MTOC citoplasmatici migrano e formano poli del fuso (MTOC polari, pMTOC)10,11. Recentemente, è stato scoperto un altro sottogruppo di MTOC citoplasmatici, chiamati MTOC citoplasmatici metafase (mcMTOC), che non contribuiscono alla formazione del polo del fuso ma rimangono nel citoplasma ovocitario durante la metafase I (Met I)15. L'esaurimento degli mcMTOC mediante ablazione laser multi-fotone o l'aumento anomalo del loro numero mediante inibizione dell'autofagia perturba il posizionamento e la migrazione del fuso e aumenta l'incidenza di aneuploidia negli ovociti in metafase II15.
È interessante notare che i mcMTOC differiscono dai pMTOC in molti aspetti15. Ad esempio, a differenza dei pMTOC, che provengono principalmente dagli MTOC perinucleari, i mMTOC provengono dalla corteccia ovocitaria. Quando il fuso è ancora al centro dell'ovocita, gli mcMTOC sono localizzati in modo asimmetrico opposto al lato verso il quale il mandrino migra per l'estrusione PB15. Le MT astrali non possono raggiungere la corteccia nella cellula ovocitaria relativamente grande. Pertanto, questi mcMTOC nucleano MT per ancorare il fuso (tramite MTOC astrali) alla corteccia. Questi risultati suggeriscono un modello in cui la forza MT nucleata da mcMTOC contrasta la forza mediata da F-actina che guida la migrazione del fuso verso la corteccia. L'equilibrio tra queste due forze opposte è essenziale per regolare il posizionamento centrale del mandrino e la migrazione tempestiva del mandrino15.
Ad oggi, tutte le proteine PMC esaminate (pericentrina, g-tubulina, Cep192 e Aurora chinasi A) si localizzano in entrambi i pool MTOC: mcMTOCs e pMTOCs15. Pertanto, non esiste un approccio chimico o genetico per perturbare selettivamente gli mcMTOC senza perturbare i pMTOC. Queste limitazioni possono essere aggirate prendendo di mira selettivamente gli mcMTOC con ablazione laser. Tra le tecnologie basate su laser sviluppate per la microablazione, i laser a femtosecondi multifotoni pulsati mostrano un grande potenziale grazie al loro impatto di precisione limitato al piano focale, all'elevata profondità di penetrazione della luce nel vicino infrarosso e alla ridotta fototossicità e danno termico alla cella16,17,18. Questo lavoro descrive un approccio selettivo per ablare i mcMTOC negli ovociti di topo utilizzando un laser multi-fotone accoppiato a un microscopio invertito.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4 IN thinwall GL 1.0 OD/.75 ID</td>
			<td>World precision instrument&#160;</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td>Injection needles&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass&#160;</td>
			<td>Fisherbrand&#160;</td>
			<td>Cat# 13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillarities&#160;</td>
			<td>World Precision Instrument&#160;</td>
			<td>Cat# TW100-6</td>
			<td>Holding needles&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage incubator for Leica DMI6000 B microscope</td>
			<td>Life Imaging Services GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chlrode dihydrate</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 controller&#160;</td>
			<td>Pecon</td>
			<td># 0506.000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Cover HP</td>
			<td>Pecon</td>
			<td># 0506.020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Lactic acid&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# L7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMi8</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtojet 4i</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microinjector&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotips Microloader</td>
			<td>Fisher scientific&#160;</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# G1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# 1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish&#160;</td>
			<td>Mat Tek Corporation</td>
			<td>Cat# P35G-1.0-20-C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes Sodium Salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cat # H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hera Cell vios 160i</td>
			<td>Thermo&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>CO2 incubator&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCP SP8 spectral laser scanning confocal micorscope with inverted stand DMI6000 B</td>
			<td>Leica Microsystems, Inc</td>
			<td>N/A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cat#G8540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate dihydrate</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# M7774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaiTai DeepSee Ti-Sapphire femtosecond laser</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCH-Cep192 cRNA</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium Essential Medium Eagle - MEM</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cat #M0258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milrinone</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cat# M4659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cat# M5310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium eagle (MEM)</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# M0268 - 1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: Cep192-eGFP reporter CF-1</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100 mm)</td>
			<td>Fisherbrand&#160;</td>
			<td>Cat# FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (35 mm)</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>Cat# 430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (60 mm)</td>
			<td>Falcon&#160;</td>
			<td>Cat# 351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# P5530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrolidone</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cat# P2307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrolidone (PVP)</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# P2307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant mare&#180;s serum gonadotropin&#160;</td>
			<td>Lee BioSolutions</td>
			<td>Cat# 493-10-10&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# P4562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# P4562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sewing needles&#160;</td>
			<td>D.M.C</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N&#176; 5 * 16 Needles&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage-top heating insert P</td>
			<td>Pecon</td>
			<td># 0426.300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterezoom S9i</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Stereomicroscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td>BD company&#160;</td>
			<td>Cat# 309597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>Cat# T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller Tempcontrol 37-2 digital</td>
			<td>Pecon</td>
			<td># 0503.000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Cube temperature controller for the cage incubator</td>
			<td>Life Imaging Services GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-photon laser ablation of cytoplasmic microtubule organizing centers in mouse oocytes

La fedeltà della meiosi ovocitaria è fondamentale per generare uova euploidi competenti dal punto di vista dello sviluppo. Nei mammiferi, l'ovocita subisce un lungo arresto alla profase I della prima divisione meiotica. Dopo la pubertà e alla ripresa meiotica, la membrana nucleare si smonta (rottura dell'involucro nucleare) e il fuso viene assemblato principalmente al centro dell'ovocita. Il posizionamento iniziale del mandrino centrale è essenziale per proteggersi da attacchi anomali cinetococo-microtubuli (MT) e aneuploidia. Il fuso posizionato centralmente migra in modo sensibile al tempo verso la corteccia, e questo è un processo necessario per estrudere un piccolo corpo polare. Nelle cellule mitotiche, il posizionamento del fuso si basa sull'interazione tra MT astrali mediate dal centrosoma e la corteccia cellulare. Al contrario, gli ovociti di topo mancano dei centrosomi classici e, invece, contengono numerosi centri di organizzazione MT acentriolare (MTOC). Nella fase di metafase I, gli ovociti di topo hanno due diversi set di MTOC: (1) MTOC raggruppati e ordinati per assemblare i poli del fuso (MTOC polari) e (2) MTOC citoplasmatici in metafase (mcMTOC) che rimangono nel citoplasma e non contribuiscono direttamente alla formazione del fuso ma svolgono un ruolo cruciale nella regolazione del posizionamento del fuso e nella migrazione tempestiva del fuso. Qui, viene descritto un metodo di ablazione laser multi-fotone per esaurire selettivamente gli mcMTOC marcati endogenamente negli ovociti raccolti da topi reporter Cep192-eGfp . Questo metodo contribuisce alla comprensione dei meccanismi molecolari alla base del posizionamento e della migrazione del fuso negli ovociti di mammifero.

L'ablazione laser multi-fotone fornisce un metodo efficiente per ablare selettivamente le strutture intracellulari. L'attuale studio ha utilizzato l'ablazione laser multi-fotone per esaurire selettivamente gli mcMTOC negli ovociti di topo. L'ablazione laser ha depauperato gli mcMTOC in modo efficiente, come dimostrato dalla riduzione della fluorescenza endogena GFP negli mcMTOC mirati a un livello paragonabile allo sfondo. Anche l'mCh-Cep192 esogeno negli mcMTOC mirati è stato abolito in seguito all'ablazione laser. L'ablazione laser degli mcMTOC deve essere eseguita su diversi piani focali all'interno dell'ovocita (dove si trovano gli mcMTOC, Figura 2) per garantire che tutti gli mcMTOC all'interno dell'ovocita siano esauriti (Figura 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig01.jpg"> Figura 1: Microiniezione di ovociti. Microiniezione di un ovocita di topo arrestato con profase I con cRNA mCh-Cep192 . Barra scala: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig02.jpg"> Figura 2: Deplezione di mcMTOCs negli ovociti di topo. Immagini rappresentative di singoli piani focali. I quadrati bianchi indicano un mcMTOC prima e dopo l'ablazione laser multi-fotone. Barra di scala: 40 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64439/64439fig03.jpg"> Figura 3: Deplezione di mcMTOC su diversi piani focali in un ovocita di topo. Immagini rappresentative di massima proiezione di un ovocita di topo ablato da mcMTOC. Barra scala: 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
File supplementare 1: Composizioni di Chatot, Ziomek e Bavister (CZB) e mezzo essenziale minimo privo di bicarbonato (MEM/PVP). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64439/64439_Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

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Multi-Photon Laser Ablation of Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers in Mouse Oocytes

Viene presentato un protocollo ottimizzato che consente l'esaurimento dei centri di organizzazione dei microtubuli citoplasmatici negli ovociti di topo durante la metafase I utilizzando un laser a femtosecondi nel vicino infrarosso.

Ablazione laser multi-fotone di centri di organizzazione di microtubuli citoplasmatici in ovociti di topo

The fidelity of oocyte meiosis is critical for generating developmentally competent euploid eggs. In mammals, the oocyte undergoes a lengthy arrest at ...

multi-photon-laser-ablation-cytoplasmic-microtubule-organizing

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

1.6K Views.  University of Missouri. Viene presentato un protocollo ottimizzato che consente l'esaurimento dei centri di organizzazione dei microtubuli citoplasmatici negli ovociti di topo durante la metafase I utilizzando un laser a femtosecondi nel vicino infrarosso. 

Video: Multi-Photon Laser Ablation of Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers in Mouse Oocytes

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures. 
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

Here we present a protocol for the characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar organization.

Isolamento e caratterizzazione di mouse Antral ovociti Sulla base Nucleolare cromatina Organizzazione

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their abundant pluripotent stem cell population and ability to regenerate all cell and tissue types after injuries that would be catastrophic for most animals. Recently, planarians have gained popularity as a model for eye regeneration. Their ability to regenerate the entire eye (comprised of two tissue types: pigment cells and photoreceptors) allows for the dissection of the mechanisms regulating visual system regeneration. Eye ablation has several advantages over other techniques (such as decapitation or hole punch) for examining eye-specific pathways and mechanisms, the most important of which is that regeneration is largely restricted to eye tissues alone. The purpose of this video article is to demonstrate how to reliably remove the planarian optic cup without disturbing the brain or surrounding tissues. The handling of worms and maintenance of an established colony is also described. This technique uses a 31 G, 5/16-inch insulin needle to surgically scoop out the optic cup of planarians immobilized on a cold plate. This method encompasses both single and double eye ablation, with eyes regenerating within 1-2 weeks, allowing for a wide range of applications. In particular, this ablation technique can be easily combined with pharmacological and genetic (RNA interference) screens for a better understanding of regenerative mechanisms and their evolution, eye stem cells and their maintenance, and phototaxic behavioral responses and their neurological basis.

This protocol shows how to consistently excise planarian eyes (optic cups) without disturbing surrounding tissues. Using an insulin needle and syringe, either one or both eyes can be ablated to facilitate investigations into the mechanisms regulating eye regeneration, the evolution of visual regeneration, and the neural basis of light-induced behavior.

Ablazione chirurgica Assay per lo studio degli occhi Rigenerazione in Planarie

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

Multi-fotone Time Lapse Imaging per visualizzare lo sviluppo in tempo reale: visualizzazione della migrazione di cellule neurali della cresta negli embrioni di Zebrafish

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A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus improving the overall pregnancy outcome. We recently developed a classification method based on microscopic live observations of mouse oocytes during their in vitro maturation from the germinal vesicle (GV) to the metaphase II stage, followed by the analysis of the cytoplasmic movements occurring during this time-lapse period. Here, we present detailed protocols of this procedure. Oocytes are isolated from fully-grown antral follicles and cultured for 15 h inside a microscope equipped for time-lapse analysis at 37 &#176;C and 5% CO2. Pictures are taken at 8 min intervals. The images are analyzed using the Particle Image Velocimetry (PIV) method that calculates, for each oocyte, the profile of Cytoplasmic Movement Velocities (CMVs) occurring throughout the culture period. Finally, the CMVs of each single oocyte are fed through a mathematical classification tool (Feed-forward Artificial Neural Network, FANN), which predicts the probability of a gamete to be developmentally competent or incompetent with an accuracy of 91.03%. This protocol, set up for the mouse, could now be tested on oocytes of other species, including humans.

Here, we present a protocol for non-invasive assessment of oocyte developmental competence performed during their in vitro maturation from the germinal vesicle to the metaphase II stage. This method combines time-lapse imaging with particle image velocimetry (PIV) and neural network analyses.

Un'identificazione basato su rete neurale di ovociti adulto Mouse inerente allo sviluppo competente o incompetente

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus ...

Confocal Microscope-Based Laser Ablation and Regeneration Assay in Zebrafish Interneuromast Cells

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally replenished in non-mammalian vertebrates such as zebrafish. The zebrafish lateral line system is a useful model for characterizing sensory hair cell regeneration. The lateral line is comprised of hair cell-containing organs called neuromasts, which are linked together by a string of interneuromast cells (INMCs). INMCs act as progenitor cells that give rise to new neuromasts during development. INMCs can repair gaps in the lateral line system created by&#160;cell death. A method is described here for selective INMC ablation using a conventional laser-scanning confocal microscope and transgenic fish that express green fluorescent protein in INMCs. Time-lapse microscopy is then used to monitor INMC regeneration and determine the rate of gap closure. This represents an accessible protocol for cell ablation that does not require specialized equipment, such as a high-powered pulsed ultraviolet laser. The ablation protocol may serve broader interests, as it could be useful for the ablation of additional cell types, employing a tool set that is already available to many users. This technique will further enable the characterization of INMC regeneration under different conditions and from different genetic backgrounds, which will advance the understanding of sensory progenitor cell regeneration.

Laser ablation is a widely applicable technology for studying regeneration in biological systems. The presented protocol describes use of a standard laser-scanning confocal microscope for laser ablation and subsequent time-lapse imaging of regenerating interneuromast cells in the zebrafish lateral line.

Saggio di ablazione e rigenerazione laser a base di microscopio confocale nelle cellule interneuromast zebrafish

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally ...

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to promote biodiversity preservation. In felids, most species are threatened with extinction, and domestic breeds are used as a model to increase the efficiency of protocols for germplasm banking. Among oocyte cryopreservation techniques, vitrification is more and more popular in human and veterinary assisted reproduction. Cryotop vitrification, which was at first developed for human oocytes and embryos, has demonstrated to be well-suited for cat oocytes. This method offers several advantages, such as the feasibility in field conditions and the speed of the procedure, which can be helpful when several samples need to be processed. However, the efficiency is strongly dependent on the operator&#8217;s skills, and intra- and inter-laboratory standardization are needed, as well as personnel training. This protocol describes minimum volume vitrification of immature feline oocytes on a commercial support in a step by step field-friendly protocol, from oocyte collection to warming. Following the protocol, preservation of oocyte integrity and viability at warming (as high as 90%) can be expected, although there is still room for improvement in post-warming maturation and embryonic development outcomes.

This manuscript describes a protocol for the minimum volume vitrification of immature cat oocytes with laboratory-made media on commercial supports. It covers every step from oocyte isolation from ex vivo gonads to vitrification and warming.

Vitrificazione del volume minimo degli ovociti felini immaturi

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that during the reproductive life span only about 1% of the oocytes in an ovary mature and ovulate, several techniques have been developed to increase the exploitation of the ovarian reserve to the growing population of non-ovulatory follicles. Such technologies have allowed interventions of fertility preservation, selection programs in livestock, and conservation of endangered species. However, the vast potential of the ovarian reserve is still largely unexploited. In cows, for instance, some attempts have been made to support in vitro culture of oocytes at specific developmental stages, but efficient and reliable protocols have not yet been developed. Here we describe a culture system that reproduce the physiological conditions of the corresponding follicular stage, defined to develop in vitro growing oocytes collected from bovine early antral follicles to the fully-grown stage, corresponding to the medium antral follicle in vivo. A combination of hormones and a phosphodiesterase 3 inhibitor was used to prevent untimely meiotic resumption and to guide oocyte&#39;s differentiation.

We describe the procedures for isolation of growing oocytes from ovarian follicles at early stages of development, as well as the setup of an in vitro culture system which can support the growth and differentiation up to the fully-grown stage. &#160;

Strategia di coltura in vitro per oociti dal follicolo antralico precoce nel bestiame

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of oocytes and surrounding follicular cells. It is vital to separate both follicular cells and oocytes for various research purposes such as for primary culture of follicular cells, analysis of gene expression, oocyte maturation and in vitro fertilization, etc. The conventional method uses forceps to separate both compartments, which is laborious, time consuming and has high damage to the oocyte. Here, we have established a simple method to separate both compartments using a pulled glass capillary. Under a stereomicroscope, oocytes and follicular cells can be easily separated by pipetting in a pulled fine glass capillary (the diameter depends on the follicle diameter). Compared with the conventional method, this new method has high efficiency in separating both oocytes and follicular cells and has low damage to the oocytes. More importantly, this method can be applied to early-stage follicles including at the pre-vitellogenesis stage. Thus, this simple method can be used to separate follicular cells and oocytes of zebrafish.

Here, we present a simple method for separating follicular cells and oocytes in zebrafish ovarian follicles, which will facilitate investigations of ovarian development in zebrafish.

Separazione delle cellule follicolari e degli ovociti nei follicoli ovarici di Zebrafish

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...

Vitrification of In Vitro Matured Oocytes Collected from Adult and Prepubertal Ovaries in Sheep

In livestock, in vitro embryo production systems can be developed and sustained thanks to the large number of ovaries and oocytes that can be easily obtained from a slaughterhouse. Adult ovaries always bear several antral follicles, while in pre-pubertal donors the maximal numbers of oocytes are available at 4 weeks of age, when ovaries bear peak numbers of antral follicles. Thus, 4 weeks old lambs are considered good donors, even if the developmental competence of prepubertal oocytes is lower compared to their adult counterpart. 
Basic research and commercial applications would be boosted by the possibility of successfully cryopreserving vitrified oocytes obtained from both adult and prepubertal donors. The vitrification of oocyte collected from prepubertal donors would also allow shortening the generation interval and thus increasing the genetic gain in breeding programs. However, the loss of developmental potential after cryopreservation makes mammalian oocytes probably one of the most difficult cell types to cryopreserve. Among the available cryopreservation techniques, vitrification is widely applied to animal and human oocytes. Despite recent advancements in the technique, exposures to high concentrations of cryoprotective agents as well as chilling injury and osmotic stress still induce several structural and molecular alterations and reduce the developmental potential of mammalian oocytes. Here, we describe a protocol for the vitrification of sheep oocytes collected from juvenile and adult donors and matured in vitro prior to cryopreservation. The protocol includes all the procedures from oocyte in vitro maturation to vitrification, warming and post-warming incubation period. Oocytes vitrified at the MII stage can indeed be fertilized following warming, but they need extra time prior to fertilization to restore damage due to cryopreservation procedures and to increase their developmental potential. Thus, post-warming culture conditions and timing are crucial steps for the restoration of oocyte developmental potential, especially when oocyte are collected from juvenile donors.

The protocol aims at providing a standard method for the vitrification of adult and juvenile sheep oocytes. It includes all the steps from the preparation of the in vitro maturation media to the post-warming culture. Oocytes are vitrified at the MII stage using Cryotop to ensure the minimum essential volume.

Vetrificazione degli ovociti maturi in vitro raccolti da ovaie adulte e prepubertali nelle pecore

In livestock, in vitro embryo production systems can be developed and sustained thanks to the large number of ovaries and oocytes that can be easily ...

Spatiotemporal Subcellular Manipulation of the Microtubule Cytoskeleton in the Living Preimplantation Mouse Embryo using Photostatins

The microtubule cytoskeleton forms the framework of a cell and is fundamental for intracellular transport, cell division, and signal transduction. Traditional pharmacological disruption of the ubiquitous microtubule network using, for instance, nocodazole can have devastating consequences for any cell. Reversibly photoswitchable microtubule inhibitors have the potential to overcome the limitations by enabling drug effects to be implemented in a spatiotemporally-controlled manner. One such family of drugs is the azobenzene-based photostatins (PSTs). These compounds are inactive in dark conditions, and upon illumination with UV light, they bind to the colchicine-binding site of &#946;-tubulin and block microtubule polymerization and dynamic turnover. Here, the application of PSTs in the 3-dimensional (3D) live preimplantation mouse embryo is set out to disrupt the microtubule network on a subcellular level. This protocol provides instructions for the experimental setup, as well as light activation and deactivation parameters for PSTs using live-cell confocal microscopy. This ensures reproducibility and enables others to apply this procedure to their research questions. Innovative photoswitches like PSTs may evolve as powerful tools to advance the understanding of the dynamic intracellular microtubule network and to non-invasively manipulate the cytoskeleton in real-time. Furthermore, PSTs may prove useful in other 3D structures such as organoids, blastoids, or embryos of other species.

Typical microtubule inhibitors, used widely in basic and applied research, have far-reaching effects on cells. Recently, photostatins emerged as a class of photoswitchable microtubule inhibitors, capable of instantaneous, reversible, spatiotemporally precise manipulation of microtubules. This step-by-step protocol details the application of photostatins in a 3D live preimplantation mouse embryo.